微生物工程实验内容(完整)
环境工程微生物学大实验实验报告
环境工程微生物学大实验实验报告实验十二环境中四环素抗性细菌的分离鉴定组员：吴富华，张真，，金炯震环5205一、实验目的1、自行设计实验方案从环境中分离四环素抗性菌的实验方法。
2、分离获得四环素抗行菌。
3、检测并分析获得的菌株的四环素抗性强弱。
4、学会通过16SrDNA鉴定实验获得的菌株的种属。
二、实验要求1、自行设计实验证明富集培养是否成功。
2、观察并记录实验现象，作适当的分析或解释。
3、获得至少一株四环素抗性菌（不要多于三株），并进行短期保存。
4、根据实验视频指导和说明，完成菌株基因组DNA纯化，16SrDNA的PCR扩增。
5、比较各组筛选出的抗性菌抗性强弱。
6、各组间交流实验过程和实验结果，分析抗性菌抗性的影响因素。
7、养成良好的实验习惯和团队合作的作风，并给出评价。
三、实验器材1、培养基（营养琼脂，琼脂粉，酵母膏，胰蛋白胨，氯化钠），提供四环素，琼脂糖，灭菌条件。
2、室温和37℃恒温培养箱和摇床。
3、离心机，漩涡震荡仪，PCR仪，电泳仪，紫外成像分析仪。
四、实验步骤（略）1、配置富集培养基和四环素梯度培养基2、四环素抗性菌富集培养3、单菌株筛选4、四环素抗性强弱比较5、单菌株基因组DNA的提取6、16SrDNA的PCR扩增7、PCR产物电泳实验内容、具体操作单菌株基因组DNA提取（5.17进行步骤1-4；5.18进行步骤5-10；5.20进行步骤11）（1）选择5.8号挑选的菌株进行DNA提取实验；（2）取200μL菌液转移到1.5mL灭过菌的EP管中，10000rpm常温离心1min，去掉上清（得到菌细胞）。
菌细胞可在-20℃冻存。
（3）如果是革兰氏阳性菌，取100μL，1mg/mL的溶菌酶/TE加到菌液中，漩涡震荡混匀，37℃温浴1h（溶菌步骤）。
（4）用取液器（移液枪）缓慢吸加500μL（革兰氏阳性）或600μL（革兰氏阴性）裂解缓冲液和20μL，20mg/mL蛋白酶K（proteinase K），充分混匀，50℃过夜（完全裂解细菌并降解所有蛋白质）。
微生物实验报告范文
微生物实验报告范文一、实验目的1.了解微生物在日常生活中的广泛应用；2.探究微生物的生长特性和繁殖能力；3.学习一种简单的微生物染色技术；4.观察并研究微生物生态系统。
二、实验原理本实验采用常见的革兰氏染色法，革兰氏染色是细菌分离鉴定的重要方法之一、此方法能将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类，从而对细菌种类和数量进行初步分析。
三、实验器材和药品器材：培养基、恒温箱、显微镜、移液器、架子、微观移液棒、塑料杯、锡纸；药品：蓝尼罗红、革兰氏染色药液（碘液、乙醇、碱性溶液、脱脂牛奶）。
四、实验步骤1.选取培养基，将固体培养基倒入塑料杯中；2.加入足够的蓝尼罗红；3.使用移液器将所需的微生物液滴于培养基上；4.用移液器挖取适量的微生物液，均匀滴到培养基上并轻轻摇晃使其均匀分布；5.将杯子放入恒温箱中，以适合微生物生长的温度进行培养；6.观察培养基上的微生物生长情况，进行观察和记录；7.观察菌落特征，进行革兰氏染色。
五、实验结果和讨论通过实验观察，我们发现微生物在培养基上生长迅速。
菌落在培养基上形成并逐渐扩大，最终形成肉眼可见的结构。
通过革兰氏染色，我们能辨别出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色能够将革兰氏阳性菌染色为紫色，而革兰氏阴性菌则被染色为红色。
通过观察染色后的微生物，我们可以从中获得有关细菌种类和数量的信息。
在实验中还观察了微生物的生态系统。
我们发现不同微生物在培养基上的生长速率和菌落形状各异，这可能是由于不同的细菌种类或菌株之间的差异造成的。
六、实验结论通过本次实验，我们了解了微生物在日常生活中的广泛应用，增加了对微生物的认识。
革兰氏染色技术的运用使我们能够进一步了解细菌的种类和数量。
同时，我们还观察并研究了微生物生态系统，发现微生物的生长速率和形态特征有一定差异。
七、实验中的注意事项1.在进行微生物培养实验时，要保持操作环境的清洁，避免细菌污染；2.实验过程中需要严格控制温度；3.在染色过程中，应注意使用染色药液的顺序和浓度。
环境工程微生物学实验
实验器材
（1）活材料：培养18h的大肠杆菌（E. coli）培养液。 （2）培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基14支 (每支10ml)，浓缩5倍的牛肉膏蛋白胨培养基。无菌 酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。 （3）器材：1ml无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、 标签等。
实验方法
1、接种：按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2 ml 的大肠杆菌培养液。 2、培养：将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下 振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1.5、3、5、 7、9、12、24和36h后取出，放冰箱中贮存，待测定。 3、比浊：以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基调零 点，在光电比色计上，选用520～560nm波长进行比浊， 从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。
实验步骤
1．将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45℃左右倒入无 菌培养皿内(每皿约10～
15毫升)，共倒3个，静置待冷凝即成平板。
2．在无菌操作条件下，用接种环分别挑取大肠杆菌和活性污泥 各一环分别在4个平板上各点种4个点。倒置于37℃恒温箱内培 养24～48h。
3．观察结果，取出平板，分别在2个平板内菌落周围滴加碘液， 观察菌落周围颜色的变化。若在菌落周围有一个无色的透明圈， 说明该细菌产生淀粉酶并扩散到基质中去。若菌落周围仍为蓝 色，说明该细菌不产生淀粉酶。
实验器材
1．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 2．仪器：电炉、恒温水浴锅．恒温培养箱．放大 镜。 3．试剂：硫代硫酸钠溶液。 4．其他用品：无菌采样瓶，9ml无菌水试管，无菌 培养皿(直径9cm)，无菌移液管等。
实验步骤
1．水样采取 2．细菌总数测定 (1) 水样稀释：根据水样受有机物或粪便污染的程度，可用无
3．高倍镜观察
(完整版)微生物工程重点
第一章微生物工程的组成部分：（1）上游工程（2）生物反应过程（3）下游工程微生物工业产品类型：（1）代谢产物初级代谢产物、次级代谢产物、基因工程外源蛋白（2）菌体活性微生物、富含有用物质的微生物（3）酶制剂α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等（4）转化产品甾体激素、抗生素、前列腺素（5）机能利用净化环境、生态平衡、探矿、采矿等发酵工业概念：发酵工业是传统发酵技术和现代DNA重组、细胞融合等新技术相结合并发展起来的现代生物技术，并通过现代化学工程技术，生产有用物质或直接用于工业化生产的一种大工业体系。
次级代谢：是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。
次级代谢产物：通过次级代谢合成的产物，是微生物在生长的稳定期合成具有特定功能的代谢产物，与菌体的生长繁殖无明确关系，它们的生物合成具有特异性。
如抗生素，植物碱等。
微生物工程的特点是什么？发展趋势如何？特点：（1）原料广，价格低（2）微生物种类多，分布广，具有可变异性（3）反应条件温和（4）发酵途径多样化，产品多样化（5）生长繁殖速度快，生产周期短（6）需要控制生产环境，避免杂菌污染发展趋势：微生物工程结合了基因工程、酶工程、细胞工程技术，现代生物技术的快速发展给微生物工程提供了巨大的发展空间。
如： 1、菌种技术：菌种的筛选（极端微生物、转基因菌种)2、发酵技术：发酵培养基制备技术、发酵路线的优化和控制3、微生物工程下游分离、纯化技术。
第二章简要分析工业微生物菌种的基本要求？（1）具备高产目的代谢产物的能力（2）生长繁殖力强，较高的生长速率，发酵周期短（3）能利用低价格、来源广的农副产品原料，发酵成本低（4）培养条件要求不高，培养条件易于控制（5）无副产品或少副产品（6）有稳定的遗产性状，不易变异和退化。
以保证产品的稳定性（7）非病源微生物。
第三章工业微生物的代谢调节和代谢工程微生物的代谢：代谢是细胞内所有的生物化学过程的总称，包括物质代谢和能量代谢两个方面。
环境工程微生物学实验报告6
实验目的：
1.熟悉玻璃器皿的洗涤及灭菌前的准备工作；
2.了解配制微生物培养基的基本原理，掌握配制、分装培养基的方法。本实验通过常用培养基的配制，使学生了解常规的配制培养基的方法。
3.学会各类物品的包装、配制和灭菌。
基本原理：
培养基是钾、钙、钠、镁、铁、等微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。调整适合的ph，经高温灭菌后以备培养微生物之用。
由于微生物的种类及代谢类型的多样性，因而培养基放入种类也多，他们的配方及配制法也有所差异，但一般的配置过程大致相同。
实验器皿和材料：
高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、药物天平、玻棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、PH
试纸和棉花、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂。
实验内容:
一.玻璃器皿的准备
1.玻璃器皿的洗涤
2.玻璃器皿的包装
1移液管的包装；
2培养皿的包装；
3棉塞的制作。
二.培养基的配制
1.按照配方要求配制溶液；
2.根据微生物的生长需求调节PH；
3.过滤杂质；
4.将锥形瓶和试管进行分装加棉塞，包装后灭菌；
5.斜面的制作。
三.稀释水的配备
1.锥形瓶稀释水的配备
2.试管稀释水的配备
四.灭菌
1.干热灭菌法
2.加压蒸汽灭菌法
注意事项：
1.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气要尽可能排除完；
2.易燃易爆物品（如：硝化甘油、硝化纤维、黄磷、红磷、乙醚、汽油及可燃性气体等）不能用高压灭菌法灭菌；
3.当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细擦干锅盖垫圈上的水滴。否则它们会带来腐蚀和变质。要检查压力表上的指数为“0Mpa”后才能打开锅盖。
微生物工程实验(陈必链,王明兹主编)PPT模板
实验27紫球 藻细胞的培
养
实验25液体 发酵法生产
庆大霉素
实验26单细 胞蛋白的生
产
实验22细菌 脂肪酶发酵
实验23基因 工程菌的发
酵培养
实验24液体 发酵法生产
L-色氨酸
第4部分微生物工程产品实验
实验28黄原胶的发酵、提取和测 定 实验29动物细胞的传代培养和生 长曲线的绘制（MTT比色法） 实验30动物细胞的形态观察和计 数 实验31动物细胞的冻存和复苏
06
参考文献
参考文献
07
附录Ⅰ盐酸标准溶液[C（HCL） =1MOL/L]
附录Ⅰ盐酸标准溶液[c（HCl） =1mol/L]
08
附录Ⅱ兰-埃农法菲林试剂糖量表 （兰-埃农法）
附录Ⅱ兰-埃农法菲林试剂糖量表（兰-埃农法）
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感谢聆听
01
前言
前言
02
第1部分微生物工程常用理化分析
程第
常 用 理 化 分 析
部 分 微 生 物 工
1
01
实验1含水 量的测定
04
实验4脂肪 测定
02
实验2蛋白 质含量的测
定
05
实验5灰分 测定
03ห้องสมุดไป่ตู้
实验3碳水 化合物含量
的测定
06
实验6生化 指标糖、氮 的分析测定
第1部分微生物工 程常用理化分析
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202X
微生物工程实验(陈必链，王明兹主 编)
演讲人 202X-11-11
目录
1
前言
2
第1部分微生物工程常用理化分析
3
第2部分微生物工程菌株分离、选育
及保藏
发酵工程实验报告
发酵工程实验报告年级专业姓名学号实验题目微生物工程实验（一组）一、实验目的1.熟练掌握无菌操作技术，了解生物发酵过程中种子的扩培过程；2.掌握小型发酵罐管路消毒、空消、实消、菌种培养等技术；3.学习掌握小型发酵罐接种、取样操作系统；4.学习使用糖度仪，掌握血球计数板法；5.掌握两种生长曲线的测定方法：干重法和血球计数板法，绘制生物基质的相关曲线。
二、实验原理发酵罐，是进行液体发酵的专用设备。
发酵罐配备控制系统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、pH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。
为了解发酵过程中菌体的生长及对培养基的利用情况，需在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行计数、测定不同时期的干重以及糖度的变化。
干重，是指细胞除去全部自由水后的重量，为80℃下烘干一定时间后的恒重，即失水后的质量。
可用离心或过滤法测定。
一般干重为湿重的10-20%。
在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。
干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。
血球计数板法，血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm面积上刻有400个小方格。
通过显微镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。
微生物生长曲线，是以微生物数量(活细菌个数或细菌重量)为纵坐标，培养时间为横坐标画得的曲线。
一般说，微生物(细菌)重量的变化比个数的变化更能在本质上反应出生长的过程。
曲线可分为三个阶段即生长率上升阶段(对数生长阶段)、生长率下降阶段及内源呼吸阶段。
三、实验材料及器材1.菌种酵母菌（saccharomyces）2.药品蛋白胨、葡萄糖NH4Cl、酵母浸粉、蒸馏水、种子液、无菌蒸馏水、泡敌3.培养基种子培养基发酵培养基4.仪器设备摇床1台；超净工作台6台；电炉2个；在位机械搅拌式发酵罐4台；三角烧瓶；小试管；酒精棉球若干；工业用酒精一瓶；离心机1台；振荡器6台；烘箱1台；显微镜3台玻璃棒12个；50ml量筒6个；500ml量筒6个；100ml烧杯6个；500ml烧杯6个；250ml三角烧瓶2个；500ml三角烧瓶 6个；接种环6个；酒精灯6个；棉线、纱布、报纸若干；天平6个；蒸馏水瓶6个；擦镜纸若干；滤纸若干；离心管若干；血球计数板 6个；试管架12；棉线手套4双等四、实验步骤(一)菌种的扩培1.菌种的活化（已准备）（1）将酵母菌接种于种子培养液中，摇瓶培养，180rpm，28℃，48h 。
微生物工程实验报告(葡萄酒的酿造)
微生物工程实验报告红葡萄酒与白葡萄酒的酿制专业：班级：学号：姓名：一、实验目的二、实验材料三、实验步骤四、实验注意事项：五、实验过程与分析描述与分析：瓶内有少量气泡产生；液面稍稍上升。
超过锥形瓶的2/3。
图片（红葡萄酒）图片（白葡萄酒）描述与分析：瓶内有大量CO2气体产生，有大量气泡破裂的声音产生。
葡萄汁与捏碎的葡萄产生分层。
描述与分析：瓶内有大量CO2气体产生，并且伴随有大量气泡破裂的声音。
葡萄汁与捏碎的葡萄分层，且葡萄汁聚集在瓶底，被捏碎的葡萄残体上升至瓶口。
实验现象图片（白葡萄酒）描述与分析：瓶内CO2气体产生量减少，气泡破裂的声音减弱。
葡萄汁聚集在瓶底，葡萄残体被产生的CO2气体顶置瓶口。
瓶口处的葡萄有轻微腐败现象。
瓶底有白色沉淀产生。
描述与分析：瓶内CO2气体产生大量减少，基本没有气泡破裂的声音出现。
葡萄汁聚集在瓶葡萄残体被产生的CO2气体顶置瓶口。
瓶口处的葡萄有腐败现象。
瓶底有白色沉淀增多。
实验现象图片（白葡萄酒）描述与分析：葡萄汁聚集在瓶底，气体顶置瓶口。
瓶口处的葡萄残体腐败现象加剧。
瓶底有白色沉淀层变厚。
葡萄籽都沉在瓶底。
描述与分析：瓶底分层的液体上升，上层的葡萄残体下降沉入底层的葡萄汁中，并伴随有少量气体产生。
葡萄籽聚集在瓶底的白色沉淀中。
（二）葡萄酒后发酵实验图片（白葡萄酒）描述与分析：酒体逐渐澄清，但是白葡萄酒酒体有些微红（可能是由于氧化作用）程中有酒味和果香味飘散。
六、实验结果与讨论（一）自评（二）组评（三）最终评价。
环境工程微生物学实验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别穿刺接种大肠杆菌和变形杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h 3、柠檬酸盐利用试验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别划线接种大肠杆菌和枯草杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h
四、实验结果观察与记录
1、将实验结果填入下表，＋表示阳性，－表示阴性。 2、思考题：微生物生理生化反应的意义何在？
三操作步骤1微生物大小的测量1枯草杆菌标本片的制作2目镜测微尺的标定放置镜台测微尺放置目镜测微尺校正目镜测微尺计算不同放大倍数下目镜测微尺每格代表的长度3枯草杆菌大小的测量四实验报告1将目镜测微尺校正结果填入下表接物镜接物镜倍数目镜测微尺目镜测微尺每格代表的长度2在高倍镜下测量枯草杆菌大小的实验结果填入下表菌体编号长度的目镜测微尺格数宽度的目镜测微尺格数平均值菌体大小平均值m3分析实验结果一实验目的明确显微镜计数的原理
酵母菌的形态构造
线 粒 体 芽体液泡 芽 体 核 液 泡 膜 细 胞 壁 细 胞 膜
根霉（Rhizopus)
青霉（Penicillum):
曲霉(Aspergillus)
四、实验报告
1. 分析实验结果，绘制酵母菌、青霉、黑曲霉的形
态图，并注明各部位名称，。 2. 怎样才能观察到较为完整的霉菌形态，各种霉菌 制片过程中分别有哪些注意事项？
121℃,灭菌20~30min
使用时, 将培养基加热融化, 待温度降至50 ℃左右时在 100mL培养基中加入1%链霉素0.3mL
糖发酵培养基：
蛋白胨2g，葡萄糖10g， K2HPO4 0.2g, NaCl 5g, 琼脂5～6g， pH7.0～7.2 ，蒸馏水1L ， 1%溴百里酚蓝 3ml. 分装试管，每管4～5cm， 112℃,灭菌30min.
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法, 掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法, 掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组, 每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品: 酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3.MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备: 高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料: 天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1. 培养基的配制方法和步骤1)称量: 按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化: 在烧杯中加入所需水量, 玻棒搅匀, 加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH, 用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌, 可适当补水。
5)分装: 注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆: 用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌: 在高压锅中, 115 °C 高温灭菌30min。
2. 培养基的配制A.富集培养基（液体）:海水2216E 液体培养基（g/L）: 蛋白胨5.0, 酵母粉1.0, 海水1L, pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后, 8 层纱布封口, 外包1层牛皮纸, 121℃, 高温灭菌20min。
B.2216.斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉, 加热溶化琼脂, 每支试管内。
加入3mL, 121℃高温灭菌20min, 灭菌后摆斜面。
C.无菌生理盐水和保种液:生理盐水: NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL, 盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液: 生理盐水, 加25%甘油D.碳源优化培养基:以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%, 酵母粉0.1%, 磷酸铁0.01%, 人工海水, pH7.6）为基础, 碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖, 每种碳源的添加量为1%。
环境工程微生物实验指导书-图文
环境工程微生物实验指导书-图文实验一光学显微镜的操作及细菌形态观察1.1实验目的(1)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。
(2)观察几种典型细菌的形态与构造，学会绘制微生物图。
1.2实验器材显微镜、二甲苯、香柏油、载玻片、盖玻片、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、球衣菌、假单胞菌、固氮菌标本片。
1.3显微镜的结构及其操作方法1.3.1普通光学显微镜(LightMicrocope)1.3.1.1光学显微镜的结构和各部件作用观察、检验微生物通常用光学生物显微镜（见图1-1），显微镜分机械装置和光学系统两部分。
一机械装置(1)镜筒：镜筒长度一般是160cm。
它的上端装目镜，下端装物镜回转板。
回转板上一般有三个物镜。
(2)转换器：位于镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个孔或5个孔。
不同规格的物镜分别安装在各孔上。
(3)载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。
两旁有弹簧夹，用以固定标本或载破片。
有的载物台上装有自动推物器。
(4)调节器：镜筒旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节物镜与被观察物体之间的距离。
二光学光学系统（1）目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上刻有“5某”、“10某”、“15某”(或“16某”)等数字及符号，意即放大5倍、10倍、15倍(16倍)。
这三种透镜的焦距分别为50mm、25nn、16mm，线视场分别为20mm、14mm、10mm。
（2）物镜：物镜装在回转板上，可分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种。
相应的放大倍数是10某（5某）、40某（50某）、100某（90某），相应的工作距离是7.63mm、0.5mm、0.198mm，物镜上常标注数值孔径（N.A）。
使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体观察，不进行染色。
在观察原生动物时，低倍镜主要用来观察全部原生动物的种类和观察它的活动状态，而高倍镜则可以看清楚微生物的结构特征。
微生物工程实验指导
实验一微生物学实验基本技能训练一、目的要求1．学习配制基本培养基。
2．了解并学习高压蒸汽灭菌的基本原理及操作。
3.学习无菌操作技能二一、器皿的准备在配制培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净，进行包装、灭菌后，才能使用。
1. 玻璃器皿的清洗（1）新玻璃器皿新玻璃器皿含有游离碱，一般先将其浸于2% 的盐酸溶液中数小时，然后用自来水清洗干净。
也可将器皿先用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗刷、自来水清洗，待干燥后，灭菌备用。
（2）用过的玻璃器皿①试管或三角瓶的洗刷：盛有废弃物的试管或三角瓶，因其内含大量微生物，洗刷前应先经过高压蒸汽灭菌。
对只带有细菌标本或培养物的试管等玻璃器皿，用过后应立即将其浸于2% 的来苏尔消毒水中，经24h后，才可以取出洗刷。
用蜡封口的试管或石油发酵用瓶，清洗前先将其置于高压蒸汽灭菌器中消毒，然后取出，趁热拔去沾有蜡或油的棉花塞，立即倒去培养污物，再将试管投入温水中，稍加洗刷后浸于5% 的肥皂水内，煮沸5min，以去除试管上的油污。
也可将倒空的瓶子用汽油浸泡，待油溶解后再刷洗。
加过消泡剂的发酵瓶或做过通气培养的大三角瓶，一般先将倒空的瓶子用碱粉或用10% 的火碱水去掉油污后，再行洗刷。
管壁或瓶壁上留有培养物的痕迹，用试管刷难以去除，此时可用一根粗铁丝把顶端弯曲，捆几层纱布，浸湿，沾一点去污粉，或再沾少许细沙，擦磨管壁或瓶壁，就可把器壁的痕迹擦掉。
②培养皿的清洗：用过的器皿中往往有废弃的培养基，需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸30min 后，倒掉污物，方可清洗。
如果灭菌条件不便，可将皿中培养基刮出来，倒在一起，以便统一处理。
洗刷时，先用热水洗一遍，再用洗衣粉或去污粉擦洗，然后用自来水冲洗干净，将平皿全部向下，一个压着一个，扣于洗涤架上或桌子上。
③吸管的清洗：吸过菌液的吸管，用完后应放入装有5% 石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的吸管，用后放入清水中，防止干燥；吸过带油液体的吸管，应先在10% 的氢氧化钠溶液中浸泡半小时，去掉油污，方可清洗。
微生物工程试验
实验一淀粉酶生产菌的筛选一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。
二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。
淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
三、实验用品1.样品淀粉含量丰富的土样。
2.培养基肉汤培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCl 5g,加水至1000ml, pH7.0。
121 ℃ 灭菌20min。
初筛平板培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCl 5g,可溶性淀粉2g,琼脂18g, 加水至1000ml, pH7.4。
121℃灭菌20min。
Lugol碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。
3.器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。
四、实验方法1.培养基制备：配制肉汤培养基45ml,分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。
配制初筛平板培养基350ml,分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2.倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却至50〜60℃,以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。
冷却凝固待用。
3.样品预处理：取5g 土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。
另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL 土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。
4.平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24〜48h。
微生物菌体密度的测定(精)
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二、实验原理
确定单位体积溶液中的细胞量的方法有：细胞计数法，
或测定沉降速度或黏度的间接测量法等。本实验采用带刻
度离心管离心法确定悬浮液中的细胞的体积分数ψ ，采用 密度瓶法确定微生物细胞悬浮液ρ 和溶剂密度ρ
w。
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三、实验材料
1.菌种：酵母菌。 2.培养基：牛肉膏蛋白胨（牛肉膏3g/L ；蛋白胨 10g/L ；氯化钠5g/L ；pH7.0-7.2）。 3.缓冲液：0.05mol/L，pH5.0的KH2PO4缓冲液。
（四）制备菌悬浮液
将三角瓶内发酵液，4000rpm离心分离10min。去 上清液，收集菌体。用配好的缓冲液反复洗净2-3次， 并用此缓冲液制成菌悬液。
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四、实验步骤
（五）测定密度瓶的容积V 称取密度瓶空瓶的质量m空，加入水后称量m水，利 用密度公式计算其容积V。 （六）测定缓冲液、菌悬液的密度ρ 和ρ w 取已知质量的干净密度瓶，加满缓冲液，盖上盖， 置于恒温箱中。此时，通过毛细管可能会注出部分溶液， 应擦去。将密度瓶外部仔细擦干净后称重（准确至
密度的原理，掌握测定菌体密度的实验技术及其
密度瓶和刻度离心管的使用方法。
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二、实验原理
设微生物细胞的密度为ρ ρ
m m
，则
= m/v
式中 m为细胞的质量；v为细胞的体积。 设微生物细胞悬浮液的密度为ρ ，则
ρ =ψρ m+（1-ψ ）ρ w ρ m= ρ -（1- ψ ）ρ w ψ
式中ψ 为细胞悬浮液的体积分数，ρ w为溶剂密度。 测定出细胞悬浮液的体积分数ψ 以及ρ 和ρ 物的菌体密度ρ
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四、实验步骤
（一）培养基灭菌 取250ml三角瓶1只，加入配好的液体培养基，
环境工程微生物实验指导
环境工程微生物实验指导实验一微生物形态观察一、实验目的1、认识细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的基本形态特征。
2、巩固显微镜的使用方法。
3、学习微生物画图方法。
二、实验原理1、细菌的基本形态细菌是单细胞的微生物，能够独立进行生活，它的种类繁多，但基本形状有四种：球状、杆状、螺旋状和丝状，分别称为：球菌、杆菌、螺旋菌和丝状菌。
（1）球菌：细胞呈球形或椭圆形，根据它们相互联结的形式可以分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。
如金黄色葡萄球菌。
球菌大小以直径表示，一般为0.5~1μm。
（2）杆菌：细胞呈杆状或圆柱形，大小以宽度×长度表示，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。
如大肠杆菌就比较细而短、枯草杆菌粗而长。
杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是杆菌。
（3）螺旋菌：细胞呈弯曲杆状，螺旋菌细胞壁坚韧较硬，常以单细胞分散存在。
大小一般为（0.3~1.0）μm×（1.0~50）μm，根据其弯曲情况可分为弧菌、螺菌、螺旋体。
弧菌只有一弯曲，而螺菌有2~6个弯曲。
其大小为0.3~1×1~50μm。
若菌体弯曲螺旋圈数较多者，无坚韧的细胞壁，比较柔软，能自由运动，通称为螺旋体。
2、细菌的特殊构造细菌细胞的特殊构造有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。
（1）荚膜：是有些细菌生活在一定营养条件下，向细胞壁表面分泌的一种粘液状、胶质状的物质。
用显微镜观察，中心部位是细菌菌体，在暗色背景下荚膜呈透明状环绕菌体。
（2）鞭毛和菌毛：鞭毛是某些微生物细胞表面着生的一根或数根细长、波曲、毛发状的丝状物。
直径为0.1~0.2μm，它是细菌的运动器官。
在光学显微镜下不能直接观察到。
经过特殊的鞭毛染色后，在光学显微镜下可以看到鞭毛。
（3）芽孢：是某些细菌在其生长的一定阶段，在细胞内形成一个圆形、椭圆形、壁厚、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。
芽孢形成的位置、形状、大小可因菌种而异。
2024年微生物学实验教案(多场合)
2024年微生物学实验教案一、教案背景与目标微生物学作为生命科学领域的重要组成部分，在研究微生物的结构、功能、遗传和生态等方面具有重要作用。
本教案旨在通过实验操作，让学生深入了解微生物的基本特性，掌握微生物学实验的基本技能，培养其实验操作能力和科学思维能力。
二、教学内容与实验项目1.微生物的形态观察（1）光学显微镜的使用与维护（2）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察2.微生物的染色技术（1）革兰氏染色法（2）芽孢染色法（3）抗酸染色法3.微生物的纯培养技术（1）无菌操作技术（2）接种与分离技术（3）纯培养的鉴定与保存4.微生物计数与生长曲线测定（1）显微镜直接计数法（2）平板计数法（3）生长曲线的测定5.微生物的生理生化实验（1）碳源利用实验（2）氮源利用实验（3）维生素需求实验（4）酶活性实验6.微生物的分子生物学实验（1）DNA提取与纯化（2）PCR扩增技术（3）基因克隆与表达三、教学安排与课时分配1.微生物的形态观察（2课时）2.微生物的染色技术（4课时）3.微生物的纯培养技术（6课时）4.微生物计数与生长曲线测定（4课时）5.微生物的生理生化实验（6课时）6.微生物的分子生物学实验（6课时）四、教学方法与手段1.讲授与演示：教师通过讲解、演示实验操作，使学生了解实验原理、方法和操作步骤。
2.实践操作：学生在教师指导下进行实验操作，培养实验技能。
3.小组讨论：学生分组进行实验数据的分析与讨论，培养团队协作和科学思维能力。
4.考核评价：通过实验报告、操作考试和理论知识考试，全面评价学生的学习效果。
五、教学资源与设施1.教材：选用权威、实用的微生物学实验教材。
2.实验室：配备光学显微镜、PCR仪、电泳仪、恒温培养箱等实验设备。
3.试剂与耗材：提供细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等微生物菌株，以及实验所需试剂和耗材。
4.网络资源：利用网络平台，提供实验课件、教学视频等辅助教学资源。
六、教学效果与反馈1.学生能熟练掌握微生物学实验的基本技能，具备独立进行实验操作的能力。
微生物工程实验指导
微生物工程实验指导适用生物技术专业食品与生物工程学院2008.1实验一 发酵实验用玻璃器皿灭菌前的包扎方法一、目的：学习发酵实验用玻璃器皿在灭菌前的包扎工作，并了解灭菌后的使用方法。
二、原理：为保持发酵实验用玻璃器皿灭菌后的无菌状态，需要对它们灭菌前进行包扎，这些工作看起来简单，但如操作不当或不按操作规程去做，则会影响实验结果，甚至会导致实验的失败。
三、材料和设备5ml吸管30只，9cm培养皿 10套，120*12mm试管 120只，250ml三角瓶30个，脱脂棉0.5斤，天然棉0.5斤，8层纱布30块，线绳。
四、方法1、洗涤1 新器皿应用2﹪盐酸浸泡数小时再洗涤。
2 琼脂块不能倒入下水道。
3 含菌培养基一般先煮再洗。
4 洗涤后玻璃器皿上水应均匀湿润而无条纹和水珠。
2、包扎① 平皿的包扎：10个一包。
前9个方向一致，最后一个反放，用纸卷成卷，也可放在特制铁桶中灭菌。
② 吸管的包扎：在吸管尾部塞入少许脱脂棉，脱脂棉长约1cm，距管口约0.5cm，以防止在使用时造成污染。
脱脂棉松紧适当，多余的棉花可用火焰烧掉。
每支吸管用约6cm宽纸条，吸管头部包衬双层纸，以30－45º卷起，吸管尾部用剩余纸条打成一结，防止散开，标上容量。
使用时，从吸管中间凝断包扎纸带，抽出吸管。
③ 试管的包扎：用天然棉做成棉塞，紧贴管臂，松紧适宜，棉塞要实，2/3塞进管口。
也可用硅胶塞。
十只一把，外加牛皮纸，扎好。
脱脂棉易吸水，可能造成染菌。
④三角摇瓶的包扎：用8层纱布（大小适宜），塞入瓶口2/3，瓶外部分揪成一团，再用一层牛皮纸或两层报纸把纱布遮严（以免打湿），包扎，用绳子系成活扣。
使用时，去掉包扎纸，拿去纱布，接种后，将纱布塞进瓶口，纱布四角拉下，用绳子系成活扣。
五、作业体会这样做有哪些好处？实验二 灭菌技术及其应用一、目的：掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和操作。
二、原理：灭菌的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌目的。
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《微生物工程》实验指导曾松荣、柯野编韶关学院英东生命科学学院（适用专业：10级本科生物技术）重组毕赤酵母发酵表达蛋白酶及其初步鉴定一、实验目的1、学习重组毕赤酵母培养基产物表达的方法。
2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。
3、学习表达的重组蛋白酶的鉴定及其酶活的测定。
二、实验内容1、毕赤酵母的菌体生长和诱导表达的培养基的制备。
2、重组毕赤酵母生长菌体曲线的测定。
3、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达。
4、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。
5、SDS-PAGE鉴定重组蛋白酶。
三、实验原理蛋白酶是催化蛋白质化合物中肽键水解为小肽或氨基酸的一类酶总称，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微生物中，并且对生物体的生理调控、催化各种代谢反应等方面具有重要的作用。
蛋白酶是一类重要的工业用酶，约占整个工业用酶量60%以上；广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业。
由于蛋白酶具有广泛的工业、食品和医药等方面的应用价值，目前工业上需求量大。
植物中提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶。
植物蛋白酶生产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、气候等多因素的影响致使来源不稳定。
动物源性蛋白酶多从牛、羊和猪等的胰脏中提取而得。
动物来源蛋白酶生产成本较高，并受到世界动物保护协会和人员的强烈反对，目前主要用于医药方面。
因此，动植物源蛋白酶不能满足当代工业的需要。
微生物源蛋白酶几乎具有所有植物和动物来源蛋白酶的应用特性，成为了目前的蛋白酶的重要来源。
据统计，微生物蛋白酶占据了世界蛋白酶销售大约70%以上的份额。
目前商业化的蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋白酶来自植物木瓜，而来源于真菌的极少。
目前，国内外学者对来源于霉菌的蛋白酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提高蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究；而优化发酵条件很难大幅度提高蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生长状态)影响。
并且霉菌产生的蛋白酶种类较多，这增加了蛋白酶的纯化难度，阻碍了其进一步的开发利用。
因此采用基因工程技术，利用霉菌的蛋白酶基因整合到毕赤酵母的基因组上构建工程菌株，利于高产获得重组霉菌蛋白酶。
毕赤酵母表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表达量高。
该表达系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白，该目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化。
毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。
其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。
它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX-甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
四、器材与试剂1、菌种：重组蛋白酶毕赤酵母工程菌株，本菌株由本实验室自己构建保藏。
2、培养基BMGY培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500×生物素溶液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甘油10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。
BMMY 培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500×生物素溶液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甲醇10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。
3、试剂福林试剂(Folin试剂)：于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O)100g，钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10h。
取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水50mL，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。
冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗(No4-5) 过滤，置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
0.4mol碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(Na2CO3) 42.4g，定容至1000mL。
0.4mol三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸(CCL3COOH) 65.4g，定容至1000mL。
pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O) 31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为1000μg/mL，再吸取此液10mL，以0.2N盐酸定容至100mL，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
电极缓冲液（pH 8.3）：0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris），0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）：称3.02 gTris、14.42 g甘氨酸，1g SDS，用蒸馏水定容至1000ml。
分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5 mol/L Tris-HCl 称18.171 gTris，80 ml蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 8.8，蒸馏水定容至100ml。
浓缩胶缓冲液（pH6.8）：0.5 mol/L Tris-HCl 称6.075 gTris，80ml蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 6.8，蒸馏水定容至100ml。
凝胶：30%丙稀酰胺（Acr）、1.6%甲叉双丙稀酰胺（Bis）称30 gAcr、0.8 g Bis，加少许蒸馏水热溶, 用蒸馏水定容至100 ml。
染色液：称2.5 g考马斯亮兰R-250，加500 ml甲醇，100 ml醋酸, 用蒸馏水定容至1000 ml。
脱色液：取250 ml甲醇，70 ml醋酸，用蒸馏水定容至1000ml样品缓冲液：取10% SDS 1ml，二巯基乙醇（13.5mol/L）0.6 ml，甘油1.5ml，0.05%溴酚兰少许，0.5mol Tris-HCl(pH6.8)定容至10 ml。
样品处理：将血清用样品缓冲液稀释至蛋白含量为1mg/ml，煮沸5min。
10% SDS：称10.0 g SDS，用蒸馏水定容至100 ml。
4、器材分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、pH计、离心机、电子天平、电泳槽等。
五、实验操作（一）配制BMGY和BMMY培养基1 称量：按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。
2溶解：向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。
3.调节pH值：用玻璃棒沾少许液体，测量pH值。
用氢氧化钠和盐酸调节PH，本实验采用的是缓冲液配制培养基，也需要培养基的最终pH。
4.分装及包扎：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。
最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
6.灭菌：高压蒸汽灭菌，121 ℃灭菌20分钟。
（高压蒸汽灭菌器使用方法：加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。
盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。
通电加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气。
待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。
继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3℃)，开始计时，维持15-30min。
灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。
切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。
）7.灭菌后验证灭菌是否彻底：将培养基放置于37℃培养箱中，培养48 h，检测是否有菌生长。
（二）重组毕赤酵母生长曲线测定1、种子液制备取重组毕赤酵母工程菌株斜面菌株1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入BMGY培养液中，250rpm，30℃振荡培养24 h。
2、接种培养用5ml无菌吸管，准确地吸取5ml重组毕赤酵母工程菌株的培养液，接种到灭菌装有50ml BMGY培养液的250ml的三角瓶中，接种后振荡，使菌体混匀。
3、培养将接种后三角瓶放置于摇床上，250rpm，30振荡培养。
分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30小时从三角瓶中取出一定体积的菌悬液，立即放4℃冰箱中贮存，最后一起比浊测定光密度值。
4、比浊测定以未接种的BMGY培养液作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。
从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的BMGY培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1-0.65以内，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。
（三）重组毕赤酵母的诱导表达1、取出冰箱中保存的重组毕赤酵母工程菌株，接种于含25mL BMGY 培养基的250mL 摇瓶中，28-30℃振荡培养（250～300rpm）至对数生长期OD600达2-6，约16-18h）。
2、室温下以3000 g 离心5min 回收酵母细胞。
弃去上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY 培养基中，至OD600值为1.0-2.0（约100-200mL）。
3、将培养液置于1L 摇瓶中，覆盖两层无菌纱布和一层灭过菌的报纸，置摇床中，28～30℃继续培养并开始诱导表达（注意诱导温度应严格控制，不要超过30℃）。
4、诱导表达起始后，每隔12h 补加100%甲醇至终浓度为0.5%～2%以维持诱导。
5、诱导开始后，每隔24h 取样一次，直至168h。
每次取诱导培养液1mL 于1.5mL离心管中，室温下以最大转速离心2-3min，将上清液和细胞沉淀分别冻存于-20℃。
（四）发酵液酶活的测定1、标准曲线的绘制1.1、按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。