青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 绿色荧光蛋白标记探究
应用计算机手段分析植物病原细菌Ralstonia solanacearum的蛋白质序列
摘要 ： 应用 Ｓｇａ ． ＬｐＰ和 ＴｒｅＰ对植物病原细菌 Ｒ ｌｏｉ ｌｎｃａｕ ｉｎｌ ３０。ｉｏ Ｐ ａｇｔ ａ ｔｎ ｓ ａ ａｅｒｍ基因组中的 ３４ ０ Ｏ Ｆ （ ｐｎ ｓ ａｏ ４ 个 Ｒ ｓ ｏｅ ｒ ｄｎ ａ ｅ） 行了信号肽分析 ， ｅ ｉｇ￣ ｍ ｓ进 ａ 同时 系统分析 了信号肽 的类 型及结构 。结果表 明 ， ４ ３ ０个 Ｏ Ｆ ４ Ｒ ｓ中有 ４ ２个 ６ Ｏ Ｆ 所 编码蛋 白质具 有 Ｎ一端有信号肽序列 ， Ｒｓ 其中 ３８个分泌类信 号肽 、０ ４ １０个信 号肽具有 Ｒ Ｒ—ｍ ｔ 信号肽 ， ｏｆ ｉ １ ４个脂蛋 白类信号肽 ， 发现 Ｐｅｉｎｌ ｅ信号肽和 Ｂ ｃ ｒ ｃ ｎ ｈｒｍ ｎ 未 ｒ ｌ —ｋ ｐｉ ｉ ａｔ ｉ ｉ ａｄＰ ｅｏ ｏｅ信号肽 。在 这 ４ ２个具 有可切割 ｅｏ ｎ ６
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青枯病生物防治研究进展
第2卷第4期植物医学2023年8月V o l.2N o.4P l a n tH e a l t h a n dM e d i c i n e A u g.2023D O I:10.13718/j.c n k i.z w y x.2023.04.005青枯病生物防治研究进展刘帅康1,黎听1,丰慧1,张翼飞2,黄宁2,周栗禾1,刘忠伟3,蔡璘11.贵州大学烟草学院/贵州省烟草品质研究重点实验室,贵阳550025;2.贵州省烟草公司贵阳市公司,贵阳550100;3.贵州大学农业生物工程研究院,贵阳550025摘要:青枯病是由青枯雷尔氏菌引发的细菌性病害,是一种重要的植物土传病害,可造成植物大量死亡甚至绝收,危害十分严重,目前尚无有效的解决办法.利用生防菌防治植物病害能够很好地保证无毒㊁安全㊁无公害农业产品的生产.近年来,在青枯病的生物防治方面取得了一定的研究进展.本文着重综述了4种生防菌(芽孢杆菌㊁链霉菌㊁丛枝菌根真菌㊁噬菌体)应用于青枯病的研究进展,阐述了其防治青枯病的原理,指出了生物防治的现存问题及可深入研究的方向,并对青枯病的生物防治作出了展望.关键词:青枯病;生物防治;芽孢杆菌;链霉菌;丛枝菌根真菌;噬菌体中图分类号:S432文献标志码:A文章编号:20971354(2023)04003908A d v a n c e s i nB i o l o g i c a lC o n t r o l o fB a c t e r i a lW i l tL I US h u a i k a n g1, L IT i n g1, F E N G H u i1,Z HA N G Y i f e i2,HU A N G N i n g2,Z HO U L i h e1, L I UZ h o n g w e i3, C A IL i n11.C o l l e g e o f T o b a c c oS c i e n c e o f G u i z h o uU n i v e r s i t y/L a b o r a t o r y o f T o b a c c oQ u a l i t y R e s e a r c h o f G u i z h o u P r o v i n c e,G u i y a n g550025,C h i n a;2.G u i z h o uP r o v i n c eT o b a c c oC o m p a n y G u i y a n g C i t y,G u i y a n g550100,C h i n a;3.A g r i c u l t u r a l B i o e n g i n e e r i n g R e s e a r c h I n s t i t u t eo f G u i z h o uU n i v e r s i t y,G u i y a n g550025,C h i n aA b s t r a c t:B a c t e r i a lw i l t c a u s e db y R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m i s a n i m p o r t a n t s o i l-b o r n ed i s e a s eo f p l a n t,w h i c ho f t e n c a u s e a l a r g en u m b e r o f d e a t ho f p l a n t s o r e v e nn oh a r v e s t o f c r o p,a n d t h e收稿日期:20230325基金项目:黔科合基础-Z K 2023 -096;贵大(国)创字(2022)047号.作者简介:刘帅康,硕士研究生,主要从事植物病害防控研究.通信作者:蔡璘,教授.Copyright©博看网. All Rights Reserved.04植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第2卷h a r mi s v e r y s e r i o u s.T h e r e i s n o e f f e c t i v e s o l u t i o n a t p r e s e n t.B i o c o n t r o l b a c t e r i a c a nb e u s e d t o c o n t r o l p l a n t d i s e a s e s t o e n s u r e t h e p r o d u c t i o no f n o n-t o x i c,s a f e a n d p o l l u t i o n-f r e e a g r i c u l t u r a l p r o d u c t s.I n r e c e n t y e a r s,t h eb i o l o g i c a l c o n t r o l o f b a c t e r i a lw i l t h a s a l s om a d e s o m e p r o g r e s s.I n t h i s p a p e r,t h e r e s e a r c h p r o g r e s so fb i o c o n t r o l b a c t e r i aa p p l i e df o r c o n t r o l o fb a c t e r i a lw i l t w a s s u mm a r i z e d f r o mf o u r a s p e c t s:B a c i l l u s s p p.,S t r e p t o m y c e s s p p.,A r b u s c u l a r m y c o r r h i-z a l f u n g i a n dP h a g e.T h e p r i n c i p l e o f b i o l o g i c a l c o n t r o l o f b a c t e r i a l w i l tw a s e x p o u n d e d.T h e e x-i s t i n gp r o b l e m s a n d f u r t h e r r e s e a r c hd i r e c t i o n s o f b i o l o g i c a l c o n t r o l o f b a c t e r i a lw i l tw e r e p o i n t-e do u t,a n d t h eb i o l o g i c a l c o n t r o l o f b a c t e r i a lw i l tw a s p r o s p e c t e d.K e y w o r d s:b a c t e r i a lw i l t;b i o l o g i c a lc o n t r o l;B a c i l l u s s p p.;S t r e p t o m y c e s s p p.;A r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i;P h a g e青枯病是常见的植物病害,在烟草㊁茄子㊁番茄㊁花生等植株中均可发生,可对品质与产量产生严重影响.青枯病的病原菌是青枯雷尔氏菌(R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m),为一种土传病原细菌,在世界各国广泛分布,寄主植物多达50余科200多个属[1].青枯病发病时环境温度多为20ħ以上,温湿度越高(温度20ħ以上㊁湿度80%以上)发病越严重.青枯病的典型特征是发病时间短,蔓延速度快.植物被青枯雷尔氏菌侵染后,植株顶端幼嫩的组织如幼叶㊁新生叶等出现萎蔫,在叶片还未退黄变枯前,植株快速脱水㊁青枯㊁凋萎.青枯病的病状往往具有一定的规律性,即中午枯萎,在早上和夜晚恢复正常,多次重复发生,枯萎程度会逐渐加剧,直至植株死亡[2].患病植株茎杆中空,茎杆里面的纤维管组织会变成褐色,用力挤压横向切开患病植株基部,切口处会流出白色菌液.在气候干燥㊁温度较高的情况下,几天内植株便会枯萎死亡,叶片颜色变淡,整株植物茎叶保持绿色.烟草青枯病的主要特征为前期传播速度平缓㊁后期急剧.整个病害主要有3个阶段,分别为病害首发期(移栽后43~67d)㊁蔓延期(移栽后67~97d)㊁全面暴发期(移栽后97d至采收)[3].烟草青枯病是典型的维管束病害,主要受害部位在根部,中后期根部发黑腐烂,表皮组织出现叶片萎蔫㊁条斑㊁发黑腐烂.烟草感染青枯病后,茎㊁叶的导管结构变黑,接着病原菌侵入皮层和髓部,外表出现典型的黑色条斑[4].青枯病的防治方法目前主要有培育抗病品种㊁化学防治㊁生物防治等,这些方法能够在一定程度上减少青枯病的发生,但有局限性.目前还未筛选出能有效抗青枯病的植株品种,且抗病品种较少,选育过程复杂,难度较大,存在抗性效果较差㊁抗性较易消失的缺点.青枯病难以依靠杀菌剂彻底根除[5],大量使用农药会带来一系列的安全问题.随着人们观念的发展,对青枯病的防治也提出了更高的要求,在有效防治青枯病的基础上,还需符合现代农业的发展要求.生物防治是一种绿色无污染的防控技术,通过一些特定生物及其代谢产物防治病虫害㊁杂草等,符合绿色发展的宗旨[6].目前已开发为生物农药的生防细菌主要有假单孢杆菌属(P s e u d o-m o n a s s p p.)㊁芽孢杆菌属(B a c i l l u s s p p.)㊁土壤杆菌属(A g r o b a c t e r i u m s p p.)㊁产碱菌属(A l-c a l i g e n e s s p p.)和链霉菌属(S t r e p t o m y c e s s p p.)等[7].随着对植物病害生物防治研究的深入,越来越多的生防真菌被发现和应用,如盾壳霉(C o n i o t h y r i u m m i n i t a n s)㊁酵母(S a c c h a r o m y c e s)㊁菌根真菌(M y c o r r h i z a l f u n g i)等[8].生物防治具有安全㊁绿色㊁无污染等优点,通过利用生物之间产生的物质来抑制病原菌的生长,从而减弱病害的影响,能够起到长期控制病虫害的作用.目前生物防治是防治青枯病的热点方式,并取得了一定的成果,防治青枯病的生防菌主要包括芽孢杆菌㊁链霉菌㊁丛支菌根真菌及噬菌体病毒等.1芽孢杆菌芽孢杆菌具有易保存㊁繁殖能力强㊁易培养的特点,相较于其他的生防菌更加受到商家及Copyright©博看网. All Rights Reserved.研究单位的重视.芽孢杆菌属为土壤中的优势细菌属,对农作物的生长发育具有促进作用.G u o 等[9]研究发现v e l e z e n s i s 芽孢杆菌B a 168对烟草黑胫病的生物防治作用(图1).目前防治青枯病的芽孢杆菌主要有巨大芽孢杆菌(B .m e g a t e r i u m )㊁枯草芽孢杆菌(B .s u b t i l i s )㊁凝固芽孢杆菌(B .c o a g u l a n s )㊁多黏芽孢杆菌(B .p o l y m yz a )㊁蜡状芽孢杆菌(B .c e r e u s )等.图1 v e l e z e n s i s 芽孢杆菌B a 168对烟草黑胫病的防治作用[9]植物根基促生菌(P l a n tG r o w t hP r o m o t i n g R h i z o b a c t e r i a ,P G P R )是土壤中能够直接或间接促进植物生长的微生物[10],能与病原菌产生拮抗作用[11],诱导植物抗性系统(I n d u c eS y s -t e m i c r e s i s t a n c e ,I S R )[12].贝莱斯芽胞杆菌(B a c i l l u s v e l e z e n s i s )是芽孢杆菌中的一个新种,备受研究者的关注,贝莱斯芽孢杆菌具有广泛的抑菌活性,被广泛应用于防治植物病害[13].余水等[14]的研究发现,贝莱斯芽孢杆菌MT 310对烟草赤星病菌(A l t e r n a r i aa l t e r n a t a )的抑菌率可达68.76%.贝莱斯芽孢杆菌能促进黄瓜㊁马铃薯㊁辣椒等的生长,能够有效抑制赤星病菌㊁青枯病菌等病原菌的生长[15].贝莱斯芽孢杆菌能够促进植物的生长㊁抑制病原菌㊁提高宿主的免疫能力等,被广泛地应用于农作物病害的防控.周向平等[16]的研究表明,贝莱斯芽孢杆菌F 10能够显著降低烟草青枯病的发病率与病情指数,还能够促进烟株大田生长,改善烤烟的农艺性状,提高烟叶的等级,从而提高经济效益.枯草芽孢杆菌抑菌谱广,除了对植物生长的促进作用外,还对多种植物病害有良好的防治效果[17].甘金佳等[18]的研究表明,100亿芽孢杆菌/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂能够对西红柿植株根部土壤中的青枯病病原菌的数量产生影响.王丽丽等[19]的研究发现,枯草芽孢杆菌可调节土壤中其他微生物的数量结构,可实现西红柿青枯病防治的目标,减少病害的发生;施用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂能够显著降低西红柿根部土壤中的青枯病病原菌数量,对根部细菌数量具有先抑制后促进增长的作用,而对真菌数量具有先促进后抑制的作用;对放线菌的数量具有显著促进增长的作用,使土壤微生物朝着有利于西红柿健康生长的方向进行.2 链霉菌自然界绝大多数抗生素由链霉菌产生,利用链霉菌对青枯病进行防治较为普遍.E l -A b ya r d 14第4期 刘帅康,等:青枯病生物防治研究进展Copyright ©博看网. All Rights Reserved.等[20]研究发现,交替使用链霉菌菌株极美链霉菌(S .pu l c h e r )㊁灰白链霉菌(S .c a n e s c e n s )和柠檬荧光链霉菌(S .c i t r e c o f l u o r e s c e n s )对种子进行包衣处理,在42~63d 可成功地控制R a l s t o -n i a s o l a n a c e a r u m 引发的青枯病.X i a o 等[21]研究发现S t r e p t o m y c e s s p .F X 13能够在体外和体内通过产生寡霉素A 抑制抗杀菌剂葡萄孢菌(B o t r y t i s c i n e r e a ),显示出其对灰霉病的生物防治潜力(图2).图2 寡霉素A 抑制A T P 酶和A T P 含量,诱导R O S 积累,抑制葡萄孢菌的生长[21]娄彻氏链霉菌(S t r e p t o m y c e s r o c h e i )是一种放线菌.李威等[22]研究发现,娄彻氏链霉菌X L -6是对茄子青枯病菌有强抑制作用的放线菌菌株,菌株X L -6的发酵液中含有的抑菌活性物质在70ħ以下具有较强的抑菌活性,p H 值5~8时对青枯菌有较强的抑制效果.发酵液中的抑菌物质不受蛋白酶㊁紫外线的影响,娄彻氏链霉菌X L -6的发酵产物在不同环境条件下对青枯菌的抑制效果具有稳定性.链霉菌对多种植物的青枯病具有较好的防治效果,但大多单一菌株的防治时间较短,防治效果不理想.通过利用不同生长条件㊁生态适应性与作用机制等特点拮抗菌株的共同作用,从而提高防病效果与稳定性[23].灰锈赤链霉菌(F X 81)菌株的生态适应性强,深红紫链霉菌(F X 28)菌株有较强的抑制病菌孢子萌发的能力,F X 81与F X 28菌株之间无明显的拮抗作用,两菌株之间具有较强的亲和性,将两菌株以相同比例复合发酵㊁培养后发现其对番茄青枯病的抑菌圈平均直径显著大于单一菌株抑菌圈平均直径[24],将F X 81与F X 28菌株复合具有良好的防控青枯病病菌的效果.3 菌根真菌菌根真菌能够与植物的根系紧密结合,在植物根系内外均有分布,增加植物与周围环境之间的联系.E l -S h a r k a w 等[25]的研究发现,丛枝菌根真菌(A r b u s c u l a rm y c o r r h i z a l f u n gi )㊁哈茨木霉(T r i c h o d e r m ah a r z i a n u m )和荧光假单胞菌(P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s )协同处理最大程度(80%)地降低了豌豆尖孢镰刀菌(F u s a r i u mo x y s po r u m )对植物的危害程度(图3),因此可以用丛枝菌根真菌来防治青枯病.24植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.图3 丛枝菌根真菌㊁哈茨木霉和荧光假单胞菌对豌豆尖孢镰刀菌的防治[25]丛枝菌根真菌是广泛分布于土壤中的一类真菌,能与大多数植物形成共生关系[26].刘先良等[27]研究发现,丛枝菌根真菌对感染烟草青枯病的幼苗具有一定的保护作用,能够提高烟草幼苗的株数㊁叶片过氧化物酶的活性㊁磷含量及M D A 含量等,可有效降低烟草青枯病的发病率和病情指数,提高植株对烟草青枯病的抗性.4 噬菌体噬菌体(P h a ge )是一类能够侵扰细菌的一类病毒,具有宿主特异性,是病毒中分布最普遍㊁最广泛的一类.噬菌体对人体的健康菌群不会造成任何伤害,因此噬菌体在医学方面具有较高的特异性[28].噬菌体可以对宿主细菌实现精准裂解,可用于靶向治疗,具有易分离㊁特异性强㊁扩增速度快㊁易保存和生产㊁有自我复制的局限性㊁不易形成抗性等特点[29-30].H o l t a p p e l s 等[31]报道了一种基于噬菌体的预防性种子治疗,这种治疗能够限制病原体的影响(图4).图4 噬菌体对病原菌侵染植物的影响[31]青枯雷尔氏菌通常是从感染青枯病的植株根部土壤中筛选获得[32].T a n a k a 等[33]报道了青枯病菌噬菌体对烟草青枯病具有良好的防治效果,当R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m M 4S 菌株与感染该菌株的噬菌体共同施用时,能够使发病率从对照组的95.8%降低至14.5%.J o h n s o n 等[34]的34第4期 刘帅康,等:青枯病生物防治研究进展Copyright ©博看网. All Rights Reserved.44植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第2卷研究发现,从河水中分离的噬菌体能够在自然条件下通过灌溉水防治由青枯雷尔氏菌引起的植物枯萎病.噬菌体能够明显降低植物枯萎病的发病率和环境水样中病原菌的含量.但是,目前利用青枯雷尔氏菌噬菌体防治青枯病仍面临2个主要的问题,首先是青枯病病原菌能够分泌大量胞外多糖阻止噬菌体的吸附,其次是噬菌体有高效的特异性,治疗性噬菌体往往对某一型或者几型的细菌有效[35],对其他细菌的防治效果较弱或者没有作用,使噬菌体的大量应用受到限制.5问题与展望目前青枯病的防治仍是农业生产上的一个难题,还没有有效防治青枯病的化学试剂.生物防治亦难以应用,主要原因有生防菌在大田条件下不稳定㊁受环境因素影响多㊁防治时间短,以至于达不到彻底防治的目的.青枯雷尔氏菌是一类易发生变异的土传细菌,其在田间生理生化特征㊁菌体形态㊁致病性等方面都存在差异[36].尽管国内外学者在青枯病领域已经取得了研究进展,但仍然有不少问题亟待解决.本文介绍的4种生物防治方法目前仍处于试验阶段,在农业生产实践中应用较少,对青枯病的防治效果还存在一定的问题,如在田间条件下防治效果不太稳定㊁有关其生物安全性的研究较少等.芽孢杆菌的抑菌谱较广,对多种植物病害均有一定的防控效果.唐萍等[37]通过研究发现,贝莱斯芽孢杆菌D J85对昆明小鼠表现出无毒㊁无溶血性㊁无刺激性㊁无致病性,而且对红霉素㊁青霉素G㊁诺氟沙星等抗菌药物敏感,表明贝莱斯芽孢杆菌D J85具有较高的生物安全性.链霉菌能够产生抗生素来抑制植物病原菌,但易受环境条件的影响,将其与杀线中剂复配能够弥补二者的不足,既能增强链霉菌的稳定性,又能充分发挥链霉菌与杀线剂的协同作用,减少农药使用[38].学者们推测菌根真菌防治青枯病的原理为,菌根真菌独特的生长状态和其占有的生态位能够形成一种机械屏障,阻止病原菌对寄主的侵入,不仅可以达到防治青枯病的目的,还可以增强植株对环境的适应性.噬菌体具有宿主特异性,能够使其具有环境安全性,但治疗谱较窄;而且,噬菌体对环境的适应能力有限,更倾向于感染同一土壤的细菌;此外,应用噬菌体防治时,其作用时间和剂量难以掌控[39].但随着分子手段在噬菌体改造上的应用,开发出高效㊁使用方便㊁无污染的噬菌体制剂只是时间上的问题[40].青枯病的防治一直是农业生产领域的重点,化学农药防治青枯病的效果有限,化学农药的长期及不合理的施用也会带来许多社会问题和环境问题.生物防治可以弥补化学防治的缺点,但仍有许多的问题尚待解决.随着技术的不断完善和深入,相信青枯病生物防治的前景是相当广阔的.参考文献:[1]K AWA S A K IT,S A T S UMA H,F U J I E M,e ta l.M o n i t o r i n g o f P h y t o p a t h o g e n i cR a l s t o n i aS o l a n a c e a r u mC e l l sU s i n g G r e e nF l u o r e s c e n t P r o t e i n-E x p r e s s i n g P l a s m i dD e r i v e d f r o m B a c t e r i o p h a g e p h i R S S1[J].J o u r n a l o fB i o s c i e n c e a n dB i o e n g i n e e r i n g,2007,104(6):451-456.[2]赵灿.探究番茄青枯病的生物防治策略[J].农村实用技术,2020(6):68-69.[3]黎妍妍,王林,孙光伟,等.清江流域烟区烟草青枯病流行时间动态及气象因素分析[J].中国烟草学报,2017,23(4):77-83.[4]赵冏炅,曾德武,彭孟祥,等.烟草青枯病防治研究进展[J].湖南农业科学,2021(5):108-110,114.[5]何洪令,李钠钾,孙成成,等.烟草青枯病的生物防治研究进展[J].植物医生,2021,34(2):4-8.[6]王永生.生物防治技术的意义与应用[J].农业工程技术,2021,41(14):49-50.Copyright©博看网. 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All Rights Reserved.64植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第2卷o fP h y t o p a t h o l o g y,2007,45:245-262.[31]HO L T A P P E L SD,F O R T U N A K,L A V I G N E R,e t a l.T h eF u t u r eo fP h a g eB i o c o n t r o l i nI n t e g r a t e dP l a n tP r o t e c t i o n f o r S u s t a i n a b l eC r o p P r o d u c t i o n[J].C u r r e n tO p i n i o n i nB i o t e c h n o l o g y,2021,68:60-71.[32]侯玉刚.青枯菌专性噬菌体的筛选及其防控番茄土传青枯病的效果研究[D].南京:南京农业大学.[33]T A N A K A H,N E G I S H IH,MA E D A H.C o n t r o l o fT o b a c c oB a c t e r i a lW i l t b y a nA v i r u l e n t S t r a i no f P s e u d o-m o n a sS o l a n a c e a r u m M4Sa n dI t sB a c t e r i o p h a g e[J].J a p a n e s e J o u r n a l o fP h y t o p a t h o l o g y,1990,56(2):243-246.[34]J OHN S O N R,G Y L E SC,HU F F W,e t a l.B a c t e r i o p h a g e s f o rP r o p h y l a x i s a n dT h e r a p y i nC a t t l e,P o u l t r y a n dP i g s[J].A n i m a lH e a l t hR e s e a r c hR e v i e w s,2008,9(2):201-215.[35]陈志龙,陈杰,许建平,等.番茄青枯病生物防治研究进展[J].江苏农业科学,2013,41(8):131-134.[36]王震,郭爱玲,冯莉.青枯病生物防治的研究进展[J].中国生物防治,2007,23(S1):82-86.[37]唐萍,代飞燕,吴毅歆,等.贝莱斯芽孢杆菌D J B5的生物安全性评价[J].南方农业学报,2019,50(12):2720-2727.[38]黑雅娅,杨树,张欣,等.娄彻氏链霉菌Z Z-9与阿维菌素复配对南方根结线虫病的防治效果[J].中国瓜菜,2022,35(5):96-101.[39]杨红武,张胜,符昌武,等.青枯雷尔氏菌噬菌体的研究与应用进展[J].生物灾害科学,2022,45(3):283-291.[40]高苗.青枯雷尔氏菌噬菌体的分离鉴定及应用研究[D].北京:中国农业科学院.责任编辑苏荣艳Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
几种生物菌剂防治烟草青枯病药效试验
几种生物菌剂防治烟草青枯病药效试验作者：张仁军魏刚杨兆忠来源：《现代农业科技》2019年第06期摘要; ; 为了筛选出高效防治烟草青枯病的生物菌剂，本试验选用3种复合生物菌剂进行了田间防效试验。
结果表明，以每株烟塘施复合放线菌肥20 g作为基肥的效果最佳，不仅能够促进烟株的生长，且对青枯病的相对防效达81.34%，与烟草青枯病防控的常规农艺措施相比，相对防效显著提高。
本研究结果为田间防治烟草青枯病提供了一种有效的生物防控措施，同时为烟草土传病害的绿色防治提供了一定的数据支撑。
关键词; ; 生物菌剂;复合放线菌肥;烟草青枯病;防效中图分类号; ; S435.72; ; ; ; 文献标识码; ; A; ; ; ; 文章编号; ;1007-5739（2019）06-0079-03Abstract; ; Three compound bio-fungicides were selected for field control experiments in order to select effective bio-fungicides against tobacco bacterial wilt.The results showed that the application of 20 g compound actinomycete fertilizer per plant as the base fertilizer was the best，which could not only promote the growth of tobacco plants，but also could effectively control the bacterial wilt. The relative control effect for bacterial wilt was up to 81.34%，which was higher than the conventionalagronomic measures.The results of this study provided an effective biological control measure for the control of tobacco bacterial wilt in the field，and supported the green bio-control of soil-borne disease in tobacco.Key words; ; bio-fungicides;compound actinomycetes fertilizer;tobacco bacterial wilt;control effect烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种细菌性维管束病害，俗称烟瘟、半边疯，其症状表现为半边萎蔫、半边正常，病情加重时茎杆外表呈现出黑色条斑，髓部常见白色菌脓并带有一股腐臭味。
不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响
不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响作者：谭军刘雨虹刘影萨爽王瑞赵秀云来源：《中国烟草科学》2014年第01期摘要：青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是烟草青枯病的病原菌。
为有效防治青枯病，研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响；并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、HCO3-、SO42-对青枯雷尔氏菌生长的影响。
结果表明，青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好，青枯雷尔氏菌最适生长温度为25~45 ℃；高浓度的Zn2+和Cu2+能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长，其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用。
关键词：青枯雷尔氏菌；影响；生长条件；烟草中图分类号：S572.08 文章编号：1007-5119（2014）01-0085-04DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.016Effects of Different Conditions on Growth of Tobacco Ralstonia SolanacearumTAN Jun1, LIU Yuhong2, LIU Ying2, SA Shuang2, WANG Rui1*, ZHAO Xiuyun2(1. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445000, China;2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)Abstract: Ralstonia solanacearum is a one of tobacco bacterial wilt pathogens. In order to identify strategies of effective prevention and treatment of bacterial wilt, the effects of different culture conditions, including pH, temperature, N, P, K, Zn2+, Cu2+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, SO42- on the growth of R. solanacearum were investigated. The results showed that R. solanacearum grew better in slight acidic or alkali condition. The optimum growth temperature of R. solanacearum was between 25 and 45 ℃. High concentrations of Zn2+ and Cu2+ could inhibit the growth of R. solanacearum.Keywords: Ralstonia solanacearum ; effect; growth conditions; tobacco基金项目：湖北省烟草公司（专卖局）项目“烟草青枯病病原菌生物学特性及综合防控技术研究与示范”（027Y2013-002）作者简介：谭军，男，农艺师，主要从事烟草栽培与病虫害综合防治。
海南桑树青枯病病原菌鉴定及其分子鉴定
热带作物学报2021, 42(11): 3261 3268 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2020-12-10；修回日期 2021-02-21基金项目 现代农业产业技术体系专项资金（No. CARS-18-SYZ17）；中国热带农业科学院基本科研业务费专项（No.1630042019021）；海南省自然科学基金高层次人才项目（No. 2019RC275）。
作者简介 娄德钊（1994—），男，硕士，研究方向：植物病理学。
*通信作者（Corresponding author ）：王树昌（WANG Shuchang ），E-mail ：************************。
海南桑树青枯病病原菌鉴定及其分子鉴定娄德钊1,2，武华周2，卢芙萍2，耿 涛2，涂娜娜1,2，王树昌2*1. 海南大学，海南海口 570228；2. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口 571101摘 要：桑树青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的细菌性病害，热带、亚热带地区发病严重，严重影响蚕桑产业的可持续发展。
雷尔氏菌不同种间致病力和宿主各不相同，其防治策略也相应不同，准确地分离鉴定病原菌是青枯病有效防控的先决条件。
本研究采集、分离了海南省琼中县桑青枯病发病桑园（‘桂桑优62’）桑树根部、茎部病原菌，并通过致病性、生理小种、生化变种测定，结合16S rDNA 、特异性引物、复合PCR 检测体系、序列变种等分子鉴定方法初步确定了病原菌的种类和分类地位。
结果表明，引发海南省琼中县桑青枯病的病原菌属于青枯雷尔氏菌（Ralstonia so-lanacearum ）、生理小种5（race 5）、生化变种Ⅴ（biovar Ⅴ），病原菌遗传进化分析结果显示病原菌属演化型Ⅰ（phylotype Ⅰ）即亚洲分支菌株，序列变种12（sequevar 12）。
这些结果将为海南桑青枯病的有效防控奠定基础。
新形势下烟草青枯病发生特点与防治技术措施
第1卷第1期植物医学2022年2月V o l.1N o.1P l a n tH e a l t h a n dM e d i c i n e F e b.2022D O I:10.13718/j.c n k i.z w y x.2022.01.013新形势下烟草青枯病发生特点与防治技术措施祖庆学,聂忠扬,林松,饶陈,张翼飞,杨超,刘杰贵州省烟草公司贵阳市分公司,贵阳550001摘要:细菌性青枯病是烟草主要的三大根茎类病害之一,严重威胁着烟草健康生长,给烟草生产造成重大的经济损失.本文从发生特点㊁流行规律与防治技术对青枯病进行了综述,简要阐述了烟草青枯病发生危害与流行趋势,并从农业栽培措施㊁生物防治㊁化学防治3个方面论述了烟草青枯病的防治技术手段.关键词:烟草青枯病;发生特点;流行规律;综合防治中图分类号:S435.72文献标志码:A文章编号:20971354(2022)01009007A d v a n c e s i nC o n t r o l o fT o b a c c oB a c t e r i a lW i l tZ U Q i n g x u e, N I EZ h o n g y a n g, L I NS o n g, R A O C h e n,Z HA N G Y i f e i, Y A N GC h a o, L I UJ i eG u i y a n g B r a n c hC o m p a n y o f G u i z h o uT o b a c c oC o m p a n y,G u i y a n g550001,C h i n aA b s t r a c t:T o b a c c ob a c t e r i a lw i l t i s o n e o f t h e t h r e em a i n r h i z o m e d i s e a s e s o f t o b a c c o,w h i c h s e-r i o u s l y t h r e a t e n s t h eh e a l t h yg r o w t ho f t o b a c c o a n d c a u s e s s i g n i f i c a n t e c o n o m i c l o s s e s o f t o b a c-c o p r o d u c t i o n.T h i sr e v i e ws u mm a r i z e s t h eo c c u r r e n c ec h a r a c t e r i s t i c s,e p i d e m i cr e g u l a r i t y a n d c o n t r o l t e c h n i q u e s o f b a c t e r i a lw i l t,b r i e f l y d e s c r i b e s t h eo c c u r r e n c ea n de p i d e m i c t r e n do f t o-b a c c ob a c t e r i a l w i l t,a n d d i s c u s s e s t h e t e c h n i c a lm e a s u r e s f o r p r e v e n t i n g a n d c o n t r o l l i n g t o b a c c ob ac t e r i a lw i l t i nt e r m so fa g r i c u l t u r a lc u l t i v a t i o n m e a s u r e s,b i o l o g i c a lc o n t r o l,a n dc h e m i c a lc o n t r o l.I t i s p r o p o s ed t h a t t he p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l of t o b a c c o b a c t e r i a l w i l t s h o u l d b e a d a p t e d t o l o c a l c o n d i t i o n s a n d f o c u s o n t h e i m p o r t a n c e o fg r e e n p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l,i n o r d e r t o p r o-v i d e a r e f e r e n c e f o r th e c o n t r o l o f t o b a c c ob a c t e ri a lw i l t i nC h i n a.K e y w o r d s:t o b a c c ob a c t e r i a lw i l t;o c c u r r e n c e c h a r a c t e r i s t i c s;e p i d e m i c r e g u l a r i t y;c o m p r e h e n-s i v e c o n t r o l烟草在生长过程中易受各种生物侵染而感病,尤其是茄科雷尔氏菌(R a l s t o n i a收稿日期:20211027基金项目:贵阳市烟草公司科技项目 基于黑胫病/青枯病群体结构的烟草绿色防控技术研究 .作者简介:祖庆学,农艺师,主要从事烟草科技管理工作.s o l a n a c e a r u m )引起的烟草青枯病是烟草三大土传病害之一[1],它是一种细菌性植物病害,能够侵染50多个科㊁数百种植物,我国已有30个省份报告有青枯病发生,其中烟草青枯病在22个主要烟区中的14个地区广泛发生,对烟草行业危害巨大[2].该病害发病率通常为15%~35%,但与其他根病相关时可高达75%,在潮湿和单作烟草地区极端暴发期间,减产幅度为50%~60%,甚至达100%[3].目前,在我国植烟区,烟草青枯病均有不同程度发生,且部分区域呈现加重趋势.本文介绍了烟草青枯病的危害特征与发生趋势,并对目前烟草青枯病的防治技术进行了总结,旨在为烟草青枯病的防控提供参考.1 烟草青枯病的发生概况1.1 烟草青枯病发生和危害烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m E FS m i t h )引起的一种重要的土传病害,该病原菌为假单胞杆菌属,革兰氏染色阴性,其菌体短杆状,两端钝圆,大小为(0.9~2)μmˑ(0.5~0.8)μm ,具1~3根极生鞭毛,无内生孢子及荚膜,好氧气性细菌,在厌氧的条件下培养,其致病力将迅速丧失[4].病原菌主要从根部进入,沿着维管束向上部侵染.病害发生早期,被病菌侵染的烟株一侧叶片出现萎蔫,而另一侧表现正常[5].随着病情发展,烟草茎秆上出现典型的黑色条斑,直至黑色条斑扩展到整株,拨开可见烟株发病一侧根部变黑腐烂,未显症一侧表现正常[6].在湿度大的条件下,用力挤压发病部位可出现黄白色汁液[7].感病烟叶烘烤后,单叶质量减少,颜色青杂㊁光滑㊁化学成分不协调;在病烟叶半片变黄或者全叶变黄后采烤的烟叶,叶色半片杂色或者整片杂色,失去经济价值,对烟草行业造成巨大的经济损失[8].对全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调研报告显示,除了吉林和黑龙江两省尚无烟草青枯病分布外,其他烟区均有不同程度的烟草青枯病的发生,其中云南㊁贵州㊁广西等地区普遍发生,而福建的永定㊁宁化㊁沙县㊁清流等县则成为重发区,平均发病率为13.3%~94.9%[9-10].1.2 烟草青枯病流行规律与影响因素青枯雷尔氏杆菌主要在土壤㊁感病寄主植物残体中越冬,或侵染其他寄主越冬.病菌大多从烟株根部的伤口侵入,在烟苗移栽和田间卫生管理过程中,此类损伤更有利于病菌侵入.在烟草大田管理期,病原菌借助灌溉水㊁生产用具或病苗等在田间扩展,尤其连续强降雨天气更有利于该病原菌的侵染和暴发.烟草青枯病流行主要受以下环境气候㊁土壤㊁品种等因素影响.1.2.1 环境气候因素环境气候因子影响最为显著,烟草青枯病属于典型的高温高湿型病害.该病害主要发生在热带㊁亚热带地区,呈现自西向东㊁由北向南初始发病期逐渐提早,病情逐年加剧的趋势.前人研究表明,烟草青枯病在广东烟区4月上旬即可零星发生,在5月底至6月初进入病害暴发期,且病情随着降雨天数增加和气温升高而加重[11-13].1.2.2 土壤因素不同类型的土壤对烟草青枯病发生流行具有重要影响,水田烟地相较干旱烟地发病轻,地势高较地势低的烟地发病较轻,碱性土壤较酸性土壤发病轻,低洼积水区域㊁烟地入水口或水流流经处发病严重,易板结的黏质土壤或含沙量过高的土壤更利于病害的发生和流行[7].进一步研究表明土壤中含较高浓度的速效钾㊁重碳酸根㊁硫酸根离子以及土壤阳离子交换量处于较高水平时,将有助于病情的控制[14].1.2.3 抗病品种抗病品种的选育对烟草青枯病防治具有投入少㊁易推广等优点.美国最早针对烟草青枯病19第1期 祖庆学,等:新形势下烟草青枯病发生特点与防治技术29植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第1卷进行抗病品种的选育,首次培育出较高抗性的 T I448A 品种.刘勇等[15]采用病圃发病及人工接种试验证明上述品种具有良好的抗病能力;吴海乔[16]对不同抗病品种进行筛选时认为岩烟97存在显性抗病基因;郑继法等[17]则筛选出N C95,N C82H和O x f o r d26等抗病品种.2烟草青枯病的防治技术措施烟草青枯病的防治手段主要有优化栽培措施㊁化学防控和生物防控等.目前,仍以化学防治为主,优化栽培措施为辅.近年来生物防治被普遍用于青枯病防治,是未来重点发展方向.随着人类环保意识的增强和绿色发展理念的普及,青枯病的防治也必须要走绿色防控道路.在烟株生长过程中,通过土壤翻耕㊁高起垄培等措施优化栽培条件,促进烟株健壮生长,从而提高烟株抗病能力.青枯病发生时,及早施用生物菌剂或高效㊁低毒㊁低残留的化学药剂进行防控,减轻病害发生发展程度.2.1优化栽培措施2.1.1选育抗病品种培育抗病烟草品种是防治烟草青枯病的重要手段之一.自2000年以来,美国北卡罗来纳州对不同烟草品种的抗青枯病能力进行测试和选育,其中 N C196 C C27 等品种表现出与 K346 一致的抗病能力[18-19].唐元满[20]和陆宁等[21]对12个烟草品种进行抗病能力的鉴定,筛选到 K326 贵烟 等品种对青枯病具有良好的抗性;随后匡传福等[22]对54个烟草品种青枯病的抗病能力进行鉴定分析比较,结果表明, T1448A C V91 大晒烟 K326 等品种对青枯病有一定抗病性,但抗病品种的在田间生长受到多方面因素制约,一是品种的抗病能力与连锁累赘,二是品种的产量与品质等重要性状,三是气候与土壤等生长环境条件.因此,培育高品质且能有效抗青枯病的烟草品种还需要更多的研究和探索.2.1.2优化耕作体系和强化田间管理烟草青枯病菌能够在土壤中越冬,随着漂浮育苗技术的完善和推广,苗床期已基本没有烟草青枯病的发生[23].烟田要选择地势高㊁砂壤土㊁水利基础设施齐全㊁排灌方便的田地种植烟草,同时要避开烟草青枯病发病严重的地块.高畦栽培,挖设排水灌溉沟渠,可有效避免雨后积水的形成㊁降低侵染概率.发现被感染的烟株应当立即拔除并带出烟田集中进行处理,同时对病穴撒施少量的生石灰进行消毒,切忌将病株随意扔在烟地,以减少烟草青枯病菌传播蔓延的机会.轮作的好处是保持土壤结构和有机质,减少土壤侵蚀,这通常与连续行作物有关.与同一易感宿主植物连作将导致建立特定的植物致病种群,而轮作避免了这种不利影响,可减少由土传病原体引起的植物病害[24].合理轮作是提高烟草品质和减少烟草病害危害风险的有效措施,选用与青枯病菌非寄主植物轮作,避免与马铃薯㊁番茄㊁辣椒㊁花生㊁芝麻及姜类等作物轮作,优先选择禾本科作物[25].田间湿度大的烟地可进行揭膜处理和进行培土,以便降低土壤湿度从而减缓青枯病的蔓延和降低发生率[26].2.1.3营养调控和肥料应用生物有机肥是指以动植物残体(如畜禽粪便㊁农作物秸秆等)为原料并通过无害化处理㊁腐熟的有机物料,与特定的微生物复合而成的一类具有微生物和有机肥效应特点的材料,具有环境友好㊁促进植物生长发育㊁改善土壤微生物等特点[27].近年来已有研究报道了利用生物有机肥控制烟草青枯病,并取得了很好的防治效果[28].杨天杰等[29]的研究表明施用生物有机肥可显著降低番茄土传青枯病的发病率,但不同原料制备的生物有机肥对番茄抵抗土传青枯病和促生的效果不同.生物有机肥在水稻㊁玉米㊁小麦㊁马铃薯㊁烟草等作物上的应用,实现了环境保护和资源可持续利用,符合当代绿色农业可持续发展的理念[30-34].合理施用生物有机肥能够有效地防控烟草青枯病,其主要作用机理是通过影响土壤微生物的种类和分布,使土壤有益微生物优先占领生态位,从而抑制青枯菌侵染.另外,生物有机肥还可以改善土壤p H 值㊁氧化还原电位和土壤酶活性,间接抑制青枯病的发生[35].生物有机肥与土壤改良剂搭配使用可降低青枯病发病率.青枯菌拮抗生物有机肥与深施石灰消毒相结合的方法不仅促进了烟草的生长发育,也有效遏制了烟草青枯病的发生.进一步的机制研究发现,生物有机肥是通过改善土壤微生物群落和土壤酶活,促进土壤有益微生物,如鞘氨醇单胞菌属(S p h i n g o m o n a s )㊁类芽孢杆菌属(P a e n i b a c i l l u sA s h ,P r i e s t &C o l l i n )㊁耐热芽孢杆菌(B a c i l l u s )㊁梭菌属(C l o s t r i d i u m P r a z m o w s k i )等的增殖,从而对青枯病起到一定的抑制作用[36-38].同时,生物有机肥可促进烟株的生长发育,诱导植株产生抗病性,增强抗逆性,减少青枯病的发生和危害,提高烟叶产量和质量.在生物有机肥育苗试验中,采取不同生物有机肥组合模式,可提高烟苗地上部和地下部质量.选用育苗与移栽土壤双重使用B I O 模式对烟草青枯病的防控效果明显[39].同时,针对烟草发育不同时期对肥料的需求不同而应适时适量补充钾肥和磷肥.钾肥能够促进烟草根系分泌酚酸类物质,从而有效遏制致病菌的生长繁殖,利于防控烟草青枯病的发生及大量暴发,硅肥的适量施用对烟草青枯病也具有一定防治作用[40-41].在管理措施上,在前年休耕期可对烟地进行冬翻晒白,可以有效改善土壤理化性质[42].2.1.4 合理调节土壤理化性质良好的土壤环境可以作为农作物健康生长的基础,而土壤酸化㊁板结等是引发烟草青枯病的因素之一[43].p H 值是土壤重要的理化指标,可影响土壤理化环境多个方面,如调节土壤有效养分含量,调节土壤微生物群落结构,调控土壤中各种酶活性,可促进烟株根系活动进而影响植株生长等[44].通过改善土壤酸碱性质,不仅可以为植物生长提供合适的土壤微生态,还能有效减轻烟草青枯病的危害[6].生石灰是最常见的土壤酸化改良剂,可在短时间内调节土壤p H 值,有助于氮㊁钙㊁镁㊁硫㊁硅等肥料的有效含量增加.调节烟田土壤p H 值可增加好气性纤维素分解菌㊁放线菌的种类和数量,提高酸性磷酸酶㊁脲酶㊁纤维素酶及过氧化氢酶活性[45].除生石灰外,还有白云石粉C a M g (C O 3)2㊁牡蛎粉㊁草木灰㊁天然沸石㊁磷石膏㊁粉煤灰㊁磷矿粉和碱渣等土壤改良剂[46-48].有机肥可通过分解有机质有效缓解土壤偏酸或偏碱的难题,同时腐殖质可与土壤中矿质胶体相结合,形成有机-无机复合胶体,增强土壤的缓冲能力,进而在一定程度上减少青枯病菌的侵染[49].2.2 化学防控目前针对烟草青枯病的化学防治药剂种类有噻菌铜㊁溴菌腈㊃壬菌铜㊁乙蒜素㊁氢氧化铜㊁石硫合剂㊁乙霜清㊁青枯灵和灭菌净等.这些杀菌剂主要为无机农药㊁有机氯㊁有机铜㊁有机硫类,按照农药作用方式又分为专化型内吸杀菌剂㊁保护性杀菌剂以及土壤消毒剂[50].氢氧化铜㊁乙蒜素㊁石硫合剂等为保护性杀菌剂,常采用灌根等方式施用,从而达到抑制病原菌侵染烟草的目标.这类农药的优点是持效期长㊁作用位点多㊁不易产生抗药性,但对于已发生侵染的病原菌防控效果差[51].施用石硫合剂可有效防控烟草青枯病,与传统的农用链霉素相比防治效果高出22.7个百分点,而90%乙霜青可湿性粉剂的防控效果达到80%以上[52-54].噻菌铜㊁灭菌净等为专化型内吸性杀菌剂,灭菌净的有效成分为二氯异氰尿酸和三氯异氰尿酸,喷施在作物表面后会缓慢释放次氯酸,使菌体蛋白发生变性,改变细胞膜通透性,干扰酶的正常功能,影响D N A 的合成,最终引起病原菌死亡[50].土壤熏蒸剂是一类低毒广谱性杀菌剂,具有良好的内吸传导性,可对土壤进行消毒.在土39第1期 祖庆学,等:新形势下烟草青枯病发生特点与防治技术49植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第1卷壤中混入氯化钴和覆膜可进行土壤熏蒸消毒,氯化钴能够有效降低线虫和抑制杂草生长,减少线虫对烟草造成机械损伤以达到阻遏病原菌侵染途径[55].为减少地下害虫对烟草根部的损伤,可在烟株移栽前用2.5%功夫杀虫剂1500倍液进行灌根处理[30].随着新药的研发,一些具有良好控病的新型药剂逐步在市场上推广.大蒜提取物在浓度为0.4g/m L和0.5g/m L对烟草青枯病的防效分别为63.9%和71.3%.虽然化学防治见效快,但是病原菌抗药性的产生,也为青枯病防控带来了新的挑战.2.3生物防控生物间在生长和繁衍过程中具有复杂的关系,如共生㊁拮抗等关系,分离获得对青枯菌具有抑制作用的微生物,用微生物对青枯病进行有效防治是当前该病害防治的热点.最常见的生物防治方法是通过拮抗细菌来控制病原菌的丰度,从而减少病原菌对植物的危害,而拮抗细菌也有利于植物的生长,目前有超过100种青枯病拮抗剂包括芽孢杆菌属㊁假单胞菌属㊁链霉菌属等被分离和鉴定.张仁军等[56]研究哈茨木霉复合微生物菌剂㊁复合微生物菌剂㊁复合放线菌肥等对烟草青枯病的防治效果,结果表明,以复合放线菌肥为底肥,可促进烟草生长,且对防治效果较好.韩松庭等[57]通过试验对比发现多黏类芽孢杆菌对烟草青枯病的防治效果强于哈茨木霉,外源施加牡蛎粉对拮抗菌活性具有明显的促进作用.黎妍妍等[58]的研究结果表明米糠和芽孢杆菌复合拌土围根将有助于土壤恢复健康,并减轻青枯病对烟草的危害.生物防控最大的优势是环境友好,但实际应用中,这些拮抗剂受到环境条件和作物的影响,防治效果不稳定,对环境的适应性差,定殖能力下降,技术尚不成熟.由于单独施用拮抗细菌后,拮抗细菌在土壤中定殖困难,提高土壤根际拮抗细菌的定殖能力成为生物防治的研究重点.此外,生物防治必须与土壤保育㊁栽培措施等紧密结合.3展望目前化学农药仍是烟草青枯病防治的重要手段,但随着绿色农业和绿色生态理念的普及,青枯病的防治也必须走绿色综合防控的发展道路.各地应根据自身地理和气候等环境因素,因地制宜,根据当地农户的耕作习惯和烟草青枯病流行条件优化栽培措施和加强烟农防病控病意识;筛选适合当地烟草青枯病防控的药剂,合理施用土壤调节剂,改善土壤理化性质;深入发掘当地生物资源,结合微生物及其产物来抑制烟草青枯菌,进而有效防控烟草青枯病,促进烟草病害绿色防控技术的推广,减少病害带来的经济损失.参考文献:[1]陈进,魏凯.烟草青枯病防治技术研究现状[J].农业与技术,2017,37(20):35.[2] L I U Y,WU DS,L I U Q P,e t a l.T h eS e q u e v a rD i s t r i b u t i o no f R a l s t o n i as o l a n a c e a r u m i nT o 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美人蕉青枯病症状及防治和治疗措施
土壤条件
土壤类型
土壤质地、酸碱度、有机质含量等因素均可影响美人蕉青枯病的发生。
土壤水分
土壤过湿或过干都可能有利于病原菌的繁殖和扩散。
气候因素
温度
高温天气可能加重美人蕉青枯病的症状。
降雨
连续阴雨天气会加重土壤湿度，有利于病原菌的繁殖和扩散。
种植管理
01
02
03
种植密度
种植密度过大，植株之间 通风透光不良，可能加重 病情。
精耕细作
及时清除病残体，深耕翻土，加强 田间管理，提高植株抗病能力。
化学防治
种子消毒
用无菌种子或进行种子消毒，可 选用50%多菌灵可湿性粉剂或 70%甲基硫菌灵可湿性粉剂进行
拌种或浸种。
土壤消毒
在种植前对土壤进行消毒，可选 用石灰氮、福美双等药剂进行土
壤处理。
及时喷药
在发病初期及时喷洒药剂，可选 用的药剂有70%甲基硫菌灵可湿 性粉剂、50%多菌灵可湿性粉剂
枝条易折断，且断口不整齐
根部症状
根部变细、萎缩 根系逐渐变黑、腐烂
根系吸收能力减弱，影响植株正常生长
02
美人蕉青枯病病因
病原菌
病原菌种类
美人蕉青枯病的病原菌主要为青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。
传播途径
病原菌主要通过土壤传播，也可以通过灌溉水、雨水、施肥等途径传播。
等。
生物防治
使用生物农药
选用对青枯病具有防治作用的生物农药，如抗菌霉素、芽孢 杆菌等。
增加有益微生物
通过施用有机肥、种植绿肥等措施增加土壤中的有益微生物 ，抑制病原菌的生长和繁殖。
04
美人蕉青枯病治疗措施
更换土壤
马蹄病青枯病的病害与防治
许多农户对于马蹄病青枯病的预防措施了解不足，缺乏科 学的预防意识和防治技术，导致病害发生时往往措手不及 。
缺乏统一防治标准
由于缺乏统一的防治标准，不同地区、不同农户对于马蹄 病青枯病的防治方法和用药选择存在较大差异，难以实现 有效的防治效果。
缺乏有效治疗手段
对于已经发生的马蹄病青枯病，许多农户由于缺乏有效的 治疗手段，往往难以控制病害的扩散和蔓延，导致损失加 大。
创新防治技术
积极探索新的防治技术，如开发新型生物农药、研究新型抗性品 种等，以满足日益严重的马蹄病青枯病的防治需求。
建立完善的监测体系
建立完善的监测体系，及时发现和控制青枯病的流行，减少损失 。
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《马蹄病青枯病的病害与防 治》
2023-10-28
目录
• 马蹄病青枯病病害概述 • 马蹄病青枯病的病害发生 • 马蹄病青枯病的防治方法 • 马蹄病青枯病的防治效果评估
目录
• 马蹄病青枯病的防治中存在的问 题与解决对策
• 马蹄病青枯病的防治研究展望
01
马蹄病青枯病病害概述
定义与症状
定义
马蹄病青枯病是一种在马蹄（荸荠）上发生的细菌性病害，也称为荸荠瘟。
要点三
生物防治
生物防治是近年来研究的热点，通过 使用拮抗菌、诱导抗性等生物方法， 可有效控制青枯病的发生和蔓延。
研究热点与发展趋势
分子生物学及基因工程
随着分子生物学和基因工程技术的发展，越来越多的研究者将目光投向了马蹄病青枯病的分子机制和基因工程防治方面。例 如，通过基因敲除或基因沉默技术，可阻断病原菌的致病途径，提高马蹄的抗病性。
04
马蹄病青枯病的防治效果 评估
烟草青枯病的发生流行及生防菌防控的根际微生物效应研究进展
烟草青枯病的发生流行及生防菌防控的根际微生物效应研究进
展
刘勇;韦树谷;叶鹏盛;孙小芳;代顺冬;曾华兰;赖佳;阳苇丽;黄玲;盛玉珍
【期刊名称】《烟草科技》
【年(卷),期】2024(57)2
【摘要】综述了国内烟草青枯病的发生、症状特征、生防菌的应用及其对根际微生物群落的影响。
(1)烟草青枯病病原为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),该菌具有丰富的遗传多样性;(2)发病面积较大、为害较重的产区有广东、广西、福建、湖南、浙江等省(自治区)及安徽省的皖南烟区、四川省的宜宾和泸州等烟区,发病率达30%~100%;(3)多种微生物的联合应用或拮抗菌与(生物)有机肥、生物质炭等的配合施用可以更好地控制烟草青枯病;(4)生防菌的应用显著影响了烟草根际土壤细菌和真菌群落的多样性,并使根际微生物群落朝着更均衡的方向发展。
【总页数】12页(P91-102)
【作者】刘勇;韦树谷;叶鹏盛;孙小芳;代顺冬;曾华兰;赖佳;阳苇丽;黄玲;盛玉珍【作者单位】四川省农业科学院经济作物研究所;四川省烟草公司达州市公司【正文语种】中文
【中图分类】S435.72
【相关文献】
1.钾肥对烟草青枯病的防控效果及其根际微生物群落的影响
2.石灰氮与生物菌剂配施对烟草根际微生物群落及防控青枯病的影响
3.生防菌使用方式对烟草青枯病的
防效及根际土壤细菌群落的影响4.生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用5.生物有机肥对烟草青枯病的田间防效及根际土壤微生物的影响
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烟草青枯病防治研究进展
热带农业科技Tropical Agricultural Science &Technology 2023,46(3)：68-72烟草青枯病防治研究进展龚姝（保山市科学技术情报研究所，云南保山678000）摘要摘要：：烟草是我国重要的经济作物，病害是制约烟草产量和质量的关键因子，由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum ）引起的青枯病是烟草上最为严重的土传病害之一。
近年来烟草青枯病防治研究成果丰硕，文章从抗病品种选育、土壤理化性状与细菌群落关系、植物免疫诱抗剂及诱导抗性以及防控技术等方面综述其最新研究进展，为该病害的科学防控提供参考。
关键词关键词：：烟草；青枯病；研究进展中图分类号：S435.72文献标识码：A文章编号：1672-450X （2023）03-0068-05The Progress in Research of Tobacco Bacterial WiltGONG ShuBaoshan Municipal Institute of Scienceand Technology Information,Baosha 678000,ChinaAbstract Abstract::Tobacco bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the most serious soil-borne disease of tobacco production in China.Diseases is crucial factor damaging the yield and quality of tobacco production.There are a lot of achievements in the diseases control of tobacco bacterial wilt in recent years.In this paper,it summarized the research progress on the breeding and identification of resistant varieties,soil physical and chemical properties ，plant immune induc-er and inductive resistance and control measures in recent years,and thus provides theoretical basis for the control of tobac-co bacterial wilt disease in production.words Key words::tobacco;bacterial wilt;advances————————————收稿日期：2023-02-28作者简介：龚姝（1988－），女，助理研究员，主要从事科技管理与咨询、技术推广及成果转化工作。
美人蕉青枯病症状及防治方法
美人蕉青枯病症状及防治方法日期:目录•美人蕉青枯病概述•美人蕉青枯病症状•美人蕉青枯病病因•美人蕉青枯病防治方法•美人蕉青枯病案例分析•美人蕉青枯病展望与未来发展趋势美人蕉青枯病概述美人蕉青枯病是一种由细菌引起的土传病害，病原物为Ralstonia solanacearum。
定义美人蕉青枯病在植株上表现为叶片萎蔫、枯黄，茎秆出现褐色条纹，严重时全株死亡。
症状定义和症状美人蕉青枯病广泛分布于热带和亚热带地区，在我国南方地区发生较为严重。
该病害对美人蕉的生长发育造成严重影响，甚至导致整株死亡，对园林景观和绿化带的建设造成不利影响。
分布和危害危害分布病原和传播途径美人蕉青枯病的病原物是Ralstonia solanacearum，这是一种细菌性病害。
传播途径病原细菌通过水流、灌溉水、土壤、病株残体等途径传播，在土壤中可存活数年之久。
美人蕉青枯病症状0102叶片症状病斑后期破裂或穿孔，严重时叶片全部枯死。
叶片出现褐色或暗褐色斑点，并逐渐扩大，形成圆形或椭圆形病斑，边缘呈褐色，中央灰白色，并有轮纹状排列的小黑点。
病斑纵向扩展比横向扩展快，严重时茎杆内部组织腐烂，植株死亡。
根部受害后，根系变褐腐烂，侧根和须根不发达或坏死，随着病情的发展，地上部也逐渐枯死。
病株容易拔起，但不倒伏。
美人蕉青枯病病因青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）：这是一种土壤习居菌，能产生多种毒素，如青枯毒素，从而对植物造成损害。
细菌会通过伤口或自然孔口侵入美人蕉植株，并在体内繁殖，破坏细胞组织，导致植株死亡。
病原菌当土壤温度长时间高于30℃时，有利于病原菌的繁殖和扩散。
土壤高温土壤湿度植株伤口过高的土壤湿度会促进病原菌的活跃度，增加美人蕉青枯病的发生概率。
机械损伤、虫害等造成的伤口为病原菌的侵入提供了途径。
030201发病条件不同品种的美人蕉对青枯病的抗性有差异，有些品种可能更易感病。
品种抗性沙质土壤相对于黏土更有利于病原菌的繁殖和扩散。
辣椒青枯病绿色防控技术规程
辣椒青枯病绿色防控技术规程1 范围本文件规定了辣椒青枯病（Ralstonia solanacearum）的相关术语和定义、防控原则、农业防控、生物防治、物理防治、科学用药、病情调查、废弃物处理、档案管理等技术要求。
本文件适用于湖南省内辣椒青枯病的绿色防控。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 16715.3 瓜菜作物种子第3部分：茄果类NY/T 393 绿色食品农药使用准则NY/T 394 绿色食品肥料使用准则NY/T 2312 茄果类蔬菜穴盘育苗技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
辣椒青枯病 pepper bacteria wilt一种细菌性土传病害，由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起。
病害病症、发生流行规律等见附录A。
绿色防控 green prevention and controlt按照绿色发展理念，采取农业防治、生物防治、生态调控、物理防治和科学用药等环境友好型措施综合控制农作物病虫发生危害的植物保护措施。
生物农药 biological pesticide指利用生物活体(真菌、细菌、昆虫病毒、转基因生物、天敌等)或其代谢产物杀灭或抑制农业有害生物的制剂，包括微生物农药、植物源农药、天敌生物及农用抗生素等。
4 防控原则“预防为主，综合防控”的原则，结合农业防控、生物防治、生态调控、物理防治、科学用药等措施，实施绿色防控。
辣椒青枯病绿色防控的简要集成参见附录B。
5 农业防控选择抗病品种根据本地生态特点和不同审定品种特性，选择抗、耐病品种。
培育无病壮苗按GB 16715.3的要求严格选择种子，按NY/T 2312的要求培育无病壮苗。
栽培管理选择地势高燥、土层深厚、土壤疏松、排灌方便、中等以上肥力的沙壤土栽培。
烟草青枯雷尔氏菌噬菌体资源的发掘
Ｂｉｏｔｉｃ Ｒ ｅｓｏｕｒｃｅｓ
ＤＯＩ：１０．１４１８８／ｊ．ａｊｓｈ．２０１８．０４．００７
烟 草 青 枯雷 尔 氏菌 噬 菌体 资 源 的 发 掘
蔡 刘 体 ，陆 宁 ，沈 子 霞 ，汪 汉 成
（１．贵 州 省烟 草科 学研 究 院 ，贵州 贵 阳 ５５００８１； ２．贵 州省 烟草 公 司遵 义县 公 司 ，贵州 遵 义 ５６３００３）
收 稿 日期 ：２０１８—０３—２７ 修 回 日期 ：２０１８—０５—０２ 作 者 简 介 ：蔡 刘 体 （１９７４一），副 研 究 员 ，博 士 ，主 要 从 事 土肥 植 保 工 作 。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｃａｉｌｉｕｔｉ０１＠ １６３．ｃｏｍ
· ３４０ ·
蔡 刘 体 等 ：烟 草 青 枯 雷 尔 氏 菌 噬 菌 体 资 源 的 发 掘
中 图 分 类 号 ：Ｑ９３９．４８
文 献 标 识码 ：Ａ
文 章 编号 ：２０９６—３４９１（２０１８）０４—０３３９—０６
Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｃａｕｓｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗ ｉｌｔ
ห้องสมุดไป่ตู้菌 具 有 侵 染 性 的 烈 性 噬 菌 体 ，说 明 烟 田 土壤 中 普 遍 存 在 烟 草 青 枯 菌 噬 菌 体 。 选 取 噬 菌 体 ｑ￣ＰＢ２和 ｑ￣ＰＢ３４，电 镜 观 察 确 定 其 具 有
十二 面体 的 头 部 和 粗 短 的 尾 部 ，属 于肌 尾 噬 菌 体 科 。 噬 菌 体 的 宿 主谱 分 析 显 示 ，筛 选 到 的 噬 菌 体 对 分 别 从 烟草 、西 红 柿 和 花 生
青枯雷尔氏菌运动性相关研究进展
第33卷第5期植物医生2020年10月V o l.33N o.5P l a n t D o c t o r O c t.2020D O I:10.13718/j.c n k i.z w y s.2020.05.003青枯雷尔氏菌运动性相关研究进展①皮静,严培文,杜博兴,李石力西南大学植物保护学院,重庆400715摘要:青枯雷尔氏菌是全球十大病原菌之一,其运动性在早期侵染寄主过程中具有重要作用.本文主要概述了青枯雷尔氏菌的运动性相关研究进展,包括泳动和颤搐2种运动方式㊁青枯菌运动性的机理和遗传基础,以及运动性在青枯菌致病过程中的作用等.关键词:青枯雷尔氏菌;运动性;遗传基础;致病过程中图分类号:Q93文献标志码:A文章编号:10071067(2020)05001804青枯雷尔氏菌(R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m,简称青枯菌)属于原核生物界(P r o c a r y o t a e)㊁变形菌门(P r o-t e o b a c t e r i a)㊁β-变形菌纲(B e t a p r o t e o b a c t e r i a)㊁伯克氏菌目(B u r k h o l d e r i a l e s)㊁伯克氏菌科(B u r k h o l d e r i-a c e a e)㊁雷尔氏菌属(R a l s t o n i a)[1-2],是最具暴发性和破坏性的细菌病原体之一[3],在热带㊁亚热带和温带地区广泛分布[4].青枯雷尔氏菌寄主十分广泛,能侵染54个科250余种植物,如马铃薯㊁番茄㊁烟草㊁桑树㊁桉树和木麻黄等[5],且新寄主不断产生[6].青枯菌引起寄主植物发病过程十分复杂,需要经过接触㊁侵入㊁定殖和扩展,其生活史包括寄生和腐生两大部分,在无寄主植物下,青枯菌可以在土壤㊁杂草以及其他非寄主植物中长期存活[7].当感应到寄主植物,条件适宜下便会利用其鞭毛进行运动[1],从根伤口或次生根的根冠进入植物体内,在皮层细胞间隙内繁殖,随后侵染木质部,并蔓延到维管束中,系统地在植物体内定殖[8-9].大量的细菌复制导致细菌细胞中的群体感应依赖性代谢转换,引发毒力因子和胞外多糖[10],同时还分泌胞外蛋白酶降解细胞壁,最终导致植物导管堵塞㊁营养和水分丧失萎蔫而死亡.青枯菌在寄主植物根部定殖成功后,能够在寄主植物根表形成菌脓返回至土壤并形成二次侵染[11-13].青枯菌是目前国际上研究植物病原细菌致病机制的模式菌之一,其致病因子多样,致病网络系统复杂[7].目前,在青枯菌的致病机理研究方面,国内外主要集中于胞壁降解酶和I I型分泌系统(T2S S)㊁I I I型分泌系统(T3S S)效应子㊁胞外多糖(E P S)㊁胞外蛋白㊁脂多糖(L P S)和I V型鞭/菌毛系统等[14-16].然而,青枯菌侵染寄主植物过程中,需要通过运动性对寄主植物根部进行早期定殖,才能后期致病,运动性是其重要致病因子之一,基于此,本文主要介绍青枯雷尔氏菌运动性的研究进展.1青枯菌的2种运动策略在青枯菌侵染寄主植物根部及早期定殖过程中,为了到达不同的植物组织并进入维管束,青枯菌采用2种不同类型的运动策略:由鞭毛驱动的泳动和由菌毛驱动的颤搐.这2种策略是影响青枯菌致病力的重要因子[4,7],能有效地帮助细菌逃避不良环境以及有毒物质,获得所需营养物质,快速准确地寻找到有利于侵染寄主的生存环境[9].泳动是由青枯菌的极生鞭毛介导的运动形式,可以使细菌有效侵入寄主并定殖[1].①收稿日期:20200902作者简介:皮静(1999-),女,硕士研究生,主要从事根际信号分子研究.E-m a i l:1912147487@q q.c o m颤搐是一种在固体表面移动的非依赖鞭毛的运动形式,由I V 型鞭毛系统介导,与细胞黏附和聚集有关[17].同时,细菌的运动性受到生长环境因素和病原细菌浓度的影响,半固体运动性培养基检测试验显示,细菌浓度过低(<106C F U /m L )或过高(>109C F U /m L )都有可能降低青枯菌的运动性[18].1.1 泳动泳动是指水环境中的细菌靠极生或周生鞭毛推动的直线运动或翻腾运动.泳动的速度很快,每秒钟可以达到数百微米.在青枯菌中,这种运动是由1~4个极性鞭毛介导的,鞭毛的结构由一条长长的螺旋状细丝通过柔性钩和基体复合物锚定在细胞膜中组成.鞭毛丝是一个空心管,由大约20000个称为鞭毛蛋白(F l i C )的单一蛋白质聚合成复杂的螺旋线组成.鞭毛的旋转由鞭毛运动开关F l i G ,F l i M 和F l i N 控制.趋化作用使细菌细胞能够感知特定的化学物质,并依赖于几种蛋白质的存在,这些蛋白质最终会与鞭毛运动相互作用,朝着更有利的条件发展.这个复杂的行为在细胞膜相关受体甲基化受体趋化蛋白(M C P )开始,通过改变其构象检测环境刺激并响应它们.其过程主要分为3步:首先,由细菌细胞膜上的M C P 感应趋化效应物,产生信号;随后,信号通过M C P 传递,影响组氨酸激酶C h e A 的自磷酸化活性,进而影响响应调控蛋白C h e Y 的磷酸化水平;最后,磷酸化的C h e Y 与鞭毛蛋白F l i M 结合,从而影响细菌鞭毛的旋转方向,决定细菌的运动方向.1.2 颤搐颤搐是由青枯菌I V 型菌毛(T F P )附肢在固体表面或黏性介质中延伸㊁附着和缩回驱动的不依赖于鞭毛的另一种运动[19].T F P 是由P l i A 蛋白组成的,介导青枯菌的运动性,在青枯菌自然转化㊁生物膜形成和毒力中起作用[20].已鉴定出基因p i l A ,pi l Q 和p i l T 在青枯菌中参与菌毛挤压的促胰液素和菌毛回缩所需的蛋白,并且它们的任何一种失活都会降低青枯菌颤搐能力和毒力.此外,pi l A 突变体在番茄植株上的毒性㊁在根上的定殖以及生物膜的形成均降低了,并且不能自然地转化[21].在同时带有鞭毛和菌毛的革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌中,基于鞭毛趋化系统的同源性,有人提出了由簇I V 中的p i l -c h p 基因编码的假菌毛介导的青枯菌趋化途径存在[22].与鞭毛介导的趋化作用相似,在这种途径中,细胞膜相关受体(P i l J )产生的分子信号有望触发称为C h pA 的胞质C h e A 组氨酸激酶的自磷酸化,这可能形成具有2个称为P i l I 和C h pC 的C h e W 同源物的复合物.菌毛的移动在这个假设的系统中的控制很可能由2个C H e Y 同源物(P i l G 和P i l H )与推定的T F P 马达相互作用,以控制由C h pA 磷酸化后颤搐的进行.在最近的一项研究中,首次证明了青枯菌中类似于控制鞭毛介导的趋化性的p i l -c h p 基因编码的菌毛介导的趋化途径的功能,证明P i l I 和C h pA 基因是控制颤搐运动及其3种相关表型的真正运动调节因子,即毒力㊁自然转化以及生物膜形成.结果表明,在番茄植株与青枯菌的相互作用中,菌毛具有比鞭毛更大的影响,并揭示了泳动和颤搐运动表型之间的新型交互作用,增强了在缺乏菌毛的细菌中游动并促进鞭毛在根系附着中的作用.2 青枯菌运动性的机理和遗传基础细菌通过鞭毛的旋转推动菌体的运动.当鞭毛逆时针旋转时,菌体呈直线前移,顺时针旋转时,菌体随意转向或做翻滚运动[23].鞭毛旋转的动力很大程度上依赖于细胞质膜鞭毛基部的H +流驱动;与之不同的是,嗜碱细菌(如芽孢杆菌)的鞭毛旋转由N a +流驱动.细胞膜上的H +流驱动埋在膜内和膜上的鞭毛基体的C 环(由F l i G ,F l i M 和F l i N 形成的功能复合体)㊁M 环和S 环反向旋转,启动中心杆.C 环相当于转子,参与了鞭毛组装和控制鞭毛旋转方向,M 环周围的跨膜蛋白M o tA 和M o tB 组成质子通道,作为定子和转子共同构成鞭毛马达.当质子进入M 环上的蛋白亚基,带正电的氨基和带负电的羧基作用产生静电引力,使M 环转动,S 环不运动,但在鞭毛旋转中起轴封作用[24].细菌的运动性一部分由遗传特性决定.青枯菌的运动性受到综合调节基因p h c A 的控制,人工诱变番茄青枯菌AW 的p h c A 基因后得到的突变株与自发无毒突变株表型相似,p h c A 基因能使两者功能互补,恢复包括运动性在内的性状为野生型表型.据报道,染色体上分布着大部分编码运动性和趋化性的基因[25].细菌在植物表面的附着与I V 型鞭毛系统联系紧密,影响着青枯菌的致病力和生态适应能力.在青枯菌91第5期 皮 静,等:青枯雷尔氏菌运动性相关研究进展02植物医生h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第33卷GM I1000基因组中存在大量编码菌毛和鞭毛成分蛋白的基因,受外界环境条件影响,这些基因特异表达,使得青枯菌具有适应不同环境条件的能力[26].3青枯菌运动性在其致病过程中的作用运动性对于青枯菌早期侵染过程中具有定位和侵入根部的作用.随着病害的加重,青枯菌的运动性可以帮助其从感染的木质部维管束扩散到相邻的未感染木质部维管束和细胞中.鞭毛还可以帮助细菌附着到宿主细胞[27];在这种情况下,野生型和突变型菌株附着在番茄根表面的能力不同.运动性通常需要生物膜的形成,显微镜观察表明青枯菌在宿主木质部维管束上形成生物膜.这些专门的聚集体可能保护细菌免受宿主防御,也可能有助于潜在感染和腐生生活中的细菌存活.鞭毛复合体也可能在细菌毒力中发挥更直接的作用.组装鞭毛的几种蛋白质在进化上与I I I型分泌系统有关,后者将细菌毒力因子注入植物细胞.因此,青枯菌鞭毛装置可能参与了转运毒力因子的过程[28].鞭毛的运动性在体外培养中是随着生长周期而变的,但是从番茄上发现的细菌却是全周期都有运动性.将无游动性且无鞭毛与有游动性无趋化性的突变体分别以土壤浸液接种于盆栽番茄时,突变体的致病性明显减弱,但是当突变菌被直接接种到木质部时,它们又表现出了正常的毒力,表明青枯菌侵染植物需要运动性的辅助[29].有趣的是,研究报道的一个超动青枯菌m o t N突变体,其毒力也降低.因此,在研究丧失颤搐能力的菌毛p i l Q,p i l T或p i l A突变体时,精确调控叶面喷施和灌根接种方法非常重要.在植物定殖的第一阶段,青枯菌P i l I,C h p A,P i l A和F l i C缺失突变体的毒力受到损害,在湿润或接种叶部后P i-l A突变体表现出生长减慢,这是关于青枯菌I V型菌毛调节剂P i l I和C h p A的第一份报道[22].此外,P i l A 突变体还影响青枯菌生物膜的形成㊁定殖能力和自然转化的能力.青枯菌T F P能提高青枯菌侵染寄主植物的能力,增强其对番茄的致病效果[30].该结论基于在青枯菌的相关研究:(1)抽搐运动;(2)具有在铜绿假单胞菌中起作用的前纤毛蛋白肽酶;(3)具有2个基因(P i l Q和P i l T),被预测为编码功能性T F P生物发生所必需的高度保守的蛋白质;(4)P i l Q或P i l T的失活消除了抽搐运动并降低了毒力.另外,T F P在肉汤培养基中可以促进青枯菌形成生物膜,缺失T F P后,青枯菌的聚集能力及生物膜形成能力均受到影响[21].在青枯菌侵染寄主植物根部及早期定殖过程中,由鞭毛和菌毛介导的运动性是影响其毒力的重要因子之一.目前已有研究证明,青枯菌在寄主植物根部定殖时,P i l I,C h p A,P i l A和F l i C缺失突变体的毒力降低,I V型菌毛P i l I和C h p A基因在颤搐㊁生物膜形成㊁自然转化和毒力中起着重要作用,缺失P i l A 时,青枯菌GM I1000菌株中的运动性表型发生改变,F l i C基因在青枯菌根部定殖和生物膜形成中具有重要作用.今后,应进一步研究青枯菌与寄主植物的相互作用关系,以阐明功能已知和未知的基因对泳动和颤搐的影响,这对于解释运动性在青枯菌侵染过程中的作用具有重大意义.参考文献:[1]Y A B U U C H IE,K O S A K O Y,Y A N OI,e t a l.T r a n s f e r o f t w oB u r k h o l d e r i a a n d a nA l c a l i g e n e s s p e c i e s t oR a l s t o n i a g e nN o v:P r o p o s a l o f R a l s t o n i a p i c k e t t i i(R a l s t o n,P a l l e r o n i a n dD o u d o r o f f1973)c o m bN o v,R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m(S m i t h 1896)c o m bN o v a n d R a l s t o n i a e u t r o p h a(D a v i s1969)c o m bN o v[J].M i c r o 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青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌蛋白致病侵染的生物信息学初步分析
文 山学 院学报
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｗ ＥＮＳＨＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖ０１．３１ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２０１８
青枯雷尔 氏菌 川型分泌 蛋 白致病侵 染 的生物信 息学初 步分 析
满 娇 ， 张 武
（大理 大学 农 学与 生物 科 学 学院 ，云 南 大理 ６７１００３）
收稿 日期 ： ２０１８—０３—０６ 基金项 目：云南省教育厅科研基金项 目 “菜豆根瘤菌与宿 主植物分子互作 的分泌蛋白生物信息学调控分析 ” （２０１８ＪＳ４１６）； 国家 自然科学基金项 目 “珍稀濒危蕨类植 物白桫 椤的交 配系统与保育策略研究 ” （３１５００４５８）。 作者简介 ：满娇 ，女 ，黑龙江伊春人 ，大理大学农学 院与生物科学学院园艺专业学生 ；张武 ，男 ，河南信 阳人 ，大理 大学 农学 与生物科学学 院讲 师 ，硕士 ，主要从事生 物信 息学研究。
青 枯 雷 尔 氏菌 作 为 革 兰 氏 阴性 菌 的一种 ，可 通 过 分 泌 效 应 物 【２】（ｅｆｅｅｔｏｒｓ，专 指 病 原 菌 分 泌 到 宿 主植物体 内的分泌蛋 白 ）引起致病侵染 ，研究其分 泌机制对 于病原菌的致病机理具有重要意义 【３］。分 泌蛋 白是 由细胞合成并分泌到质膜外 的蛋 白质 ，分 为 两 大 类 ，一 类 是 经 典 分 泌 蛋 白 （ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｅｃｒｅｔｅｄ
分 泌蛋 白 的研 究 可 以用 实 验 检测 和 理 论 预测 两 种 方 法 。常规 的蛋 白质 实 验 检 测 可 以用 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 和 Ｅｌｉｓａ（酶联 免疫 吸附测定 ），而 Ｍａｔｔｈｅｗ等 使用 ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ质谱 仪 ，通 过对细 菌蛋 白质组 特异性 修饰 ，可以直接从菌落中检测细菌的分泌蛋 白，甚 至 识 别 病 原 菌 的毒 力 和 侵 染 蛋 白质 ［５］。近 年 来 ，随
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关键词：青枯雷尔氏菌；电击法；gfp/luxAB基因
GFPTaggingRalstonia solanacearumwithgfp/luxABmini-Tn5
CHEJian-mei1,2, LANJiang-lin1, LIUBo1
(1Agricultural Bioresource Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003;2Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Fujian Agricultrue and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)
1.2 试验方法
1.2.1青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的gfp基因转化
1.2.1.1质粒的提取参照文献[10]。质粒提取及纯化步骤按QIAGEN质粒大量提取试剂盒提供的方法进行。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2 μl。
1.2.1.2青枯雷尔氏菌感受态细胞的制备从0.1×TSB固体平板上挑取新鲜的青枯雷尔氏菌单菌落于20 ml0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养过夜，按照1%接种比例接入500ml0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养，每1 h测定1次OD600。收集生长中期的培养物于冰水浴中放置30 min后，用无菌水冲洗细胞4次，最后将细胞悬浮于1 ml无菌水中，并在－70℃冰箱保存备用。
图1 质粒pUTgfp/lux图谱
Fig.1 ThemapofpUTgfp/lux
1.1.2培养基、抗生素与试剂大肠杆菌（E.coli）CC118的培养基为LB培养基；青枯雷尔氏菌的培养基为0.1×TSB；质粒大量提取及纯化试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit；抗生素卡那霉素（Kanamycin，Km）购自Sigma公司；电转化仪为Bio-Rad Gene PulserⅡ；立体荧光显微镜（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品。凝胶成像仪BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System、离心机为德国生产的Hettich mikro200R。引物gfpluxForwNot I（5'-gcggccgcataggta aaggagaagaac ttttcact -3'）和引物gfpluxRevNot I（5'-gcggccgct tacgag tggtatttgacgatgtt-3'）由美国Invitrogen公司合成。
1.2.1.3青枯雷尔氏菌的电击转化参照文献[10]。电击转化后取200 μl菌液涂布于含有50 μg·ml-1卡那霉素的0.1×TSB固体培养基上，30℃培养。电击转化的参数为：电压2.5 kV、电容25 µF、电阻400 Ω。
1.2.1.4阳性转化子的荧光检测及激光共聚焦显微检测检测方法参照文献[11]。通过观察菌落发出的绿色荧光直接筛选阳性转化子，命名为Rs91-GFP。
Key words:Ralstonia solanacearum;Electroporation;gfp/luxABgene
0 引言
【研究意义】植物细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性的土传细菌病害。青枯雷尔氏菌寄主广泛，可侵染44个科数百种植物[1]。植物青枯细菌致病的分子机制是植物与微生物相互作用机制研究的重要领域之一。在植物根际土壤中和植株体内存在着大量的青枯雷尔氏菌，这给青枯雷尔氏菌侵染致病机理的研究带来了困难。将gfp基因转入青枯雷尔氏菌将有助于研究青枯雷尔氏菌在活体植物体内的侵染过程，建立菌体生物量的直观测定方法，从而为更加深入地研究青枯雷尔氏菌致病机理及青枯病生物防治机制奠定基础。【前人研究进展】绿色荧光蛋白（GFP）最早是从水母中分离出来的，是一种非酶性报告因子，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，作为报告基因，GFP是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一，作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害[2]。GFP检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代[2]。利用GFP标记进行病原菌侵入活体细胞过程的跟踪观察更开创了病理学研究的新时代[3~5]。Unge等[6]的研究证明了荧光与菌体细胞数量呈线性关系，也为通过荧光直接对细菌记数提供了一个方便快捷的方法。gfp基因在其它细菌上的转化有过许多报道，但是，青枯雷尔氏菌gfp基因转化非常困难，国内外许多学者都试图进行青枯雷尔氏菌gfp基因转化，然而，成功的例子非常少，通过NCBI检索，仅见两篇关于gfp基因转入青枯雷尔氏菌的报道[7,8]，一篇是采用自然转化的方法将来自AW1-gfp38菌株的Tn5::gfp转入青枯雷尔氏菌K60[7]，另一篇则采用细胞融合的转录方法将hrp-gfp基因转入GMI1000[8]。【本研究切入点】未见关于采用电击转化法进行青枯雷尔氏菌的gfp基因转化的报道。目前在国内未见关于青枯雷尔氏菌gfp基因转化的报道。【拟解决的关键问题】在本研究中，作者采用带有gfp/luxAB双标记基因的pUT mini-Tn5转座载体，通过电击转化法成功地将它整合到青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）染色体上，并利用荧光显微镜检测GFP在标记菌中表达后发出的绿色荧光，同时进行了转化菌体的gfp基因检测和转化菌株的微生物学异质性检测，研究转化菌株的生物学稳定性，为青枯雷尔氏菌gfp基因转化和致病机理的研
究提供方法。
1 材料与方法1.1 试源自材料1.1.1菌株和质粒青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）编号Rs91菌株为本实验室从番茄植株上分离纯化得到并保存。大肠杆菌（Escherichia coli）CC118为转座载体pUTgfp/luxAB的宿主菌，由瑞典农业大学微生物系JanetK.Jasson教授惠赠，其中带有双标记基因gfp/luxAB[9]，质粒图谱见图1。
1.2.2青枯雷尔氏菌Rs91-GFP的鉴定及荧光检测
1.2.2.1Rs91-GFP的PCR检测引物gfpluxForwNot I和引物gfpluxRevNot I（由瑞典农业大学Janet教授组内博士生设计，该引物可扩增gfp和lux片段的全部序列）。采用灭菌的牙签挑取少许新鲜培养的单菌落加入25 μlPCR反应体系中。25 μlPCR反应体系中含有2 μl10×Buffer；1 μl2 mmol∙L-1dNTPs；1 μl10 μmmol∙L-1引物。所用模板DNA分别为Rs91-GFP基因组DNA、Rs91基因组DNA（阴性对照）、以及质粒DNA（阳性对照）。PCR循环参数为：94℃预变性2 min；进入94℃10 s，60℃30 s，68℃8 min，共10个循环；然后进入94℃15 s，60℃30 s，68℃8 min，共20个循环；最后68℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，上样量为3 μl，最后用Bio-Rad 2000型凝胶成像仪拍摄。