(参考课件)绿色荧光蛋白标记亚细胞定位
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法作者：于一帆朱小彬葛会敏陈云来源：《江苏农业科学》2014年第12期摘要：细胞是生命活动的基本单位，各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。
蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。
目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。
综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法，包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等，同时对上述几种方法进行了比较分析。
关键词：蛋白质；亚细胞定位；绿色荧光蛋白；瞬时表达中图分类号： Q-33文献标志码： A文章编号：002-302（204）2-0058-04蛋白质是生物功能的直接体现者，有序分布、动态调控的蛋白质是保证生命个体正常生长发育的前提。
基因表达产物在组织中的亚细胞定位是功能基因组学、蛋白质组学的重要研究内容之一，是系统理解植物形态建成、生长发育以及对逆境的耐受性、抵抗性不可或缺的环节，也是生物学家们初步推断蛋白质生物学功能的重要依据。
蛋白质的亚细胞定位可采取多种方法，包括生物信息学预测、免疫胶体金标记[2]、多肽序列分析[3]以及与报告基因融合瞬时表达[4]等。
目前植物蛋白的亚细胞定位应用主要是借助于融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GF）应用最为广泛。
瞬时表达技术结合报告基因，可以有效跟踪融合产物在细胞内的运输、亚细胞定位及代谢[5]。
GF是水母（Aequorea victoria）体内的天然蛋白，自994年Chalfie等揭示了该蛋白作为报告蛋白的潜在应用价值[6]以来，已作为报告蛋白在多种植物、动物、微生物中成功获得表达。
由于GF作为报告蛋白不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分，也不影响宿主细胞，因而可以鉴定、跟踪、分选表达GF的细胞；同时可以在活细胞中进行图像分析，在固定细胞中进行检测[7]。
亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白
亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白亚细胞定位是研究细胞内蛋白质在细胞中的定位和运输过程的重要领域。
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）和红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，简称RFP）是经常被使用的一对标记蛋白，它们在细胞内可以通过荧光显微镜观察到不同的荧光信号，从而帮助研究者揭示蛋白质的定位和运输。
GFP最早由日本科学家下村脩在1962年研究海葵(Aequorea victoria)中的荧光蛋白而获得，并于1992年被将其克隆到其他生物系统。
GFP的一个重要特点是它在没有外源激发剂的情况下就可以自行发出荧光。
GFP可以通过其自身的三肽序列引导，与细胞内的目标蛋白连接在一起。
当GFP连接在目标蛋白后，细胞内目标蛋白的表达和定位就可以通过荧光显微镜直接观察到。
基于GFP的定位系统被广泛应用于其他蛋白质的研究中。
RFP也是一种荧光蛋白，其最早是从珊瑚Disocora unifora中分离得到的。
RFP和GFP有相似的结构，但它们有不同的激发和发射波长。
RFP发射波长较长，通常在560-620nm之间。
RFP也可以被编码到目标蛋白上并通过荧光显微镜观察到。
GFP和RFP在细胞内的应用主要有两个方面：1.追踪蛋白质的定位和运输；2.研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。
在细胞定位和运输方面，通过将GFP或RFP连接到目标蛋白上，可以观察到这些蛋白质在细胞中的分布情况。
比如，可以通过将GFP连接到细胞器膜上的蛋白质上，来观察这些细胞器在细胞中的定位和运输过程。
通过追踪GFP或RFP的荧光信号，我们可以了解蛋白质在细胞内的运输速度、路径以及转运机制。
此外，GFP和RFP还可以被用来研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。
通过将GFP和RFP连接在两个相互作用的蛋白质上，可以根据不同的荧光信号来观察这两个蛋白质的相互作用情况。
另外，通过将GFP和RFP连接在目标蛋白的不同区域上，可以研究蛋白质的拓扑结构，比如膜蛋白的跨膜结构等。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用课件
3 GFP的稳定性
❖ GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要 在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧 光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对 某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基 试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。 在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍 基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫 醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用 放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10μg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生 质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分 GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP的 消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧 光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋 白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤嘿，伙计们！今天我们要聊聊一个非常有趣的话题——gfp融合蛋白亚细胞定位步骤。
让我给大家简单介绍一下什么是gfp融合蛋白。
GFP融合蛋白，就是把绿色荧光蛋白(gfp)和别的蛋白质结合在一起，形成一个新的蛋白。
这个新的蛋白有个特点，就是它可以在显微镜下发出绿色的荧光。
这对于我们研究细胞内部的结构和功能非常有帮助哦！那么，我们怎么才能让这个gfp融合蛋白在细胞里找到它的“家”呢？这就需要我们进行亚细胞定位步骤了。
接下来，我就会给大家一步一步地讲解这个过程。
我们要让这个gfp融合蛋白进入到细胞里面。
这可不是一件容易的事情，因为细胞的大门可是紧紧关着的。
但是，我们有办法。
我们可以先把这个gfp融合蛋白包在一层叫做脂质体的膜上，然后再把它送进细胞。
这样一来，gfp融合蛋白就顺利地进入了细胞啦！接下来，我们要让这个gfp融合蛋白在细胞里“游走”。
这就像是在大海里游泳一样，我们需要知道它在哪里才能找到它。
所以，我们就要用一种叫做荧光显微镜的技术来观察这个gfp融合蛋白。
荧光显微镜是一种可以发出绿色荧光的显微镜，它可以帮助我们看到细胞内部的结构和活动。
通过荧光显微镜，我们就可以找到gfp融合蛋白的位置了！找到了gfp融合蛋白的位置之后，我们还要让它“回家”。
这就像是在玩捉迷藏一样，我们要把gfp融合蛋白从一个地方带到另一个地方。
这个过程叫做转移。
我们可以通过一些特殊的方法来实现gfp融合蛋白的转移，比如说使用一种叫做化学载体的方法。
这种方法可以把gfp融合蛋白从一个细胞转移到另一个细胞，就像快递一样方便！我们要让这个gfp融合蛋白在目标位置发挥作用。
这就像是让它去完成一项任务一样。
我们可以通过观察gfp融合蛋白在目标位置的活动来了解它的功能。
这样一来，我们就可以知道这个gfp融合蛋白到底是怎么工作的了！好了，各位小伙伴，今天的亚细胞定位步骤就讲到这里啦！希望大家对gfp融合蛋白有了更深入的了解。
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤
gfp融合蛋白亚细胞定位步骤1. 什么是GFP融合蛋白？好啦，咱们先聊聊GFP融合蛋白到底是什么。
简单来说，GFP（绿色荧光蛋白）就是个能发绿光的小家伙，它可在各种生物中找到，像小水母、海洋生物这些。
科学家们聪明地把这个小家伙跟其他蛋白质绑在一起，形成了GFP融合蛋白。
这就像给一件衣服加了个炫酷的荧光装饰，立刻吸引了眼球！所以，我们用这个融合蛋白就能观察细胞内各种蛋白质的“动静”，就像透过玻璃窗看邻居家的热闹一样。
1.1 GFP的魅力GFP的魅力可不止于此哦！首先，它不需要任何特殊的染料或化学试剂，照个光就能发光，真是方便得不得了。
其次，GFP的荧光特性非常稳定，不容易被破坏，基本上是个“长青树”，只要好好照顾，能陪你很久。
想想，如果能在细胞中像放烟火一样观察到蛋白质的动态，那是多么酷的事情啊！这可是科学研究中的“火箭发射”，瞬间提升了研究效率。
1.2 GFP融合蛋白的用途接下来，咱们聊聊这个融合蛋白的用途。
科学家们可以利用它来研究细胞的结构、功能，甚至是信号传递。
比如说，你想知道某个蛋白质是不是在细胞膜上，还是在细胞质里，嘿，简单！只需把GFP和目标蛋白结合，就能轻松找到它的位置。
就像在找女儿的玩具一样，轻松又愉快。
2. 亚细胞定位的步骤现在我们要进入正题，怎么把这GFP融合蛋白带到细胞里，进行亚细胞定位呢？这个过程听起来挺复杂，但其实很有趣，像个探险游戏。
2.1 设计融合蛋白首先，咱们得设计融合蛋白。
这个过程就像做菜，得有主料和辅料。
你得选定目标蛋白，然后把GFP“嫁接”上去。
这一步是关键，得确保融合后的蛋白能正常工作，不然就像做了道菜，结果食材不新鲜，味道全无。
通常，科学家们会利用基因工程的技术，把GFP和目标蛋白的基因拼接在一起，形成一个完整的DNA序列。
完成后，你就得把这个序列送入细胞里。
2.2 转染细胞转染细胞是个很重要的步骤。
想象一下，咱们把这个DNA序列像一封信一样送到细胞里。
常见的转染方法有病毒转染、脂质体转染等等。
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法_于一帆
江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 12 期
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统，由于没有细胞壁等特点，它可以排除细胞之间的相互影 响，单独考察 1 个细胞的全能性。原生质体是 1 个均一性程 度很好的群体，并且在短时间内就能获得大量原生质体。原 生质体是 1 个理想的试验系统，由于不受植物细胞壁的限制， 其质膜经一定处理可以摄取外源物质（ 如细胞器、病毒、DNA 等） ，是遗传转化的理想受体系统［11］。研究表明，不同植物材 料所得到的原生质体可以保持原组织的生理生化特性，可以 取代植物组织作为理想的试验材料。 1． 1 PEG － Ca2 + 介导转化法
lus： vol． 707［M］． New York： Wiley，1990．
Байду номын сангаас
［9］Stülke J，Hillen W． Ｒegulation of Carbon catabolism in Bacillus spe-
［6］Ye Ｒ Q，Kim J H，Kim B G，et al． High evel secretory production of
脂质体介导转化法是将质粒 DNA 包裹在脂质体中，然后 与原生质体接触融合而把外源 DNA 带入原生质体的 1 种方 法。脂质体是 1 种由磷脂、胆固醇、脂肪酸等脂类分子组成的 球形膜囊结构，可将 DNA、ＲNA 等大分子物质包在脂质体内， 免受细胞内核酸酶的降解。脂质体可做成单层、双层或多层。 脂质体进入原生质体主要发生在脂质体与原生质体共培养的 起始 2 h，共培养 90 min 后，加入一定浓度的 PEG 能提高脂质 体、原生质体融合的频率。 1． 4 植物病毒载体介导法
基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法
于一帆，朱小彬，葛会敏，陈 云
绿色荧光蛋白gfp标记方法参考PPT
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5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
2
GFP标记
菌落观察
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油镜观察
3
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
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一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
绿色荧光蛋白(GFP)PPT课件
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2008年诺贝尔化学奖获得者
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\钱永健希望更多中 国青年投身基础研究_标清.mp4
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2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下 ，前往美国，先后在普林斯顿 大学、波士顿大学和麻省伍兹 霍尔海洋生物实验所工作。
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3
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\机制.mp4 C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\TED.mp4
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绿色荧光蛋白的应用前景
肿瘤切除手术的现状： 凭借医生经验，难以根除，容易残留 ，容易转移。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿色荧光。
由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。
GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。
GFP基因含有GFP编码序列，该序列通过表达可以产生GFP蛋白质。
GFP的荧光性质是由三个氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。
在GFP的自然状态下，并不发出荧光。
但当该基因被转录和翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。
在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究人员观察细胞内部的某些组分或结构。
研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表达GFP。
由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜直接观察到目标蛋白的位置和分布。
通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过程中的变化，以及探索细胞活动的机制。
此外，通过将GFP基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。
除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。
由于GFP的高度稳定性和荧光强度，它可以作为生物化学实验中定量和定位特定蛋白质的工具。
此外，GFP作为标记基因在基因治疗研究中也发挥着重要作用，用于追踪和监测基因表达和转导的进程。
尽管GFP已经成为生物科学研究中广泛应用的工具，但也存在一些局限性。
首先，GFP的结构和功能对温度和酸碱度非常敏感，因此在特殊环境中的应用可能受到限制。
绿色荧光蛋白PPT模板.ppt
用荧光蛋白在鼠脑中绘制的油画
3.3 小动物体内恶性肿瘤生长过程及药物作用效果 的实时光学成像监测：
No Image
(a) 整体荧光成像系统示意图．(b)整体荧光成像监测2 胰腺癌细胞(表达红色荧光蛋白)的生长以及治疗效果．肿 瘤细胞种植后10，17，24，48 和56 天分别进行成像．粗箭头表示原位灶．细箭头表示转移灶．与对照组进行 比， 药物部分抑制原位灶和转移灶的生长，而 药物则在一个月内大大抑制肿瘤的生长，但是一个月之后，继
2. 发光机制： 生色团是由其中的三件下 不能形成荧光．生色团通过66 的脱质子 (酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射。
生色团的66 和67 相对比较保守，而65相对易变，因此可用其他氨基酸替 换。
3. 典型应用：
3.1 技术 ——活细胞内基因表达及蛋白质-蛋白质相互作用的光学成像与可视化
R
C
Y
C
3.2 不同神经元的多色标记与光学成像:
结合其他颜色荧光蛋白，比如红色荧光 蛋白，可对同一个细胞的不同细胞器和不同 细胞进行标记．其中最具代表性的实验莫过 于2007 年的“脑虹”。
哈佛大学的研究人员通过转基因技术将 不同光谱的荧光蛋白基因整合进实验老鼠的 基因组，并且只让它们在老鼠脑神经元表 达．
谢谢！
绿色荧光蛋白
化 基：张 赫 学 号：2
2008年，诺贝尔化学奖：
Y.
目录：
发
典
结
光
型
展
构
机
应
望
制
用
1. 绿色荧光蛋白的结构：
: 分子量27 238个氨基酸残基 11个β折叠 位于圆桶中央的α螺 旋含有一个含6肽组 成的发光中心
N端 C端
亚细胞定位步骤
亚细胞定位步骤
亚细胞定位的步骤主要包括以下几步：
1. 细胞准备：获取所需的细胞样本，可以是动物或植物细胞，也可以是微生物细胞。
2. 荧光标记：将目标蛋白质与荧光染料（如绿色荧光蛋白，GFP）进行标记，以便在显微镜下观察。
3. 细胞转染：将标记的目标蛋白质导入细胞中，可以使用不同的方法，如显微注射、电穿孔或脂质体转染等。
4. 显微观察：在荧光显微镜下观察细胞，寻找目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
通常需要使用不同倍率的物镜来观察不同大小的细胞和亚细胞结构。
5. 图像采集和分析：使用图像采集系统记录观察到的图像，并使用相关软件进行分析，以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
6. 验证实验：为了确保结果的可靠性，需要进行一系列验证实验，如免疫共沉淀或Western blot等，以确认目标蛋白质与亚细胞结构的相互作用。
通过以上步骤，可以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置，进一步了解其在细胞中的功能和作用。
GFP-绿色荧光蛋白课件PPT
05
gfp在生物技术中的应用
示踪和标记技术
1 2 3
细胞内定位
利用绿色荧光蛋白的特性，可以将其与目标蛋白 融合，通过观察荧光信号，确定目标蛋白在细胞 内的位置和动态变化。
病毒追踪
在病毒研究中，绿色荧光蛋白可以标记病毒，通 过观察荧光信号，追踪病毒在细胞内的复制和传 播过程。
稳定性好
gfp具有较好的热稳定性和化学稳 定性，能够在较为极端的环境条 件下保持较为稳定的荧光特性。
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gfp的表达和纯化
在大肠杆菌中表达gfp
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表达系统
使用pET系列载体，将目 的基因插入到载体中，通 过转化到大肠杆菌中实现 表达。
表达条件
通过调节温度、诱导剂浓 度等条件，控制目的基因 的表达量。
提高荧光强度
总结词
通过定点突变技术，对绿色荧光蛋白（GFP）的关键氨基酸进行改造，以提高其荧光强 度。
详细描述
在野生型GFP中，存在一些关键的氨基酸残基，如色氨酸、酪氨酸和组氨酸等，它们对 荧光强度起着重要作用。通过将这些氨基酸替换为发光能力更强的氨基酸，如荧光素、
雷氯毒素等，可以显著提高GFP的荧光强度。
海洋生物学
用于研究海洋生物的行为、生态和 生物发光现象等。
gfp在科学研究中的重要性
gfp作为重要的生物标记工具， 为科学研究提供了可视化手段， 使得科学家能够直观地观察和了 解细胞和生物体内的动态变化。
gfp的应用促进了跨学科的合作 与交流，推动了生命科学领域的
发展。
gfp的成功应用证明了基因工程 技术的巨大潜力和价值，为未来 的科技发展提供了新的思路和方
THANKS
绿色荧光蛋白.2021完整版PPT
钱永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995 年，他完成了单点突变（S65T）显著提高了 GFP的光谱性质，其荧光强度和稳定性也大大 增强。此外，GFP还存在其他的突变，如颜色 突变。
具体应用
• 作为转基因植物和动物的筛选标记 • 用于定位标记 • 跟踪观察微生物 • 发育机理研究 • 用于细胞筛选 • 用于免疫学
• 1992年，道格拉斯普瑞舍克隆并测序了野生型的 GFP
• 马丁查尔菲在研究线虫神经结构时，将GFP作为 研究线虫的工具，发现水母素和GFP发光原理不 同，水母素是荧光酶的一种，需要荧光素才能发 光，而GFP本身就能发光。这意味着GFP可以很 方便地被植入生物体内，作为一种指示剂，跟踪 和判断生物细胞分子的变化。
绿色荧光蛋白
钱永健名片
• 钱永健(Roger Yonchien Tsien，1952年2月 1日－)，美国细胞生物学家。美国国家科学 院院士，美国国家医学院院士，美国艺术 与科学院院士。圣地牙哥加利福尼亚大学 生物化学及化学系教授。汉族，1952年生 于美国纽约，祖籍浙江杭州，是中国导弹 之父钱学森的堂侄。
很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报 他们说，下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质，即GFP。 道基因。
绿荧光水母——通过体内绿色荧光蛋白发光
GFP的发现
• 1962年，下村修和约翰森从维多利亚多管 水母（Aequorea victorian）中分离生物发 光蛋白质——水母素（aequorin）时，意外 地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色， 钨丝灯光下呈黄色，紫外光下呈亮绿色。 之后，他们仔细研究了其发光特性，并发 现：是水中的钙离子增强了水母素的发光。 于1963年，他们在美国《科学》杂志上报 道了钙离子和水母素发光的关系，并于 1974年得到了这种蛋白质。
亚细胞定位gfp法和peg法
亚细胞定位gfp法和peg法1. 亚细胞定位gfp法简介亚细胞定位gfp法是一种用于研究细胞内蛋白质分布的技术。
这种方法利用了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的特性，将其融合到所研究的蛋白质中，通过观察融合蛋白在细胞内的分布情况，来揭示该蛋白质在细胞内的定位和功能。
这种方法在生物医学研究中有着广泛的应用，尤其是在细胞生物学和分子生物学领域。
2. 亚细胞定位gfp法的优点亚细胞定位gfp法具有以下几个明显的优点：a. 对细胞生长和形态没有影响：由于GFP是一种天然的荧光蛋白，其融合到蛋白质中并不会对细胞的生长和形态产生明显的影响，因此能够较为真实地反映融合蛋白在细胞内的定位情况。
b. 高灵敏度和高分辨率：GFP作为荧光标记可以被高灵敏度地观察到，且具有较高的分辨率，能够清晰地显示融合蛋白在亚细胞结构中的分布情况。
c. 方便直观：利用显微镜观察细胞内GFP信号的分布情况，不需要特殊的检测设备，能够直观地展示融合蛋白的亚细胞定位情况。
d. 适用范围广泛：亚细胞定位gfp法适用于多种细胞类型和不同物种的蛋白质研究，具有广泛的适用性。
3. 亚细胞定位gfp法的不足在应用亚细胞定位gfp法的过程中，也有一些不足之处：a. 光淬灭：由于长时间的激发会造成GFP荧光的淬灭，导致信号的衰减和变形。
b. 信号叠加：在观察过程中，可能会遇到不同来源的GFP信号叠加在一起，导致分辨率降低，不利于准确观察融合蛋白在细胞内的定位情况。
c. 穿透深度：亚细胞定位gfp法对显微镜的穿透深度要求较高，对于厚度较大的样本可能存在不足之处。
4. PEG法简介PEG (Polyethylene glycol) 是一种水溶性聚合物，可以通过其与蛋白质的相互作用来实现蛋白质的亚细胞定位。
PEG法主要包括PEG共价交联法和PEG大孔隙法两种形式。
这种方法通过PEG与细胞膜或蛋白质的相互作用，能够分离出细胞内的不同亚细胞结构，从而实现研究蛋白质在亚细胞结构中的定位和功能。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
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内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。二、主
要步骤 1．真核表达载体的构建 引物设计利用引物设计软件，根据 pEGFP-N1 的酶切位点设计目的基因引物：②载体构建将
那里。这个不是木子故意要考的，就像电视剧里那样女主为了男主拼尽全力，努
PCR 产物酶切后插入 pEGFP-N1，得到表达目的基 因与 EGFP 融合蛋白质的真核表达载体。2．转染 真核细胞当细胞生长到对数生长期时，接种到共
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GFP融合蛋白进行蛋白质的亚细胞定位解析PPT课件
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23
参考文献
[1]崔志芳,邹玉红,季爱云. 绿色荧光蛋白研究三个里程碑—2008年诺贝尔化学 奖简[J]. Chinese Joural of Nature,2008,30(6):324—328.
[2]徐飞虎,龚兴国. 绿色荧光蛋白应用研究进展[J]. 细胞生物学杂志, 2002, 24(6):332—334.
可以在活细胞中进行图像分析，也可以检测固 定细胞中的GFP。
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GFP融合蛋白的检测
注意事项： 以gfp作为报告基因研究蛋白亚细胞定位，必
须做对照。由于某些细胞本身也有自发荧光， 必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以免假 象干扰实验，避免得出错误结论。 并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表 达，因此要尽可能多的获得转基因细胞，如果 数目较少，可能会检测不到荧光。
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GFP的改进
除去GFP基因中隐蔽型内含子 消除编码蛋白的积累 将GFP定位到特定细胞器中 改变碱基组分 更换GFP生色团氨基酸 插入植物内含子 增加增强子和更换强启动子
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GFP的应用
蛋白质定位 作为报告基因 药物筛选 融合抗体 生物传感器 其他方面
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GFP融合蛋白的构建
真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同 地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。
译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有 蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。
蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中 心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些 蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。
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GFP的改进
绿色荧光蛋白标记亚细胞定位最全PPT
荧光蛋白标记细胞定位
将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色 (1) 蛋白荧荧光光细胞蛋定位白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位
一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物理状态
目的蛋白基因 终止子 (但2)是酵存母在双一杂些限交基，制础免的性疫问共内题沉，切淀如，酶何荧直位光接共点理振解能蛋量白转在移细胞内的的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白，以利用了解以下
胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例 如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist);内质网染 色或线粒体染色。
绿色荧光蛋白标记亚细胞定位
问 理状态
但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的 的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白， 以利用了解以下信息
1. 目的蛋白定位在什么地方? 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用 这些问题能够通过以下实验揭示 (1) 蛋白荧光细胞定位 (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移
荧但信光是息亚 存细在胞一定些位基的础设的备问题: 激，光如共何聚直焦接显理微解镜蛋白在细胞内的的P生物活性，E因G此F，P我们需要在活细胞体Ta内r检g测et这些蛋白，以利用了解以下
这些问题能够通过以下实验揭示 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一般选用pEGFP系列质粒载体） 一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物理状态 荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜
Linker (poly-G) 激(1)光蛋共白聚荧焦光显细微胞镜定的位优点是其能剔除非焦平面来源的任意光线。
这将些目问 的题基能因够与通EG过F以P基下因实融验合揭（示在哺乳动物细胞中，一般选用pEGFP系列质粒载体） 激克光隆共 目聚的焦基显因微的镜开的发优阅点读是框其能剔除非焦平面来源的任意光线。 (荧2)光酵亚母细双胞杂定交位，的免设疫备共: 沉激淀光，共荧聚光焦共显振微能镜量转移
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生物化学精品课程
问题的提出
一直以来，人们已经掌握一些方法以评价蛋白的化学和物 理状态
但是存在一些基础的问题，如何直接理解蛋白在细胞内的 的生物活性，因此，我们需要在活细胞体内检测这些蛋白， 以利用了解以下信息
1. 目的蛋白定位在什么地方? 2. 目的蛋白与哪些其他蛋白相互作用
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生物化学精品课程
荧光亚细胞定位的应用
荧光是最常用的工具用于蛋白的亚细胞定位
Actin
endoG-YFP (apoptotic endonuclease)
Debrin
Mitochondria
Colocalization
Apop扬to州si大s学12生物(7科):学11与5技5术-1学17院1, 2007
这些问题能够通过以下实验揭示 (1) 蛋白荧光细胞定位 (2) 酵母双杂交，免疫共沉淀，荧光共振能量转移
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荧光蛋白标记细胞定位
将目的基因与绿色荧光蛋白基因（EGFP）融合，通过绿色 荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行亚细胞定位
限制性内切酶位点
启动子
目的蛋白基因
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实验方法
1. 克隆目的基因的开发阅读框 2. 将目的基因与EGFP基因融合（在哺乳动物细胞中，一
般选用pEGFP系列质粒载体） 3. 将质粒转染细胞 4. 在不同的时间点在激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细
胞中的定位，如有必要需进行亚细胞组分的染色，例 如细胞核染色（一般可用PI, DAPI或Hochist);内质网染 色或线粒体染色。
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生物化学止子
Linker (poly-G)
P EGFP
Target
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荧光亚细胞定位的设备: 激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜所发射的光能聚焦在样品的一个非常薄 的切面上。 激光共聚焦显微镜的优点是其能剔除非焦平面来源的任意 光线。
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