微生物工程复习指南

微生物工程

第一章绪论

名词解释:

初级代谢产物：是与菌体生长相伴随的产物，主要是构成细胞高分子物质（蛋白质、核酸、多糖、脂类、维生素）的单体物质，如氨基酸、核苷酸、有机酸、脂肪酸等，一般不能过量积累，涉及合成代谢和分解代谢

次级代谢产物：以初级代谢产物或中心代谢物为原料进行合成，与生长不相伴随，在菌体生长的稳定期合成，具有特定的功能，抗生素、生物毒素、胞外多糖

微生物转化：利用微生物细胞的一种或多种酶把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物的生化反应.

与初级代谢和次级代谢的不同

与酶工程的不同

微生物转化合成甾类激素，如可的松药物、抗生素的微生物转化

简述：微生物工程发展的四个阶段及其标志性事件，每一时期生产的主要产品答: 1.自然发酵时期：传统发酵技术（酿酒，酱油，醋，面包，酸奶，奶酪等）

2.纯培养技术的建立：标志性的科学事件:虎克(A. Van Leeuwenhoek)发明显微镜（1680），巴斯德(L. Pasteur)发现发酵是由微生物引起的（1857），科赫(R. Koch)建立了固体培养基对微生物分离纯化的技术（1882)

主要生产厌氧发酵产品:甘油,乳酸,丙酮丁醇,和表面固体发酵生产少量的好氧产品：酵母菌体,柠檬酸

3.深层培养技术的建立：以青霉素的液体深层需氧发酵技术的建立为标志(1943）,大规模发酵生产需氧发酵产品:维生素,抗生素,酶制剂,柠檬酸,甾类转化

4.人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立，以60年代氨基酸、核苷酸微生物工业的建立为标志。用于氨基酸、核苷酸、有机酸和部分抗生素的生产

5.基因工程技术的建立（1973）及自动化控制技术的应用

第二章工业微生物技术

1、菌种衰退与复壮,自然选育,诱变育种

菌种衰退与复壮

衰退: 生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称为衰退

1.引起菌种衰退的原因

(1)菌种遗传特性的改变：异核现象导致微生物菌种变异，自发突变导致菌种遗传特性改变，突变所产生菌种的回复突变以及杂交重组体产生分离子。

预防措施：减少传代次数，采用合适的菌种保藏方法

(2)菌种生理状况的改变：

菌种的培养条件可以对菌种的生理状况产生影响，培养条件不当，可以引起菌种衰退

2.防止菌种衰退的方法

尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；尽量减少转代次数；采用幼龄菌种。

复壮：

菌种的复壮：将衰退的菌株恢复原有的生产性能．

复壮方法：纯种分离法、淘汰已衰退的个体、选择合适的培养条件

自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程

诱变育种：利用物理、化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进突变率大幅度提高，利用简便、快速、高效的方法筛选目的突变株

1出发菌株的选择:有一定生产能力、生长快、产孢子多、营养要求低

2诱变剂的使用方法：单独使用（对野生菌种效果较好）与联合应用（包括同一诱变剂多次处理，两种或以上诱变剂同时或多次处理效果较好eg.青霉素。氮芥，UV）

3诱变剂量的选择：用致死率作为诱变剂量的的选择依据。一般，诱变率随诱变剂量的提高而提高，达到一定程度后再提高反而使诱变率下降，近年一般采用低剂量诱变。有时也使用高剂量，因其可引起巨大的损伤，形成稳定突变。

4诱变菌株的筛选：初筛→复筛→发酵条件优化以确定最佳发酵条件

2、主要发酵产品的生产菌种（柠檬酸，酒精，乳酸，谷氨酸，青霉素，丙酮和丁醇，淀粉酶，蛋白酶）

答：柠檬酸：黑曲霉（Aspergillus niger）解脂假丝酵母（Candida lipoly）等。酒精：ED途径的菌种：运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）嗜糖假单胞菌(Pseudomenas Sanccharophila)；酵母

乳酸：同型乳酸发酵：德氏乳杆菌（Lactobacillus delorückii）乳酸链球菌（Streptococcus lactis）

异型乳酸发酵：肠膜状明串珠菌、短乳杆菌

谷氨酸：谷氨酸棒状杆菌

青霉素：金黄色葡萄球菌985菌株青霉菌

丙酮和丁醇：羧状芽孢杆菌

淀粉酶：枯草芽孢菌？

蛋白酶：枯草芽孢菌

3、常用育种方法及其特点，常用诱变剂及其育种原理

：

在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。

②互变异构效应(自然突变) ：四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。

特点：简单、效率低，常与诱变育种交替使用以提高育种效率。

流程：常规的筛选流程：将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌株。

应用:常用作菌种的复壮,以保持菌种的生产性能

诱变育种：诱变育种一般步骤：出发菌株→纯化→细胞或孢子悬液的制备→致死曲线测定→活细胞计数→中间培养→突变株分离→初筛→复筛→生产测试→菌种保藏

原理：基因突变（染色体畸变、点突变、碱基转换(transition)、碱基颠换(transversion) 、移码突变）

特点：方法简单、快速、效果显著，是主要的育种方法之一

常用诱变剂及其诱变原理

杂交育种：人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核生物的接合、F 因子的转导、转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得优良的生产菌株。

步骤：异核体的形成，双倍体的检出，单倍体的检出

原生质体融合技术：利用人工方法（PEG融合或电击），使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子（杂合双倍体或单倍重组子）的过程，重组子可能同时具有两个亲本的优点

融合子的检出方法：营养缺陷型标记、抗药性标记、双亲灭活、利用双亲对碳源利用不同、利用荧光染色法筛选融合子、生化指标

分子育种：（1）代谢调控育种：代谢途径中关键酶的过量表达（插入新基因或增加基因拷贝）、失活（基因敲除、插入失活、点突变）、RNA干扰（RNA i）。基因敲除方法：

（2）转基因微生物：大肠杆菌酿酒酵母毕赤酵母

优点：重组频率大（10-1）、亲本选择范围大

常用诱变剂：

物理诱变剂：紫外线、X射线、γ射线、激光、快中子

化学诱变剂：丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄、原黄素等）和一系列ICR类的化合物

a.与核酸碱基直接作用的诱变剂：烷化剂（EMS、NTG、NMU、EDS、氮芥）、亚硝酸、羟胺

b.碱基类似物：5-BU、5-FU、8-NG、2-AP

c.移码突变诱变剂：

生物诱变剂：噬菌体，转座子

各诱变剂既可单独使用,也可联合使用

4、引起菌种衰退的原因，如何防治？

答：1.引起菌种衰退的原因

(1)菌种遗传特性的改变：异核现象导致微生物菌种变异，自发突变导致菌种遗传特性改变，突变所产生菌种的回复突变以及杂交重组体产生分离子。

预防措施：减少传代次数，采用合适的菌种保藏方法

(2)菌种生理状况的改变：

菌种的培养条件可以对菌种的生理状况产生影响，培养条件不当，可以引起菌种衰退

2.防止菌种衰退的方法

A、尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；

B、尽量减少转代次数；

C、采用幼龄菌种

5、微生物菌种保藏的原理，常见菌种保藏方法要点及其特点（斜面、穿刺、沙土管、真空冷冻干燥、液氮、低温）

答：原理：人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态，减少菌种变异，达到长期保存的目的。

保藏菌种状态：孢子，芽孢．培养时间、培养温度、培养基成分

保藏条件：低温，干燥、隔绝空气、缺乏营养物质

常见菌种的保藏方法及其特点（P：77-80）要点是过程？

6、同型乳酸发酵及异型乳酸发酵比较（菌种、产物、生化途径？）

答：