真核基因表达系统
真核细胞诱导表达系统研究进展
真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
基因表达系统及技术
基因表达系统的研究意义
理解生命活动的基本原理 揭示疾病的发生和发展机制 提供新的药物靶点和治疗策略 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ动生物技术的发展和应用
基因表达系统的组成
转录因子
转录因子通过与DN结合调控 基因的转录过程
转录因子是基因表达调控的 重要因素
转录因子可以分为激活因子 和抑制因子
转录因子的种类和数量众多 具有不同的功能和作用
技术： CRISPR/Cs9、 TLEN、ZFN等
优势：高效、精 确、可重复性强
基因敲入技术
原理：通过基因编辑技术将目的基因插入到宿主细胞中实现基因表达 应用：基因治疗、基因工程、生物制药等领域 技术类型：ZFN、TLEN、CRISPR等 优点：高效、精确、可重复性高
基因编辑技术
基因编辑技术：CRISPR/Cs9技术 原理：利用Cs9蛋白对DN进行切割和编辑 应用：基因治疗、基因工程、农业育种等领域 优点：高效、精确、成本低 挑战：伦理问题、安全性问题、技术难题等
基因表达系统及技术
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基因表达系统概述
基因表达系统的定义
基因表达系统是指在生物体内基因通过转录和翻译过程将遗传信息 转化为蛋白质的过程。
基因表达系统包括转录和翻译两个阶段其中转录是指DN被复制为 RN的过程翻译是指RN被翻译为蛋白质的过程。
转录起始复合物
核心成分：RN聚合酶II、TFII、TFIIB、TFIIE、TFIIF、TFIIH 功能：启动基因转录 结构：由多个亚基组成包括核心酶、通用转录因子和特异性转录因子 作用机制：通过与DN结合形成转录起始复合物启动基因转录
分子生物学考试总结
PART Ⅰ基因（略）PART Ⅱ原核基因表达体系第五章细菌转录1、简介：转录产生的RNA链代表了DNA双链的一条链。
新合成的RNA链为5’-3’，而模板链为3’-5’。
转录出来的RNA 排列与编码链相同。
RNA合成由RNA聚合酶催化。
转录起始于RNA聚合酶与DNA上的特定区域的结合——启动子（promoter），这作为转录的开始。
从启动子开始，RNA聚合酶沿着模板链移动合成RNA，直到到达终止子（terminator）序列。
这一反应决定了转录单位的形成，即从启动子至终止子的序列均为转录单位，这一区域可能包含不止一个基因。
序列优先从起始点（转录RNA的第一个碱基）。
起始点以上的被称为上游，以下的被称为下游。
转录的直接产物被称为初始转录本。
它包含了从启动子至终止子的5’-3’的全部信息。
然而，转录起始本通常被直接修饰。
原核细胞中，它直接被降解（mRNA），或者切割成为成熟的tRNA或者rRNA。
转录只是基因表达以及调控的第一阶段。
调控蛋白决定了到底是哪一部分的基因能够被RNA聚合酶转录。
这一步骤决定了基因的转录与否。
本章需要谈论的问题主要有两个。
1、RNA聚合酶究竟是怎样找到DNA上的启动子序列的？推广这一问题为：究竟蛋白质是怎样阅读DNA上的序列来找到特定的结合位点的？2、调控蛋白是怎样与RNA聚合酶相互作用来启动或者抑制转录的起始、延长、或者终止过程的？2、转录发生在转录泡中：在通常意义上的转录过程中，RNA一般合成于“转录泡”中，转录泡为解开双螺旋的DNA 双链。
RNA链沿着5’-端向3’-端合成。
游离核苷酸的3’-OH与DNA链上的核苷酸的5’-P相互作用，合成RNA链。
RNA 聚合酶与启动子结合后就会解离DNA双链形成转录泡。
当RNA聚合酶沿着DNA模板移动时，其沿着解旋点（unwinding point）解开DNA双螺旋，并且在重旋点（rewinding point）重旋DNA。
转录泡的长度一般为12-14bp，但是RNA-DNA 杂交链区域的长度为8-9bp。
真核生物的基因表达调控
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• 锌指结构域The zinc finger domain
锌指结构有2种形式： C2H2 zinc finger和C4 zinc finger •C2H2 zinc finger：由12个氨基酸组成的环，通过2个半胱氨 酸（C，Cys）和2个组氨酸（H，His）残基固定，这4个残基 与Zn2+在空间上形成一个四面体结构。 一般情况下需要3个 或更多的C2H2型锌指才能与DNA结合，如在TFIIA有9个重复， 转录因子SP1有3个重复。 •C4 zinc finger： Zn2+与4个半胱氨酸（C，Cys）结合，存 在于类固醇激素受体转录因子中。
限定于结构域之内。
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反式作用因子的结构与功能
（1）概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开 放（正调控）或关闭（负调控）。
（2）通用或基本转录因子—RNA聚合酶结合启动子所必需 的一组蛋白因子。如：TFⅡA、 TFⅡB、 TFⅡD、 TFⅡE 等。 （3）特异转录因子( special transcription factors)—个别 基因转录所必需的转录因子.如：OCT-2：在淋巴细胞中特 异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。
(2) 动态模型（dynamic model）：认为转录因子与组 蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经 历结构上的改变，即染色质重塑。在染色质重塑过 程中，某些转录因子可以在结合DNA的同时使核小 体解体。
6
组蛋白的乙酰化-去乙酰化 蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种 重要的形式，通过乙酰化或去乙酰化，改变了染色质 结构或是转录因子的活性，可以调节基因转录的活性。 组蛋白的乙酰化和去乙酰化能打开或关闭某些基因， 增强或抑制某些基因的表达。 组蛋白的8个亚基上有32个潜在的乙酰化位点。组 蛋白的乙酰化过程由组蛋白乙酰转移酶催化完成。
真核生物基因表达调控
酸性激活域 (D/E-rich) 谷氨酰胺(Q)富含域 脯氨酸(P)富含域
蛋白质-蛋白质结合域 （dimerization, co-factors）
1） TF最常见的DNA binding domain
Zinc Finger
bZIP
Homeodomain
bHLH
(1) 锌指(zinc finger)
2. The pri5’ capping 3’ formation / polyA splicing
3. Mature transcripts are transported to the cytoplasm for translation
Chromatin
epigenetic control
Protein degradation RNA silencing
一般而言的基因表达调控范畴
二、基因表达的时间性及空间性
（一）时间特异性
按功能需要，某一特定基因的表达严格按 特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间 特异性(temporal specificity)。
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His C-terminal: α-helix binding DNA
常结合GC box
(2) 碱性亮氨酸拉链 bZIP
(3) 碱性螺旋-环-螺旋bHLH
bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)
2） TF常见的trans-activation domain
– usually expressed at high level – the level of their gene expression may vary
原核、真核生物基因及表达调控
原核、真核生物基因及表达调控引言现代生物学中“基因”一词甚为流行，细胞学、遗传学、生物化学等，以及各种生物学课本中，都涉及到“基因”一词。
甚至象典型的宏观生物学科——生态学，也把一片森林称为一个“基因库”[1]。
现代生物学已经完全证明，DNA 分子是由称为核普酸的有机分子线性聚合而成。
基因就是核普酸按一定顺序排列而成的DNA分子片段，它携带着遗传信息。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
其实质就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中，生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）[2]。
原核生物和真核生物的基因及表达过程有着差异。
随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。
迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白[3]。
一．原核、真核生物基因结构原核生物基因分为编码区与非编码区，所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，非编码区位于编码区的上游及下游。
[4]在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
真核生物基因结构见图1：图1 真核生物基因结构二．原核、真核生物基因结构的区别最主要的在于真核基因是不连续的,而原核基因是连续的。
所谓真核基因的不连续，即一个基因的编码序列也叫外显子，被一个或多个非编码序列，又叫内含子所间隔。
[5]这些内含子和外显子同属一个转录单位，转录形成前体。
经过转录的加工，即切去内含子，重新连按外显子，从而得到成熟。
而绝大多数的原核基因是连续的，没有内含子的间隔，转录产生成熟。
不仅如此，而且凡在代谢途径上功能有关的多个基因可能紧密相联，与它们的调控基因一起组成一个操纵子，转录到一条链。
分子生物学真核生物表达系统ppt课件
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
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6
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
12.02.2020
19
（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
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20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
真核生物表达系统汇总
2020年8月10日星期一
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
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（3）选择标记
18
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
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第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
真核生物基因表达
真核生物的基因表达调控染色质基因激活转录和转录后加工翻译和翻译后加工一、染色质水平基因表达调控（一）染色质结构与功能：常染色质（euchromatin）：，对DNase I敏感，DNA可降解为约200 bp 或其倍数的片断；基因表达处于活性状态。
异染色质（heterochromatin）：结构高度致密处于凝聚状态的染色质，对DNase I不敏感。
基因表达活性处于阻遏状态。
组成性异染色质：所有细胞，整个细胞周期都存在的异染色质。
其DNA不含基因，因而一直保持凝聚状态。
兼性异染色质（facultative heterochromatin）：在特定细胞，生长发育的特定阶段，由常染色质凝聚转变成的异染色质。
（二）染色质重塑：染色质重塑（chromatin remodeling）：与转录相关的染色质局部结构的改变称之。
主要有：核小体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
1、核小体重塑：（nucleosome remodeling）核小体重塑：ATP依赖性酶蛋白复合体参与的核小体的移位、替换和去组装改变。
核小体重塑过程：基因活化蛋白结合；ATP依赖性酶蛋白复合体结合转录活性区；ATP依赖性酶水解A TP，提供能量；移去或替换核小体。
2、DNA的甲基化：常见真核生物DNA5’-CpG-3’序列，即CpG岛(CpG-rich islands)胞嘧啶第5位C被甲基化。
甲基化程度使DNA结构稳定。
甲基化程度与基因表达活性呈反比关系。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
组蛋白的乙酰化与去乙酰化酶：组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyl transferases HATs ) 组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase HDAC）修饰位点：核心组蛋白外周结构域，氨基末端Lys残基的NH3。
真核生物基因表达调控的机制
真核生物基因表达调控的机制
真核生物基因表达调控的机制
真核生物中的基因表达调控是一个复杂而且受多种影响的过程，其机制也极为复杂，主要包括以下七个方面。
一、基因结构调控
基因的结构调控可以通过改变基因的翻译或者转录起始点，改变基因的拷贝数量，改变基因的外显子结构等，从而调节基因表达。
这种机制也称为“结构调控”。
二、编码序列调控
基因编码序列可以用来调节基因表达。
包括基因内部的种类多样性，基因突变等，都会影响基因编码序列，从而影响基因表达。
三、转录因子调控
转录因子可以调节基因转录的开始时间，结束时间，影响基因转录的效率，从而影响基因表达。
四、mRNA加工调控
当mRNA处于加工过程中，其加工过程也会受到调控，这种调控会影响mRNA的翻译效率，从而影响基因的表达。
五、mRNA翻译调控
翻译调控是一种比较常见的调控机制，它可通过影响mRNA的结构、翻译初始效率以及翻译开始时间来调节基因的表达。
六、蛋白质稳定性调控
蛋白质稳定性的调控是指通过改变蛋白质的稳定性，来影响基因
的表达。
七、基因激活与抑制
基因激活与抑制是指通过外界影响，改变激活因子或者抑制因子的表达，来影响基因表达。
以上就是真核生物基因表达调控的七个机制，同时，也是基因组学研究中需要重点关注的重要机制。
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核生物基因的表达调控
细胞周期与基因表达
G1期
细胞在G1期主要合成与DNA 复制有关的蛋白质，如复制因 子等。
G2期
G2期细胞主要合成与分裂期有 关的蛋白质，如微管蛋白等。
细胞周期
真核生物细胞周期分为间期和 分裂期，不同时期基因表达DNA的复制，同 时合成组蛋白等与染色体组装 有关的蛋白质。
翻译和后翻译修饰
翻译
mRNA在细胞质中被核糖体读取并翻译成蛋白质。翻译的效率受到多种因素的 影响，包括mRNA的浓度、核糖体的数量、以及各种翻译调控因子。
后翻译修饰
新合成的蛋白质经常需要进行翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、糖基化等，以 增加其活性和稳定性。这些修饰通常由特定的酶催化，并受到细胞内环境和信 号通路的调节。
肾上腺素
02
03
甲状腺激素
肾上腺素可以激活糖原分解和脂 肪分解相关基因的表达，提高能 量供应。
甲状腺激素可以促进细胞代谢， 提高基础代谢率，同时还可以影 响神经系统的发育。
神经递质对基因表达的调控
多巴胺
01
多巴胺可以影响奖赏和愉悦相关基因的表达，与成瘾行为和心
理健康有关。
5-羟色胺
02
5-羟色胺可以影响情绪和行为，与抑郁症和精神分裂症等精神
染色质重塑
染色质重塑是基因表达调控的另一重要机制，通过改变染色质的结构和组成，影响转录因 子的结合和RNA聚合酶的活性。
microRNA的调节
microRNA通过与mRNA结合，调控靶基因的表达水平，参与多种生物学过程，如发育、 代谢和应激反应等。
02
转录水平的调控
转录因子
1 2 3
转录因子概述
葡萄糖
葡萄糖水平可以影响胰岛素的分 泌，进而影响与胰岛素相关的基 因表达。
真核生物基因表达调控的特点及主要调控环节
真核生物基因表达调控的特点及主要调控环节真核生物基因表达调控是一个复杂而精密的系统，涉及到多种调控机制和调控环节。
通过这些调控机制和环节，真核生物能够在不同的细胞类型和不同的发育阶段中表达特定的基因，从而实现细胞功能的多样化和分化。
下面我们将详细介绍真核生物基因表达调控的特点以及主要调控环节。
首先，真核生物基因表达调控具有高度的精细性和特异性。
在真核生物细胞中，每个细胞都包含着相同的基因组，但不同细胞类型和组织会表达不同的基因。
这种差异性主要是通过转录调控来实现的，即通过对特定基因的转录进行调控，使得只有需要的基因在特定的时间和空间表达。
这种精细性和特异性的调控是真核生物细胞功能多样化和分化的重要基础。
其次，真核生物基因表达调控涉及多种调控机制和调控因子。
在真核生物细胞中，基因表达的调控是一个复杂的过程，需要多种调控机制和调控因子的参与。
其中，转录因子是最为重要的调控因子之一，它们可以结合到基因的启动子区域，促进或抑制该基因的转录。
此外，还有一些非编码RNA、表观遗传学修饰等调控机制也在基因表达调控中扮演着重要角色。
这些调控机制和调控因子相互作用，共同调控着基因的表达。
另外，真核生物基因表达调控还存在着复杂的信号传导网络。
在细胞内部，存在着多种信号通路和信号分子，它们可以感知外界环境的变化，并将这些信息传递给细胞核，从而影响基因的表达。
这些信号传导网络可以通过激活或抑制转录因子的活性，改变基因的表达水平。
通过这种方式，细胞可以根据外界环境的变化做出相应的调整，保持内部稳态。
综上所述，真核生物基因表达调控具有高度的精细性和特异性，涉及多种调控机制和调控因子，以及复杂的信号传导网络。
这些特点和调控环节共同构成了真核生物基因表达调控系统的核心。
通过深入研究这些调控机制和调控环节，可以更好地理解细胞功能的多样化和分化过程，为疾病的治疗和生命科学研究提供重要的理论基础。
蛋白表达形式
蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种：
1. 原核表达系统：原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一，主要利用大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞。
该系统具有操作简单、表达量高等优点，适用于小分子量蛋白的表达。
在原核表达系统中，常用的表达载体包括质粒和噬菌体。
质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中，然后将质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。
噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞，将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中，然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。
原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
2. 真核表达系统：真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞，可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。
除此之外，还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式，并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。
基因工程课件14 真核表达系统
单交换整合
双交换整合：置换，稳定性强
a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合
二、酵母表达系统
附加体型载体
大肠杆菌质粒，2μm质粒，酵母染色体选择标记基 因构成。
2μm 提供复制起始点和STB，使载体更稳定
拷贝数高
用于外源基因的表达
二、酵母表达系统
可以通过哪些方法增加质粒载体在酵母宿主细 胞中的稳定性，各有什么特征？
GGU (Gly/G)甘氨酸 GGC (Gly/G）甘氨酸 GGA (Gly/G）甘氨酸 GGG (Gly/G）甘氨酸
二、酵母表达系统
自主复制型质粒载体
定义：在E.coli质粒载体的基础上构建而来 复制方式：酵母基因组复制起始区,大肠杆菌质粒复制起始序列 筛选标记： E.coli +酵母 克隆位点来自E.coli质粒 转化率高、拷贝数高、不稳定
二、酵母表达系统
酵母人工染色体
ARS：酵母染色体自主 复制序列
TEL：端粒序列 CEN：着丝粒 选择标记基因
适合真核基因组的克隆与表达 研究
酵母表达系统
酿酒酵母， 1981 年 Hitzeman 等用酿酒酵母成功地
表达了人干扰素，但该系统具有一定的局限性， 缺乏强有力的启动子，分泌效率差，质粒不稳定 等。因此，人们在此基础上又寻找了新的酵母表 达系统——毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。
真核选择标记基因
cycloheximide 放线菌酮：由产生放线菌酮的放线 菌发酵液中提得的一种抗生素 ,cycloheximide 机理 是真核细胞蛋白合成抑制剂,毒性很强，现在已很 少用。
真核表达系统
真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。
例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
分子生物学-真核生物基因表达调控
3 基因重排与交换
将一个基因从远离启动子的地方移到距它很
Hale Waihona Puke 近的位点从而启动转录，这种方式称为基因 重排。
通过基因重排调节基因活性的典型例子是免
疫球蛋白和T-细胞受体基因的表达。
V、C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远。编码产生免疫球蛋白的细胞发 育分化时，通过染色体内DNA重组把4个相隔较远的基因片段连接在一起， 从而产生了具有表达活性的免疫球蛋白基因。
发育早期：只有一个着丝点行使功能，
从头合成型甲基转移酶：催化未甲基化的CpG成 为mCpG
基因丢失
在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基
因而去除这些基因的活性。某些原生动物、 线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许 多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体， 只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直 保留着整套的染色体。
一．
基因丢失： 在细胞分化过程中，某些原生动物、线虫 、昆虫等体细胞通过丢失某些基因而除去 这些基因的活性。 马蛔虫：只有一对染色体，染色体上有许 多着丝点。
假基因
是基因组中因突变而失活的基因，无蛋白质产
物。
一般是启动子出现问题。
8.2 DNA水平的基因表达调控
1染色质水平的调节：“开放”型活性染色质
（activechromatin）结构对转录的影响
2基因扩增
3基因重排与交换
4
DNA甲基化与基因活性的调控
1 染色质状态对基因表达的调控
能相关的基因，这些基因成套组合称为基因家族。 如：编码组蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白的基因都 属于基因家族 同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为 一个基因簇(gene cluster) 。
1、简单多基因家族
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4. 真核生物基因编码复杂
原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺 乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约 90%的序列功能至今还不清楚。 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物 为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含 子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获 得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳 动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。 真核生物mRNA 5’有帽状结构，3’末端有PolyA尾巴
Cis-acting factor
B gene
A gene
mRNA of A Protein A
mRNA of B Protein B
3、转录后的修饰
• 内含子的剪接
• 外显子的拼接 • mRNA的加尾和加帽
• mRNA的稳定性
4、翻译水平的调控
主要是microRNA对mRNA、tRNA 和rRNA的 调控
真核启动子结构模式图
上游启动子元件
核心启动子元件
哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件
元件名称 TATA box GC box 共同序列 TATAAAA GGGCGG 名称 TBP SP-1 结合的蛋白因子 分子量 结合DNA长度 ~ 10bp ~ 20bp
30,000 105,000
CAAT box
结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： • 起正性调节作用：启动子、增强子 • 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号
启动子
位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距 离作用、具有方向性、空间位臵较恒定。一般包括
• 核心启动子元件（core promoter elements) ：
受体细胞
据受体细胞及表达载体的不同分为3种：
• 酵母表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统 • 昆虫细胞表达系统
一、酵母表达系统
• 发酵简单、快速、便宜
• 真核生物，有翻译后修饰功能
• 可分泌表达，简化了纯化工艺
• 受体细胞安全
（一）酵母载体:
1、概念：
携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增
和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。
1、转录前水平(基因组水平)： gene level
基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋 白修饰，DNA甲基化等
2. 转录水平调控
顺式调控元件(cis-acting element)
反式作用因子(trans-acting factor)
（1 ）顺式调控元件(cis-acting element)
1. 真核基因组巨大
大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因
2. 真核生物遗传信息复杂
原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍 体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加 了基因表达调控的层次和复杂性。
3. LiCl法：做成感受态细胞
四）外源基因在母菌中的表达
1、胞内表达：直接表达外源基因，
如：HBsAg的酵母重组疫苗
2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列，
pGAPZ,利用因子分泌表达
五）高表达的策略
（ 1 ）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能 力强的GAP启动子
（ 2 ）提高整合拷贝数：可利用载体中提供的抗生素遗传标记， 以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。 （ 3 ）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变 发酵培养基的PH值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均可 避免产物被降解。 （4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。
• 酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp)
细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可 自主复制，但稳定性差 • 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因 (YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制
酵母2μM质粒
• 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动 子没有严格的专一性 • 无方向性（序列、位臵） • 远距离作用（1-4kB）
构建载体
• 无基因特异性
• 具组织特异性
沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式
与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加尾 信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成
2、组成元件：遗传标记
调控序列
1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定
营养标记基因：亮氨酸（Leu）
抗生素选择标记基因：Zeocin
2）调控序列
• ARS：酵母复制起始区(点)
• 酵母启动子：常用的有:
PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶)
酵母双杂交系统
Yeast Two-Hybrid System
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用 也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母 双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实 验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相 互作用对真核基因转录调控影响的实验。
酵母表达系统(yeast expression system)
哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression)
昆虫细胞表达系统(insect cell expression )
第一节 概述
一、真核基因组的复杂性
二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势
一、真核基因组的复杂性
二、 原核表达系统的局限性
1、没有转录后的剪接和加工系统
2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基 化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白 的活性。
3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定
易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易 出现信号肽不被切割，或不在特异位臵上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低
第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system
内 容
• 概述( introduction ) • 真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation)
• 真核表达系统(eukaryotic gene expression system)
指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的 精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的 TATA-box • 上游启动子元件（upstream promoter elements)
包括 -70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的 基础效率 • 组织特异性元件 • 诱导性启动子元件
Octamer
GGCCAATCT
ATTTGCAT
CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Oct-1 Oct-2 76,000 53,000 ~ 20bp ~ 23bp ~ 10bp 20bp
kB ATF
GGGACTTTCC GTGACGT
NFkB 44,000 AFT ?
增强子(enhancer) • 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件
5、翻译后的调控
• • • • • •
切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解
第三节 真核表达系统
组成： 真核表达载体 受体细胞
真核表达载体
适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。
真核载体根据受体不同，又可分为几种：
• 酵母表达载体
• 哺乳动物细胞表达载体
• 昆虫杆状病毒表达载体
3. 真核生物基因协调表达
细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同 开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是 单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。
真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚 基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生 物基因协调表达要比原核生物复杂得多。
Features of Eukaryotic gene structure and expression
（一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面
（二）真核基因表达的调控模式
真核基因表达的调控模式
( The regulating model of eukaryotic gene expression)
（2）反式作用因子(trans-acting factor)
由位于不同或相同染色体上相距较远的 基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控
元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转
录活性。
P
Trans-acting factor
DNA
转录信号1
Trans-acting factor (DNA结合蛋白）
(3) 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)----克隆大片段DNA