(参考课件)绿色荧光蛋白标记亚细胞定位

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生物化学精品课程
荧光蛋白标记亚细胞定位
扬州大学 生物科学与技术学院
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生物化学精品课程
问题的提出
一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物 理状态
但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的 的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白， 以利用了解以下信息
1. 目的蛋白定位在什么地方? 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用
P
Target
终止子
Linker (poly-G)
P EGFP
Target
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荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄 的切面上。 激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意 光线。
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实验方法
1. 克隆目的基因的开发阅读框 2. 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一
般选用pEGFP系列质粒载体） 3. 将质粒转染细胞 4. 在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细
胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例 如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist);内质网染 色或线粒体染色。
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荧光亚细胞定位的应用
荧光是最常用的工具用于蛋白的亚细胞定位
ຫໍສະໝຸດ Baidu
Actin
endoG-YFP (apoptotic endonuclease)
Debrin
Mitochondria
Colocalization
Apop扬to州si大s学12生物(7科):学11与5技5术-1学17院1, 2007
这些问题能够通过以下实验揭示 (1) 蛋白荧光细胞定位 (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移
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荧光蛋白标记细胞定位
将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色 荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位
限制性内切酶位点
启动子
目的蛋白基因