实验一 特殊显微镜及其使用

4 用途：
用于观察组织培养中活细胞形态结构或未染色标本。
5、标本
活细胞
三、荧光显微镜
1、原理
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系 统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为 激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的可见 荧光，再通过物镜和目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。
3.2.反射荧光显微镜：
光源：高压汞灯或卤素灯。
聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。
物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本 身不产生荧光，对数值孔径没有限制。
标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。
优点：
• 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。
• 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 • 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高 分辨率的像。 • 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 • 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透 射微分干涉差法相结合。 • 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
荧光显微镜具特殊光源，提供足够强度和波长 的激发光，诱发荧光物质发出荧光。
当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量，它能发 射出比原来吸收的波长更长的光。这种波长长于激发光的 可见光称为“荧光” 。
荧光染色分类：



自发荧光（不加染色）：有些物质不加染色，也能发 出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学 领域中，只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色）：非荧光性的物质（蛋白质、 碳水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光 （二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适 的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出 来而可以观察到。 抗体荧光技术（用免疫染色）：利用特定的抗原必然 和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光 标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样 两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。
阻断滤光镜(barrier filter)：
位于物镜之上，二向色镜与目镜之间，用以阻断 或吸收没有被标本吸收的激发光，以防伤害眼睛，使 荧光透过。在荧光中也仅有部分波长被选择透过。
选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需 荧光的光线，并透过样品发出的荧光。
2.4、荧光显微镜的光路
因荧光激发的方式不同，分为： 透射荧光显微术光路
2.3、滤色镜系统
激发滤色镜(exciter filter) 为被检样品的荧光燃料提供最佳波段的激发光。
加放于汞灯和二向色镜之间，物镜之前。
几种主要的激发滤色镜
激发方法 紫外 紫 兰紫 兰 绿 代号 UV V BV B ， B2 G 主波长 365nm 405nm 436nm 495nm 546nm

清点器械
实验报告
节 约 规 范

实验室卫生
实验一 特殊显微镜及流式细胞仪 的使用
实验所需的材料：
1、口腔上皮细胞 2、活细胞（细胞系） 3、培养的紫菜或小新月菱形藻 4、流式细胞仪的演示 实验所需的试剂： 香柏油、乙醚:酒精=7:3
暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜
实验目的： 掌握暗视野显微镜、相差显 微镜、荧光显微镜及流式细胞仪的原理、 构造及其使用方法。 学习特殊显微镜操作的目的： 暗视野显微镜：看到运动的物体，利用 目标物体的轮廓与背景区分开 荧光显微镜：辨别含有荧光物质所在的 位置

一、 暗视野显微镜
1. 原理
利用暗视野聚光器（或挡板）使入射光束的中央光 束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜，只能倾 斜地照射在观察的标本上。标本遇光发生反射或散射， 物镜接触不到入射光源的光线，只能接触标本的反射和 散射光。因而整个视野的背景是黑的，物体的边缘是亮 的，使在黑暗的背景上呈现出明亮的像。
4、使用方法（反射荧光显微镜）
1）打开灯源开关（汞灯及普通灯光源），超高压汞灯要预 热几分钟才能达到最亮点。 2）反射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发 滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3）放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤 光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤； 4）高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再 启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 5）先在普通光源下（数字调为1）用10倍物镜调整好玻片的 焦距，后转至40倍物镜。材料目标与焦距调好后，关闭普 通光源的电源（或用载物台下面的挡板将来自下面的普通 光源挡住），数字调至2-4，其中2为红色激发光，3为蓝 色激发光，4为绿色激发光，蓝色激发光波长最短，一般 应用蓝色3，即可看到荧光照片。 荧光显微镜主机的上部分右侧分别有调整荧光光圈、 光强的拉杆及照相拉杆。
相差：同一光线经过折射率不同的介质其相位发 生变化并产生的差异。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于 折射率与厚度的乘积之差（光程差），介质越厚或折射率越 大，光波减速也越大。
肉眼看不到的相差，利用光的衍射和干涉现象，把相位差 变成振幅差(明暗差)，就可以看到。
2 结构特点
相差显微镜与普通显微镜的 主要不同之处是： 1）用环状光阑代替可变光阑 2）用相差物镜(通常标有PH的 标记)代替普通物镜； 3）带有一个合轴调中望远镜CT: 用于环状光阑的环孔与相差 物镜相板共轭面的环孔（暗 环）在光路中准确合轴，使 成像的相位差变为振幅差； 4）有绿色滤色片：用于消色， 可吸收红色和蓝色光，只透 过绿光，使波长范围小的单 色光线进行照明，并有吸热 作用，能使相差观察获得良 好的效果
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
6、 实验内容、材料与仪器
内容：荧光显微镜下观察单细胞藻类 材料：小新月菱形藻 仪器：载玻片、盖玻片、荧光显微镜

四、流式细胞仪(flow cytometer, FCM)
1、FCM的结构可分为5部分： ①流动室及液流驱动系统； ②激光光源及光速形成系统； ③光学系统； ④信号检测与存储、显示、分析系统； ⑤细胞分选系统。 2、FCM的工作原理： 1） 将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。用一定压力 将待测样品压人流动室，同时，不含细胞的磷酸缓冲液 在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流 成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动， 组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行 排列，依次通过检测区域。
5、用途
1)观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细 胞和结构 2)标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光， 借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。 3)细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙 锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。 4)荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰 酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标 记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测 该抗原的存在与分布。
反射荧光显微术光路
透射荧光显微镜光路图
反射荧光显微镜光路图
目镜
阻断滤镜
激发 滤镜
二向色镜 物镜 样品 集光镜 汞灯
3、荧光显微镜的分类：
3.1.透射荧光显微镜：
光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。
物镜：可用任何种类的物镜。
标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。
丁达尔现象 斜向照明
2.操作方法（P14）
1. 安装暗视野聚光器（或挡板），放在普通显微镜的聚光器 下方。
2. 加香柏油：把被检样品的标本置于载物台上，并在聚光器 透镜的上表面滴香柏油 。向上缓慢调升聚光镜，使香柏 油与载玻片下表面缓缓接触。加香柏油的原因，避免照明 光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体。 3. 聚光器光轴的调中：用低倍镜对样品聚焦，随之用聚光器 升降螺旋上下缓慢调节聚光器位置，当暗视野中清楚地窥 见一光环或圆形光点时停止什降聚光器，用聚光器调中杆 推动聚光器，把光环或光点调至视野中心； 4. 调节聚光器焦点，使之位于被检样品处，转动聚光器升降 螺旋，使视野中光环调成一最小的圆形光点，此刻聚光器 的焦点恰好位于样品处。
细胞生物学实验
汕头大学生物系 游翠红

本实验课共36学时，由12个实验组成。
实验内容ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、特殊显微镜及其使用 2、线粒体和叶绿体的分离 3、巨噬细胞的吞噬实验 4、ACP、过氧化物酶等的显示 5、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 6、动物细胞染色体分带技术
实验要求

永久制片 —实验开始前细查张数及有无破损

用途：
1）利用样品的散射光和反射光进行观察，只能看到 物体的存在和运动，不能辩其细微结构；
2）可以看到许多细胞器的明亮轮廓，如细胞核， 线粒体、液泡等
3. 实验内容、材料与仪器
内容：口腔上皮细胞的观察 材料：口腔上皮细胞 试剂：蒸馏水 器材和仪器：载玻片、盖玻片、显微镜、牙签
二、相差显微镜
2、荧光显微镜的基本装置及其光路
2.1 基本装置 普通光学显微镜加附件： 1)荧光光源 2)激发滤片 3)双色束分离器 4)阻断滤片等 的基础上组成的。
荧 光 显 微 镜 内 部 构 造 （ 反 射 式 ）
2.2、光源：采用高压汞灯。
由于荧光和激发光相比，是非常微弱的，因 此荧光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫 外区，也必须有足够的强度。为了满足这些要求 ，通常采用高压汞灯。 使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时 ，不可切断电源，可用光阀阻断光路。
注意事项
物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径； 制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁无痕； 必须使用薄玻片(载玻片厚度约0.8~1.1mm，盖玻片厚 度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点 的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就 不能看到物象；标本也不能过厚。 采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物 象不清晰。