青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 绿色荧光蛋白标记探究
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1.2.1.3青枯雷尔氏菌的电击转化参照文献[10]。电击转化后取200 μl菌液涂布于含有50 μg·ml-1卡那霉素的0.1×TSB固体培养基上，30℃培养。电击转化的参数为：电压2.5 kV、电容25 µF、电阻400 Ω。
1.2.1.4阳性转化子的荧光检测及激光共聚焦显微检测检测方法参照文献[11]。通过观察菌落发出的绿色荧光直接筛选阳性转化子，命名为Rs91-GFP。
Key words:Ralstonia solanacearum;Electroporation;gfp/luxABgene
0 引言
【研究意义】植物细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性的土传细菌病害。青枯雷尔氏菌寄主广泛，可侵染44个科数百种植物[1]。植物青枯细菌致病的分子机制是植物与微生物相互作用机制研究的重要领域之一。在植物根际土壤中和植株体内存在着大量的青枯雷尔氏菌，这给青枯雷尔氏菌侵染致病机理的研究带来了困难。将gfp基因转入青枯雷尔氏菌将有助于研究青枯雷尔氏菌在活体植物体内的侵染过程，建立菌体生物量的直观测定方法，从而为更加深入地研究青枯雷尔氏菌致病机理及青枯病生物防治机制奠定基础。【前人研究进展】绿色荧光蛋白（GFP）最早是从水母中分离出来的，是一种非酶性报告因子，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，作为报告基因，GFP是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一，作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害[2]。GFP检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代[2]。利用GFP标记进行病原菌侵入活体细胞过程的跟踪观察更开创了病理学研究的新时代[3~5]。Unge等[6]的研究证明了荧光与菌体细胞数量呈线性关系，也为通过荧光直接对细菌记数提供了一个方便快捷的方法。gfp基因在其它细菌上的转化有过许多报道，但是，青枯雷尔氏菌gfp基因转化非常困难，国内外许多学者都试图进行青枯雷尔氏菌gfp基因转化，然而，成功的例子非常少，通过NCBI检索，仅见两篇关于gfp基因转入青枯雷尔氏菌的报道[7,8]，一篇是采用自然转化的方法将来自AW1-gfp38菌株的Tn5::gfp转入青枯雷尔氏菌K60[7]，另一篇则采用细胞融合的转录方法将hrp-gfp基因转入GMI1000[8]。【本研究切入点】未见关于采用电击转化法进行青枯雷尔氏菌的gfp基因转化的报道。目前在国内未见关于青枯雷尔氏菌gfp基因转化的报道。【拟解决的关键问题】在本研究中，作者采用带有gfp/luxAB双标记基因的pUT mini-Tn5转座载体，通过电击转化法成功地将它整合到青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）染色体上，并利用荧光显微镜检测GFP在标记菌中表达后发出的绿色荧光，同时进行了转化菌体的gfp基因检测和转化菌株的微生物学异质性检测，研究转化菌株的生物学稳定性，为青枯雷尔氏菌gfp基因转化和致病机理的研
究提供方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1菌株和质粒青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）编号Rs91菌株为本实验室从番茄植株上分离纯化得到并保存。大肠ຫໍສະໝຸດ Baidu菌（Escherichia coli）CC118为转座载体pUTgfp/luxAB的宿主菌，由瑞典农业大学微生物系JanetK.Jasson教授惠赠，其中带有双标记基因gfp/luxAB[9]，质粒图谱见图1。
青枯雷尔氏菌（
车建美
（
摘要：【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记，研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化，采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整个细胞呈现绿色荧光，PCR结果表明，从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到稳定期，荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次，仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致，在番茄组培苗内的侵染路线相同，致病力均达到90%以上。【结论】利用gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌，融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。
Abstract:【Objective】TheRalstonia solanacearumstrain was chromosomally tagged with the marker genesgfpandluxABbyelectroporation. The growth properties and the pathogenicity of the tagged strain and the wild typestrainwere compared in this paper.【Method】TheR.solanacearumstrain was transformed by the electroporation. The condition and processor of the invasion of the GFP-taggedstrainwas observed in the tomato tissue culture plants.【Result】Transformant was screened for the green fluorescence by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0kb fragment of thegfpgene andluxABgene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically, the cells of the engineered strain were similar to wild typestrainas determined by laser scanning confocal microscopy. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly duringthelog phase, but decreased in the stationary phase. The green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. It was the same for the GFP-tagged strian and the wild typestrain inthe culture temperature, pH value and growth curve. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into theR.solanacearumstrain. The pathogenicity of the wild type strain and the GFP-taggedstrainwas over 90% which meansgfpgene had no effect on the pathogenicity.【Conclusion】The GFP-taggedR.solanacearumis obtainedin thisstudy. The growth propertities and the pathogenicity of the GFP-tagged strainis thesame to the wild typestrain.
关键词：青枯雷尔氏菌；电击法；gfp/luxAB基因
GFPTaggingRalstonia solanacearumwithgfp/luxABmini-Tn5
CHEJian-mei1,2, LANJiang-lin1, LIUBo1
(1Agricultural Bioresource Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003;2Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Fujian Agricultrue and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)
图1 质粒pUTgfp/lux图谱
Fig.1 ThemapofpUTgfp/lux
1.1.2培养基、抗生素与试剂大肠杆菌（E.coli）CC118的培养基为LB培养基；青枯雷尔氏菌的培养基为0.1×TSB；质粒大量提取及纯化试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit；抗生素卡那霉素（Kanamycin，Km）购自Sigma公司；电转化仪为Bio-Rad Gene PulserⅡ；立体荧光显微镜（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品。凝胶成像仪BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System、离心机为德国生产的Hettich mikro200R。引物gfpluxForwNot I（5'-gcggccgcataggta aaggagaagaac ttttcact -3'）和引物gfpluxRevNot I（5'-gcggccgct tacgag tggtatttgacgatgtt-3'）由美国Invitrogen公司合成。
1.2.2青枯雷尔氏菌Rs91-GFP的鉴定及荧光检测
1.2.2.1Rs91-GFP的PCR检测引物gfpluxForwNot I和引物gfpluxRevNot I（由瑞典农业大学Janet教授组内博士生设计，该引物可扩增gfp和lux片段的全部序列）。采用灭菌的牙签挑取少许新鲜培养的单菌落加入25 μlPCR反应体系中。25 μlPCR反应体系中含有2 μl10×Buffer；1 μl2 mmol∙L-1dNTPs；1 μl10 μmmol∙L-1引物。所用模板DNA分别为Rs91-GFP基因组DNA、Rs91基因组DNA（阴性对照）、以及质粒DNA（阳性对照）。PCR循环参数为：94℃预变性2 min；进入94℃10 s，60℃30 s，68℃8 min，共10个循环；然后进入94℃15 s，60℃30 s，68℃8 min，共20个循环；最后68℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，上样量为3 μl，最后用Bio-Rad 2000型凝胶成像仪拍摄。
1.2 试验方法
1.2.1青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的gfp基因转化
1.2.1.1质粒的提取参照文献[10]。质粒提取及纯化步骤按QIAGEN质粒大量提取试剂盒提供的方法进行。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2 μl。
1.2.1.2青枯雷尔氏菌感受态细胞的制备从0.1×TSB固体平板上挑取新鲜的青枯雷尔氏菌单菌落于20 ml0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养过夜，按照1%接种比例接入500ml0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养，每1 h测定1次OD600。收集生长中期的培养物于冰水浴中放置30 min后，用无菌水冲洗细胞4次，最后将细胞悬浮于1 ml无菌水中，并在－70℃冰箱保存备用。
1.2.1.4阳性转化子的荧光检测及激光共聚焦显微检测检测方法参照文献[11]。通过观察菌落发出的绿色荧光直接筛选阳性转化子，命名为Rs91-GFP。
Key words:Ralstonia solanacearum;Electroporation;gfp/luxABgene
0 引言
【研究意义】植物细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性的土传细菌病害。青枯雷尔氏菌寄主广泛，可侵染44个科数百种植物[1]。植物青枯细菌致病的分子机制是植物与微生物相互作用机制研究的重要领域之一。在植物根际土壤中和植株体内存在着大量的青枯雷尔氏菌，这给青枯雷尔氏菌侵染致病机理的研究带来了困难。将gfp基因转入青枯雷尔氏菌将有助于研究青枯雷尔氏菌在活体植物体内的侵染过程，建立菌体生物量的直观测定方法，从而为更加深入地研究青枯雷尔氏菌致病机理及青枯病生物防治机制奠定基础。【前人研究进展】绿色荧光蛋白（GFP）最早是从水母中分离出来的，是一种非酶性报告因子，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，作为报告基因，GFP是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一，作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害[2]。GFP检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代[2]。利用GFP标记进行病原菌侵入活体细胞过程的跟踪观察更开创了病理学研究的新时代[3~5]。Unge等[6]的研究证明了荧光与菌体细胞数量呈线性关系，也为通过荧光直接对细菌记数提供了一个方便快捷的方法。gfp基因在其它细菌上的转化有过许多报道，但是，青枯雷尔氏菌gfp基因转化非常困难，国内外许多学者都试图进行青枯雷尔氏菌gfp基因转化，然而，成功的例子非常少，通过NCBI检索，仅见两篇关于gfp基因转入青枯雷尔氏菌的报道[7,8]，一篇是采用自然转化的方法将来自AW1-gfp38菌株的Tn5::gfp转入青枯雷尔氏菌K60[7]，另一篇则采用细胞融合的转录方法将hrp-gfp基因转入GMI1000[8]。【本研究切入点】未见关于采用电击转化法进行青枯雷尔氏菌的gfp基因转化的报道。目前在国内未见关于青枯雷尔氏菌gfp基因转化的报道。【拟解决的关键问题】在本研究中，作者采用带有gfp/luxAB双标记基因的pUT mini-Tn5转座载体，通过电击转化法成功地将它整合到青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）染色体上，并利用荧光显微镜检测GFP在标记菌中表达后发出的绿色荧光，同时进行了转化菌体的gfp基因检测和转化菌株的微生物学异质性检测，研究转化菌株的生物学稳定性，为青枯雷尔氏菌gfp基因转化和致病机理的研
究提供方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1菌株和质粒青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）编号Rs91菌株为本实验室从番茄植株上分离纯化得到并保存。大肠ຫໍສະໝຸດ Baidu菌（Escherichia coli）CC118为转座载体pUTgfp/luxAB的宿主菌，由瑞典农业大学微生物系JanetK.Jasson教授惠赠，其中带有双标记基因gfp/luxAB[9]，质粒图谱见图1。
青枯雷尔氏菌（
车建美
（
摘要：【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记，研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化，采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整个细胞呈现绿色荧光，PCR结果表明，从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到稳定期，荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次，仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致，在番茄组培苗内的侵染路线相同，致病力均达到90%以上。【结论】利用gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌，融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。
Abstract:【Objective】TheRalstonia solanacearumstrain was chromosomally tagged with the marker genesgfpandluxABbyelectroporation. The growth properties and the pathogenicity of the tagged strain and the wild typestrainwere compared in this paper.【Method】TheR.solanacearumstrain was transformed by the electroporation. The condition and processor of the invasion of the GFP-taggedstrainwas observed in the tomato tissue culture plants.【Result】Transformant was screened for the green fluorescence by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0kb fragment of thegfpgene andluxABgene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically, the cells of the engineered strain were similar to wild typestrainas determined by laser scanning confocal microscopy. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly duringthelog phase, but decreased in the stationary phase. The green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. It was the same for the GFP-tagged strian and the wild typestrain inthe culture temperature, pH value and growth curve. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into theR.solanacearumstrain. The pathogenicity of the wild type strain and the GFP-taggedstrainwas over 90% which meansgfpgene had no effect on the pathogenicity.【Conclusion】The GFP-taggedR.solanacearumis obtainedin thisstudy. The growth propertities and the pathogenicity of the GFP-tagged strainis thesame to the wild typestrain.
关键词：青枯雷尔氏菌；电击法；gfp/luxAB基因
GFPTaggingRalstonia solanacearumwithgfp/luxABmini-Tn5
CHEJian-mei1,2, LANJiang-lin1, LIUBo1
(1Agricultural Bioresource Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003;2Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Fujian Agricultrue and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)
图1 质粒pUTgfp/lux图谱
Fig.1 ThemapofpUTgfp/lux
1.1.2培养基、抗生素与试剂大肠杆菌（E.coli）CC118的培养基为LB培养基；青枯雷尔氏菌的培养基为0.1×TSB；质粒大量提取及纯化试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit；抗生素卡那霉素（Kanamycin，Km）购自Sigma公司；电转化仪为Bio-Rad Gene PulserⅡ；立体荧光显微镜（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品。凝胶成像仪BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System、离心机为德国生产的Hettich mikro200R。引物gfpluxForwNot I（5'-gcggccgcataggta aaggagaagaac ttttcact -3'）和引物gfpluxRevNot I（5'-gcggccgct tacgag tggtatttgacgatgtt-3'）由美国Invitrogen公司合成。
1.2.2青枯雷尔氏菌Rs91-GFP的鉴定及荧光检测
1.2.2.1Rs91-GFP的PCR检测引物gfpluxForwNot I和引物gfpluxRevNot I（由瑞典农业大学Janet教授组内博士生设计，该引物可扩增gfp和lux片段的全部序列）。采用灭菌的牙签挑取少许新鲜培养的单菌落加入25 μlPCR反应体系中。25 μlPCR反应体系中含有2 μl10×Buffer；1 μl2 mmol∙L-1dNTPs；1 μl10 μmmol∙L-1引物。所用模板DNA分别为Rs91-GFP基因组DNA、Rs91基因组DNA（阴性对照）、以及质粒DNA（阳性对照）。PCR循环参数为：94℃预变性2 min；进入94℃10 s，60℃30 s，68℃8 min，共10个循环；然后进入94℃15 s，60℃30 s，68℃8 min，共20个循环；最后68℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，上样量为3 μl，最后用Bio-Rad 2000型凝胶成像仪拍摄。
1.2 试验方法
1.2.1青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的gfp基因转化
1.2.1.1质粒的提取参照文献[10]。质粒提取及纯化步骤按QIAGEN质粒大量提取试剂盒提供的方法进行。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2 μl。
1.2.1.2青枯雷尔氏菌感受态细胞的制备从0.1×TSB固体平板上挑取新鲜的青枯雷尔氏菌单菌落于20 ml0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养过夜，按照1%接种比例接入500ml0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养，每1 h测定1次OD600。收集生长中期的培养物于冰水浴中放置30 min后，用无菌水冲洗细胞4次，最后将细胞悬浮于1 ml无菌水中，并在－70℃冰箱保存备用。