抗病毒基因MxA在鸡体内的表达

抗病毒基因MxA在鸡体内的表达*何湃1，刘莉2，3**，张焕相1，采克俊2，3，张易祥2，3，董顺利2（1.苏州大学生命科学学院，江苏苏州215006；2.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州313000；3.湖州师范学院细胞工程研究所，浙江湖州313000）摘要：大量提取人抗病毒基因MxA的重组质粒pEGFP-C1-MxA，肌肉多点注射未成年广西土鸡，RT-PCR及免疫组化方法检测MxA基因在鸡体内各组织的分布表达。

采用RT-PCR方法于注射后5d、10d在呼吸道上皮、脾脏、肌肉组织中均可检出MxA基因的转录；采用免疫组化方法检测到GFP和MxA基因均能在肌肉组织中得到表达，且注射5d后的表达量高于注射10d后。

结果表明重组质粒肌肉多点注射可介导MxA在鸡体内多种组织中转录、表达，为进一步探讨MxA的生物学活性以及禽类抗病毒免疫制剂的研发奠定了基础。

关键词：体内表达；MxA基因；肌肉多点注射Expression of Anti-virus Gene MxA in Chicken in Vivo*HE Pai1，LIU Li2，3**，ZHANG Huanxiang1，CAI Kejun2，3，ZHANG Yixiang2，3，DONG Shunli2（1.School of Life Science and Technology，Suzhou University，Suzhou，Jiangsu215006；2.School of Life Sciences，Huzhou Teachers College，Huzhou，Zhejiang313000；3.Cell Engineering Institute，Huzhou Teachers College，Huzhou，Zhejiang313000）Abstract：Recombinant plasmid pEGFP-C1-MxA which contains the human anti-virus gene MxA was firstly large scale extracted and subsequently multi-point injected into the femoral muscle of Guangxi indigenous chicken.After injection，RT-PCR and immunohistochemistry was performed to detect the expression and distribution of MxA gene in different tissues.The transcription of MxA gene could be detected in the tissues of spleen，respiratory tract epithelium and muscle at5and10days after injection by the method of RT-PCR.Immunohistochemistry results also indicated the expression of both report gene GFP and target gene MxA，and the expression level in muscle tissue of5d after injection was relatively higher than that of10d after injection.The results that the transcription and expression of MxA gene mediated by the muscle multi-point injection of recombinant plasmid will establish the foundation for the further understanding bioactivity of the MxA gene and anti-virus immune preparation in avian.Key words：In vivo expression；MxA gene；muscle multi-point injection收稿日期：2007-12-11修回日期：2008-04-15*基金项目：国家自然科学基金项目（30500270），浙江省科技计划重点项目（2005C22052），浙江省自然科学基金项目（Y304194）**通讯作者，E-mail：liuli6655@Mx蛋白由Ⅰ型干扰素诱导并能表达特异的抗病毒活性，目前已证明多数哺乳动物的Mx蛋白具有抗病毒活性［1，2］，其中人的MxA蛋白能够抑制多种DNA及RNA病毒［3，4］，而鸡的Mx蛋白仅在少数几种品系中表达出抗病毒活性，且抗病毒活性受特定位点的氨基酸的影响。

为此我们在构建人抗病毒MxA基因的重组真核表达质粒pEGFP-C1-MxA，并可在鸡细胞中得到表达的研究基础上，大量制备pEGFP-C1-MxA重组质粒DNA，肌肉多点注射广西土鸡，检测外源MxA 基因在鸡体内各组织表达分布规律，为进一步研究开发具有抗病毒活性的MxA生物制剂在禽类病毒性疾病预防与治疗中的应用奠定基础。

1材料和方法1．1重组质粒DNA的大量制备重组质粒pEGFP-C1-MxA［5］转化DH5α，接种于LB固体培养基（含卡那霉素100mg/L）中培养，筛选单菌落，PCR及双酶切鉴定，采用质粒大量提取的改进方法提取重组质粒［6］，真空冷冻浓缩，调整重组质粒浓度至1mg/mL。

1．2试验动物的免疫选择60日龄未成熟广西土鸡，采用肌肉注射法进行免疫。

免疫之前用25%蔗糖溶液（溶于0.1mol/L PBS中，pH7.3）在腿部内侧肌肉多点注射，每侧注射500μL，30min后，在蔗糖溶液注射的相应部位注射200μL重组质粒DNA。

PBS注射作为阴性对照。

1．3重组质粒体内表达的检测1．3．1总RNA的提取分别于注射后5d和10d，将鸡处死后立即取呼吸道上皮、肌肉、脾脏少量组织，按Trizol试剂盒说明提取各组织总RNA。

1．3．2RT-PCR检测以各组织中提取的RNA为模板，用RT-PCR 试剂盒对重组质粒中GFP和MxA基因在免疫鸡呼吸道上皮、肌肉、脾脏中转录产物进行检测。

设计鉴定引物分别为MxA-上游：ACGAAAAT-GAAAAAATGTTC，MxA-下游：TCCAAAATTG AAGACATTAG，扩增序列长度为462bp，GFP-上游：GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-GAG，GFP-下游：CCGCTCGAGGATTATGGTT ATCTAG，扩增序列长度为812bp。

试验反应体系：RNase Free dH2O15μL，1 0×RT Buffer5μL，25mM的MgCl210μL，上游和下游引物各1μL，10mM dNTP混合物5μL，RNase抑制剂1μL，模板RNA10μL，AMV逆转录酶和Taq酶各1μL，总体积50μL。

反应条件：①逆转录45℃50min，94℃10min共1循环；②PCR扩增94℃变性5min，94℃30S，57℃30S，72℃40S共30循环，最后72℃延伸10min，1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1．3．3免疫组织化学检测重组质粒在体内表达样本采集及组织石蜡切片制作：注射5d和10d后分别处死免疫鸡，取腿部注射部位肌肉，大小为2.0cm×0.5cm×0.5cm，放入10%中性福尔马林中固定72h后制成石蜡切片。

免疫组织化学检测重组质粒中外源基因的表达：对注射5d和10d后的肌肉石蜡切片样品分别选用GFP单抗及MxA多抗作为一抗进行检测，同时设两组不同的阴性对照，一组为PBS注射的鸡肌肉组织，免疫组化检测时采用与实验组相同的处理步骤，另一组为重组质粒注射后鸡肌肉组织，免疫组化检测时不加一抗作为阴性对照。

2结果与分析2．1重组质粒DNA提取及其体外表达检测用改进的亚精胺试剂法大量制备质粒DNA （见图1），并用真空冷冻干燥机浓缩重组质粒，调至浓度为1mg/mL，为进一步确认质粒是否具备细胞转染能力，我们用鸡成纤维细胞进行预转染实验，荧光倒置显微镜观察转染效率及其在细胞中表达情况，结果显示转染48h后观测到绿色荧光，由于MxA蛋白在细胞中表达常积聚于细胞质中，成纤维状复合物并沉积于细胞核周围，所以观察到重组质粒转染CEF后表达的绿色荧光呈颗粒状分布于胞浆（见图2）。

证明制备的重组质粒DNA能较好地应用于细胞转染，同时也间接表明GFP和MxA是以融合基因的形式在细胞中表达。

2．2报告基因GFP和目的基因MxA转录产物的检测重组质粒注射5d后和10d后的鸡的呼吸道上皮、肌肉、脾脏经RT-PCR扩增后均可见分子量大小为462bp和812bp的特异性条带，与GFP 基因和插入的外源MxA基因大小一致，阴性对照未见条带（见图3、4），由此表明以CMV 作为启动子构建的质粒pEGFP-C1-MxA 表达载体能被肌肉系统摄取并有效转录，可经过肌肉系统向全身各组织扩散并再成功转录。

2．3报告基因GFP 和目的基因MxA 表达产物的检测质粒注射后5d 、10d 后肌肉组织切片经免疫组织化学检测染色，一抗使用GFP 单抗和MxA 多抗均观察到棕褐色的阳性显色，且注射后5d 显色略深于第10天，以此推测注射目的基因的表达略强于第10天。

在注射后第5天，PBS 注射的空白对照组以及未加一抗的阴性对照组的免疫组化结果均未显示出类似的棕黄色。

由此表明真核表达质粒pEGFP-C1-MxA 能被肌肉系统有效摄取并介导目的基因MxA 在肌肉中表达（见图5、6）。

bpM1231309461655743612322M.λ-Hind Ⅲdigest DNA Marker ；1.大量抽提的重组质粒DNA图1重组质粒DNA 的大量制备琼脂糖凝胶电泳图2荧光显微镜下观察重组质粒DNA 转染鸡CEF （200×）bp M 123456800400bp M 123456800400M.100bp Ladder Marker ；1.质粒注射的鸡肌肉组织；2.PBS 注射的鸡肌肉组织；3.质粒注射的鸡呼吸道上皮；4.PBS 注射的鸡呼吸道上皮；5.质粒注射的鸡脾脏；6.PBS 注射的鸡脾脏M.100bp Ladder Marker ；1.PBS 注射的鸡肌肉组织；2.质粒注射的肌肉组织；3.PBS 注射的鸡呼吸道上皮；4.质粒注射的鸡呼吸道上皮；5.PBS 注射的鸡脾脏；6.质粒注射的鸡脾脏图3重组质粒注射后5d 鸡各组织RT-PCR 结果图4重组质粒注射后10d 鸡各组织RT-PCR 结果A.质粒注射后5d 鸡肌肉组织；B.质粒注射后5d 鸡肌肉组织（未加一抗）；C.质粒注射后10d 鸡肌肉组织；D.质粒注射后10d 鸡肌肉组织（未加一抗）；E.未注射重组质粒鸡肌肉组织；F.未注射重组质粒鸡肌肉组织（未加一抗）图5重组质粒注射后鸡肌肉组织免疫组织化学检测GFP 表达A.质粒注射后5d 鸡肌肉组织；B.质粒注射后5d 鸡肌肉组织（未加一抗）；C.质粒注射后10d 鸡肌肉组织；D.质粒注射后10d 鸡肌肉组织（未加一抗）；E.未注射重组质粒鸡肌肉组织；F.未注射重组质粒鸡肌肉组织（未加一抗）图6重组质粒注射后鸡肌肉组织免疫组织化学检测MxA 表达AC3讨论在大量提取质粒DNA的过程中使用了亚精胺试剂，所提取的质粒DNA其内毒素水平为0.3+/-0.01（EU）/mg，远远低于体内实验所要求的小于3EU/mg［6］，用该质粒免疫小鼠后同样可诱导产生特异性的CD8+T细胞反应，相比昂贵的柱纯化法，亚精胺试剂的使用大大节省了实验经费，同时重组质粒在鸡体内的表达也未受到任何影响。