同源重组的细胞与分子机制 (1)
同源重组修复的分子机制和应用
同源重组修复的分子机制和应用同源重组修复（Homologous Recombination，简称HR）是细胞见于DNA双链断裂后进行的一种高保真修复方式。
经HR修复的损伤位点通常具有高度同源性，即已经断裂的某一DNA分子和其他未断裂的染色体上存在一段较为相似的DNA序列。
在HR修复过程中，这段相同的DNA序列与断裂位点发生配对，然后进行基因重组，形成一根新的DNA链，进而完成修复过程。
HR是人体内最主要的两种DNA双链断裂修复方式之一，另一种则为非同源端接（Non-homologous End Joining，简称NHEJ）。
HR是一个复杂的分子机制，包括了细胞内许多不同的蛋白质、DNA序列和细胞信号通路参数。
这些蛋白质主要涉及到DSB （Double strand break）识别、同源序列搜寻、DNA配对、DNA链转化、负向调控、结构复选识别、DNA透析等过程。
DSB识别：在HR的启动过程中，特定的DSB识别蛋白会发现DNA双链断裂位点，并进行下一步的操作。
同源序列搜寻：接下来，蛋白会朝向有相似的DNA序列的其他染色体进行搜索。
一旦找到相同的DNA序列，它就会开始尝试与该序列配对，并试图形成一个三联体结构。
DNA配对：这个过程中，配对的蛋白会调控两根不同DNA链的伸缩，使它们可以相互匹配。
这个过程的成功需要调节蛋白的正确组装。
DNA链转化：接下来，两根链之间的电子密度开始转移，产生一个相互连接的DNA链。
负向调控：这个过程需要结果DNA分子的精确剪切，以便它们可以重新形成一个连续的DNA分子。
结构复选识别：在转化完成后，一个高质量的DNA链新生的脱氧核糖核酸基团可以通过一个结构复选蛋白的帮助，得到正确的定序，从而避免它们可能发生的错误。
DNA透析：最终，DNA链的合成是由一个DNA合成酶完成的。
这个酶确保产生的DNA链是高质量、高同源性的。
应用方面，HR是一个非常有用的分子技术，它被广泛用于生命科学、医学等诸多领域。
06.第六章-遗传重组的分子机理
• Mu的DNA是线型的，两端没有粘性末端，而是类 似于IS的序列，并有与转座有关的基因A和基因B ， 其整合方式与λ噬菌体不同，不是位点专一性的整 合和切除，而是类似于转座因子，其末端常常带 有一小段宿主DNA，因而可以引起转导。
model): DNA双链的断裂与重接
3)Holliday模型：异源双链
(heteroduplex)的断裂与重接
4)Meselon-Radding 模型：
1.Holliday 模型
a) 同源染色体联会
b) 内切酶切割非姊妹染 色单体DNA
c) 交换重接形成交联桥 结构(cross-bridge
structure)
A: phe- try- tyr- × B: met- his-
苯丙AA 色AA 酪AA
甲硫AA 组AA
↓
原养型菌落
phe+ try+ tyr+ met+ his+
问题：是接合引起的？是转化引起的？
U型管实验
• 但在这里，结果却获 得了原养型菌株，说 明有一种可通过滤膜 的过滤性因子(FA)， 细菌不必直接接触即 可进行基因转移
遗传学讲义 第六章 遗传重组的分子基础
中国海洋大学 生命学院 汪小龙 xiaolong@
1、遗传重组的类型
(1) 同源重组(homologous recombination)
又叫普遍性重组(generalized recombination) ，大范围同源序 列对等交换。真核生物减数分裂中同源染色体联会，非姊妹 染色单体之间的交换就是同源重组。需要重组蛋白因子参与， 如E.coli. 的RecA.参与重组，又叫依赖于RecA的重组（RecAdependent recombination)；
同源重组的分子机制
同源重组的分子机制一、断裂重接模型（breakage joining model）C．D．Darlington 1936年提出。
在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂，然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。
二、基因转换现象Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊孢子灰色，g+决定子囊孢子的黑色，在g+×g-的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5∶3分离，0.05%是6∶2分离，0.008％是3∶1∶1∶3（或异常4∶4）分离。
图示． (1)一个孢子中的两个孢子有着不同的基因型。
(2)分离比例不是4∶4。
(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。
断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H．温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。
好象是由于一个基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换（gene conversion）。
以后由于发现一个基因发生基因转变时，它两旁的基因常同时发生重组：在5∶3和6∶2分离的子囊中，大约有30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。
所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。
因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。
三、同源重组的Holliday模型1964年，R. Holliday提出了重组的杂合DNA模型(hybrid DNA mode)，并作修正。
图示．过程：A．同源的非姊妹染色体的DNA配对。
B-C．同源非姊妹染色单体DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下，在相同位置上同时切开。
D．切开单链交换重接，形成交联桥结构（cross-bridged structure）。
E．交联桥的位置可以靠拉链式活动，沿着配对DNA分子“传播”—桥迁（Bridge migration），其中互补碱基间形成的氢键从一条链改变另一条链。
分子生物学名词解释、简答题答案
名词解释：1. 断裂基因：含有内含子的基因。
2. 假基因：DNA序列与有功能的基因相似，但不能表达有功能的基因产物。
3. 沉默突变：突变的密码子编码同样的氨基酸，不会引起产物的组成和结构上的改变。
4. 无义突变：使某氨基酸的密码子变为终止密码子，导致肽链合成中断。
5. 移码突变：又称移框突变，在基因的编码区缺失或插入一个或多个核苷酸，且缺失或插入的核苷酸不是3的倍数，造成了阅读框架的改变。
6. 转座子：发生转座的DNA片段。
7. 流产合成：若δ因子未能脱离核心酶，则新合成的RNA小片段会脱离复合物而重新启动转录。
这种现象称无效合成或流产合成。
8. 启动子：是连接在基因5’端上游的DNA序列，是转录起始时RNA聚合酶识别，结合的特定部位。
9. 操纵子：由操纵基因以及紧接着的若干结构基因共同组成的一个超基因的功能单位。
其中结构基因的转录由操纵基因所控制。
10. 调控基因：通过翻译和转录产生调节蛋白，该蛋白与操纵基因相互作用，控制下游基因转录。
11. 操纵基因：指能被调控蛋白质特异性结合的一段DNA序列，位于启动子和操纵基因之间，常与启动子临近或部分重叠。
12. 阻遏蛋白：在没有调节蛋白存在时，基因是表达的，加入调节蛋白后基因表达被关闭，为负调控，其调节蛋白称为阻遏蛋白。
13. 衰减子：当mRNA开始合成后，除非培养基中完全不含色氨酸，否则转录总是提前终止，产生仅有约140nt的RNA分子。
这个区域称为衰减子或弱化子。
14. 分解物阻遏：在培养基中同时加入葡萄糖时，细菌则优先利用葡萄糖。
只有当葡萄糖耗尽时，乳糖才能诱导基因的表达。
15. 绝缘子：真核生物基因组得调控元件之一，亦为一种边界元件。
16.启动子P:转录起始时RNA聚合酶识别、结合的特定部位。
17.结构基因:编码蛋白质或功能RNA的基因。
18.操纵基因0:能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。
19.调节基因:编码合成参与基因表达调控的蛋白质(调节蛋白)的特异DNA序列。
同源重组
单链的侵入（strand invasion）由RecA蛋白介导。
RecA是一种单链DNA结合蛋白，参与大肠杆菌中所有 的同源重组事件。它催化一个双链DNA分子的3－末端 单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区， 同时置换出同源单链，形成Holliday结构。
RecA介导的链交换可以分为三个阶段：RecA聚集在
SSB所结合的单链DNA上，而Mus81蛋白可能是拆分 Holliday中间体的酶。
二、位点特异性重组
位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依
赖于DNA顺序的同源性，由能识别特异DNA序列的蛋白质介导，
并不需要RecA蛋白和单链DNA。 λ噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原
在断裂处，MRX酶复合体利用其5’→3’的外切酶活性
降解DNA，生成3’单链末端，其长度通常可达1 Kb或更 长。MRX酶复合体由Mre11，Rad50和Xrs2三个亚基组成， 并以三个亚基的首字母命名。MRX酶复合体还被认为能 除去与DNA相连的Spo11。
在真核细胞中已经发现了两种与细菌RecA蛋白同源
分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋 白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday 分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶，但
RuvB自身不能有效地与DNA结合，它需要与RuvA一起
起作用。RuvC蛋白催化断裂反应，切开极性相同的两 条单链，拆分Holliday 中间体。
物种生存具有重要意义。通过重组实现基因的重新组合使
物种能够更快地适应环境，加快进化的过程。此外，DNA 重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤 修复和突变中发挥重要作用。
同源重组的原理及过程
同源重组的原理及过程【最新版】目录1.什么是同源重组2.同源重组的基本过程3.同源重组的相关酶及其功能4.同源重组的种类5.异常重组6.总结正文一、什么是同源重组同源重组是分子生物学中的一个基本概念，它指的是在 DNA 双链断裂后，通过引入断裂的 DNA 片段并将其与同源 DNA 分子连接起来，从而完成 DNA 修复的过程。
在这个过程中，需要通过一定的机制来保证连接的准确性，这个机制就是同源重组。
二、同源重组的基本过程同源重组的过程可以分为以下几个步骤：1.两个同源 DNA 分子的联会：在 DNA 双链断裂后，两个同源 DNA 分子会在断裂部位形成一个联会结构，从而为后续的修复提供准确的模板。
2.引入断裂 DNA：在联会结构形成后，需要将断裂的 DNA 片段引入到联会结构中，这样才能保证后续的修复能够准确地进行。
3.在两条重组 DNA 间形成碱基互补的段片段起始区：在断裂 DNA 片段被引入到联会结构后，会在两条重组 DNA 间形成一个碱基互补的段片段起始区，这个起始区将为后续的链入侵提供起点。
4.链入侵后两个 DNA 分子相互交叉的 DNA 链联系在一起：在形成碱基互补的段片段起始区后，断裂 DNA 片段会通过链入侵的方式与同源DNA 分子连接起来，从而使得两条 DNA 分子相互交叉的 DNA 链联系在一起。
5.Holliday 联接体的剪切：在链入侵完成后，会形成一个称为Holliday 联接体的结构，这个结构需要通过剪切来完成 DNA 修复的最后一步。
三、同源重组的相关酶及其功能在同源重组的过程中，需要通过一些酶的参与来完成 DNA 的修复，这些酶包括：1.RecBCD：具有解螺旋核酸内切酶活性，能拆分 Holliday 结构。
2.RecA：能促进同源 DNA 单链的结合，具有单链、双链结合活性，NTP 酶活性。
四、同源重组的种类同源重组可以分为以下几种类型：1.位点特异性重组：这种类型的重组需要特异性位点和特异性位点的核酸内切酶参与。
DNA同源重组修复的分子机制
・综述・作者单位:300192 天津,中国医学科学院放射医学研究所DNA 同源重组修复的分子机制王勇 樊飞跃 电离辐射直接造成生物靶分子细胞DNA 的损伤,DNA 的损伤类型很多,其中以DNA 双链断裂(double strand break ,DS B )最为严重。
DNA DS B 的修复较其他类型的DNA 损伤更加困难,不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡,而修复不当则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等,从而易于形成肿瘤等疾病[1]。
DNA 损伤的不完全修复可导致基因组不稳定,机体细胞为了对抗损伤,发展出多个修复系统来保证基因组的完整性,同源重组修复(hom olog ous recombinationrepair ,HRR )是DNA DS B 损伤修复的主要方式,对于保持哺乳动物细胞的基因组完整性十分重要[2]。
重组即遗传物质的重排,同源重组是指发生在同源DNA 序列间的重组,主要是利用DNA 序列间的同源性来识别,而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。
本文综述了国外近来对HRR 分子机制的研究进展,包括引发HRR 的DNA 损伤机制;HRR 的基本修复过程和多条修复通路;HRR 关键分子重要功能的实现机制;HRR 与细胞周期调控等其他事件的相互关系;辐射和HRR 及其与肿瘤之间的关系。
11DNA 损伤的感受识别:HRR 参与的蛋白质有RAD51,RAD51b ,c ,d ,RAD52,RAD54,BRC A1,BRC A2,XRCC2,XRCC3和MRN 复合物等,另外还需大量起始和损伤应激感受分子,包括AT M ,ATR 和DNA 2PK cs [3]。
细胞在受到电离辐射照射后,一系列重组或修复蛋白及复合物重新定位形成核焦点,以应答DNA 损伤。
这些蛋白有γ2H2AX ,AT M ,RAD51,BRC A1,BRC A2,NBS1,RPA 和MRN ,它们相互作用,完成DNA 损伤信号的接受功能并转导信号给其他蛋白质,介导并协调包括周期检控点、凋亡、修复的损伤应答。
7 第七章__分子水平的同源重组_
6. RuvAB复合物特异性识别Holliday接合点 RuvAB复合物特异性识别 复合物特异性识别Holliday接合点 并促进分支转移（ migration）。 并促进分支转移（branch migration）。
完成了重组的链渗入后，两个重组DNA分子通过一个称为 分子通过一个称为Holliday 完成了重组的链渗入后，两个重组DNA分子通过一个称为Holliday 接合点的DNA分支连接起来 分支位点的移动需要两个同源DNA二聚体间 分支连接起来。 接合点的DNA分支连接起来。分支位点的移动需要两个同源DNA二聚体间 碱基对的交换。 碱基对的交换。
3. 遗传重组的类型 （1）同源重组
--涉及大片段同源序列之间的交换。如真核生物减数分 --涉及大片段同源序列之间的交换 涉及大片段同源序列之间的交换。 裂过程发生的交互重组；细菌的转化、接合、 裂过程发生的交互重组；细菌的转化、接合、普遍性转导 过程发生的单向重组。主要特点是需要RecA蛋白的参与 蛋白的参与。 过程发生的单向重组。主要特点是需要RecA蛋白的参与。
4. 在RecA纤丝内建立 RecA纤丝内建立 新的碱基配对伴侣。 新的碱基配对伴侣。
寻找同源性的两步模型与RecA 寻找同源性的两步模型与RecA 纤丝内DNA链的交换。 纤丝内DNA链的交换。
5. RecA同源物存在于 RecA同源物存在于 所有生物中。 所有生物中。
三种生物的RecA样蛋白质。 三种生物的RecA样蛋白质。
△由于独立分配或交换在后代中出现原来没有基因组合。 由于独立分配或交换在后代中出现原来没有基因组合。 DNA从一个细胞转移至另一个细胞 从一个细胞转移至另一个细胞， △DNA从一个细胞转移至另一个细胞，并在其中形成新的 遗传信息的结合过程。 遗传信息的结合过程。 核酸分子中一段核苷酸序列的重新组合。 △ 核酸分子中一段核苷酸序列的重新组合。 广义概念——任何遗传基因型变化的基因交流过程 任何遗传基因型变化的基因交流过程。 △ 广义概念——任何遗传基因型变化的基因交流过程。 狭义概念——基因交流或重排的过程 基因交流或重排的过程。 △ 狭义概念——基因交流或重排的过程。
同源重组的分子机制_2.pptx
四分子分析
两个基因作图原理与方法
非顺序四分子遗传分析
相关概念：四分子、顺序四分子、第一次分裂分离(MI模式)、 第二次分裂分离(MII模式)、子囊型(PD、NPD和T)
第六章 同源重组的分子机制
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
一、概念
同源重组：依赖大范围的DNA同源序列的联会，重组过 程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。
1、异常分离与基因转变 粗糙脉孢菌： pdxp：酸度敏感的VB6依赖型 pdx： 酸度不敏感的VB6依赖型
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
+ pdxp
× pdx +
585个子囊中
孢子对
①
子囊
②
③
④
1 2
? + pdxp pdx +
+ + pdx +
+ + pdx + + pdxp + pdxp
3. 切开的单链交换重接;
4. 形成交联桥结构； 5. 分支迁移：形成一大段异源 4
双链DNA(Holliday结构)
5
7
6. 绕交联桥旋转1800，形成
Holliday异构体；
7. 切开与重接：
左右切，形成非重组体
上下切，形成重组体。
支持Holliday遗传重组模型的证据： 1、形态学上，Holliday中间体(Chi 结构)的电镜照片；
第六章 同源重组的分子机制
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
左右切
异源双链区
D/d
A
G
B
A
A
B
原核生物的同源重组
原核生物的同源重组在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。
同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。
同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。
3.1.1 原核细菌的基因转移程序原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种：1．Ca2+诱导转化法1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收 噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。
将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。
此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。
经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。
此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。
1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。
目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。
同源重组的分子机制PPT课件
pdx +
--
-+
-+
-+
+
+
+
+
+-
+-
-+
-+
-+
基因转-变+(gene conve-rs-ion)：一个基因- 转+ 变为它的等位
基因的遗++ 传学现象（源++于基因内重组）。++
+-
+-
+-
-+
-+
-+
-+
+-
+
+-
+
+-
染色单体转变粪生粪壳菌(Oliv半e)染: 色g单+ ×体转g 变-
A
B
a
C
b
a
T
b
A
G
b
A
A
b
a
T
B
a
C
B
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
Holliday 模型中，由于重组而产生的异源双链区存在 不配对碱基，可被细胞内的修复系统能够识别并以一条链 为模板进行切除修复：
(1). 两个杂种分子均未得到校正，有丝分裂后分离形成4:4 或 3:1:1:3的异常孢子分离比，属于半染色单体转变；
基因转变的实质：重组过程中留下的局部异源双链 区，在细胞内的修复系统识别下不同的修复产生的 结果；
哈工大-遗传学
第六章 同源重组的分子机制
哈工大-遗传学
原核生物的同源重组
原核生物的同源重组在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。
同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。
同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。
3.1.1 原核细菌的基因转移程序原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种：1．Ca2+诱导转化法1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收 噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。
将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。
此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。
经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。
此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。
1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。
目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。
同源重组的分子机制
同源重组的分子机制同源重组是指在一些生物体内，两个或多个相同的DNA分子发生断裂后重新联接，形成新的DNA分子。
同源重组在维持基因组的稳定性、遗传多样性和进化中起到了重要的作用。
下面将详细介绍同源重组的分子机制。
同源重组发生的分子机制主要包括以下几个步骤：1.DNA的双链断裂：同源重组的第一步是将DNA分子的双链断裂，产生“剪切”点。
这个过程通常由核酸内切酶或其他切割酶完成。
2.定向修复：一旦DNA双链断裂，细胞会启动DNA损伤修复机制。
同源重组的关键步骤是定向修复，即通过与另一个同源DNA分子的配对，完成失配碱基的对齐和DNA链的延伸。
3. 合成DNA片段的消旋：在定向修复过程中，DNA链被切断并重新配对。
这会产生修复延伸片段，通常称为D-loop。
D-loop中未配对的DNA片段称为Holliday结构。
4. 构建交换结构：Holliday结构是同源重组的关键中间产物。
它可以被随后的DNA解旋酶切割，使两个重组DNA分子交换部分DNA片段。
这就形成了交换结构，也称为交叉结构。
5.交叉解除：交叉结构需要通过交叉解除酶进行解旋。
交叉解除酶能够切割并重新连接DNA链，使两个DNA分子在重新联接后恢复原始的连续性。
总的来说，同源重组是通过DNA分子的双链断裂、定向修复、合成DNA片段的消旋、构建交换结构和最后的交叉解除等一系列分子机制来实现的。
同源重组除了上述的分子机制外，还受到一些调控因子的控制。
例如，同源重组过程中参与的酶和蛋白质需要进行相互作用，并受到调控因子的调控。
这些调控因子包括DNA损伤修复蛋白、组蛋白修饰酶、DNA结合蛋白等。
同时，在同源重组的整个过程中，细胞还需要保持恰当的染色质结构和空间组织。
同源重组在生物体中具有多种功能。
一方面，同源重组能够实现DNA分子的修复和保护，维持基因组的稳定性。
另一方面，同源重组还是基因重组和遗传多样性的重要机制之一、在生殖细胞的形成过程中，同源重组可以通过重组DNA片段的交换来增加基因组的多样性。
同源重组酶工作原理
同源重组酶工作原理同源重组酶是一种重要的酶类，它可以促进DNA分子在不同的位置之间发生重组，从而实现DNA片段的重组、插入、剪切等操作。
同源重组酶在生物学研究、基因工程、生物医学等领域都有着广泛的应用，成为了现代生物技术的重要工具之一。
同源重组酶工作原理主要涉及到DNA分子的结构和功能、DNA复制和修复机制等方面的知识。
下面将从这些方面逐一介绍。
一、DNA分子的结构和功能DNA是生物体内存储遗传信息的重要分子，它由四种碱基（腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C）组成的碱基对相互配对形成了双螺旋结构。
DNA分子的主要功能是存储和传递遗传信息，它通过遗传密码的方式指导生物体的生长发育、代谢活动等各种生命过程。
二、DNA复制和修复机制DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA分子通过模板作用合成新的DNA分子的过程。
DNA复制的过程包括DNA双链的分离、DNA聚合酶的作用、DNA链的连接等步骤。
DNA复制是生物体维持遗传信息稳定性的基础，它在生命过程中扮演着至关重要的角色。
DNA修复是指在DNA受到损伤或者错误的情况下，通过一系列的修复机制使其恢复正常的过程。
DNA修复的主要机制包括直接修复、错配修复、碱基切除修复、重组修复等。
DNA修复机制可以保证生物体的遗传信息的准确性和完整性，同时也是维持生物体正常生命活动的基础。
三、同源重组酶的作用原理同源重组酶是一种能够催化DNA分子在不同位置之间发生重组的酶类。
同源重组酶主要作用于DNA分子中的同源序列，即两个DNA 分子中具有相同序列的区域。
同源重组酶通过识别同源序列，将两个DNA分子在同源序列处断裂，并将它们重新组合成一个新的DNA分子。
同源重组酶的作用过程主要包括以下几个步骤：1. DNA分子的断裂：同源重组酶在同源序列的位置识别并结合，促进DNA双链在同源序列处发生断裂。
2. 末端处理：断裂后的DNA末端需要经过一系列处理，包括去除末端碱基、平滑末端等操作，以便于末端的配对。
武汉大学遗传学第6章真核生物重组的分子机制
6.3.3
联会复合体与重组
在减数分裂过程中，同源染色体配对形成联会复合体。 多年来，认为联会复合体与重组有关，有可能是DNA 重组 的必要前提。而近年研究表明，联会复合体是重组的结果， 而不是原因。
（1） 联会复合体在双链断裂后形成 对酵母的研究结果证明，不论是同源重组还是位点专一 性重组，只有双链断裂才能起始重组。 双链断裂也发生在减数分裂早期，而且是在联会复合体 形成之前
（2） 同源染色体配对与联会复合体 的形成 是两个独立的过程
突变可以发生在染色体配对或是联会复合体形成的任一 过程，并且彼此互不干涉。Zip2突变型中染色体可以配对， 但不能形成联会复合体，所以同源染色体之间的识别不依赖 于重组或是联会复合体的形成 。在rad 50突变体中，双链 断裂后的5′端与SpoⅡ蛋白相连［图6－15（b）］ 。只有 SpoⅡ 被移走后，核酸酶才能发挥作用，并证明至少有9种 其他蛋白质共同参与双链断裂过程，一组蛋白质将双链断裂 端转变为3′羟基突出的单链末端；另一组蛋白质使单链末 端侵入同源双链DNA分子。 图6－15（b） 迄今还不能完全揭示重组的发生与所观察到的不同结 构——重组结与交叉的联系，且在分子水平上阐明其本质。
虽然Holliday模型以及随后的Meselson和Radding所作的修改可以解释生物 中发生的大多数同源重组事件，但仍有一些例外的重组现象，最典型的例子为基 因转换(gene conversion)。基因转换首先在酵母及真菌中被发现，现已证实在 许多生物中存在。酵母中配子融合产生杂合子，后者经减数分裂形成有4个孢子 的子囊。假如配子在某一座位有不同的等位基因，正常情况下2个孢子将表现同 一基因型，另2个孢子表现另一基因型。但有时会出现例外，即这种2：2的分离 比例由3：1比例取代。这种现象被称为基因转换，即一种等位基因形式转变为另 一种等位基因形式，只发生在减数分裂时期。 有一种双链断裂模型用于解释重组过程中发生的基因转换事件，它们并非由 单链缺口起始，而是先在1个双链分子中产生断裂，即2个单链在同一位置产生缺 口,然后将这2个缺口转移到同源的另一双链分子。 （图：哺乳动物DNA双链断裂重组机制）
同源重组的细胞与分子机制 (1)
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
MRX和Top3–Rmi1的促进作用
1. MRX和Top3–Rmi1对剪切的影响被定 义为一定用量的Dna2和Sgs1对均匀标 记的DNA的剪切效率。 2. 尽管Sgs1 / Dna2 / RPA的组合能够介 导剪切，但MRX或Top3-Rmi1的添加 分别刺激反应大约四倍或八倍。 3. 最有效的剪切体系是MRX和Top3Rmi1两者均加入。
4. 单独的MRX或Top3-Rmi1可以刺激 Sgs1介导的3-kb底物的解旋（图C）， 并且具有加和效应。
促进作用的具体机制
1. 通过His6标签（Nickel）或FLAG标签（a-FLAG） 下拉与FLAG-His6标记的Dna2或Sgs1，以测试它 们与MRX（a）或Top3-Rmi1复合物（b）的 结合程度。 2. MRX与Sgs1结合较强，也与Dna2结合。 3. 因为MRX会与DNA末端结合，所以它可能与 Sgs1和Dna2在DNA末端的聚集有关。这个理论 得到了实验的支持，因为已经预处理生成3'ssDNA末端的DNA可以被Sgs1–Dna2–RPA体系 高效地剪切，不论有无MRX。 4. Top3-Rmi1也与Sgs1结合，同时与Dna2之间有 较弱的相互作用。
①MRX与断裂处3'单链结合；
②STR在MRX的作用聚集在末 端； ③Sgs1从3'端向5'端运动，解旋 DNA； ④Dna2从5'端向3'端运动，逐渐 剪切5'端单链DNA；
同源重组
同源重组同源重组（Homologous Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。
目录1简介2基因敲除1. 2.1 定义2. 2.2 技术路线3转移法4DNA1简介同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。
同源重组同源重组反应通常根据交叉分子或holliday结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。
同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性，100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹染色体之间的同源重组，称为Homologous Recombination，而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组，则被称为Hemologus Recombination。
后者可被负责碱基错配对的蛋白如原核细胞内的MutS 或真核生物细胞内的MSH2-3等蛋白质“编辑”。
同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。
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用 失 活 的 D n a 2 - D 6 5 7 A 蛋 白 与 M r e 11 - 3 蛋白和3'端进行反应，我们发现是Dna2 核酸酶介导了剪切
即 使 加 入 锰 离 子 活 化 M r e 11 核 酸 酶 ， 5 ' 端 的剪切依旧完全依靠Dna2。
3
Sae2蛋白与初始剪切相关联，但它的添 4 加不影响剪切的效率或产品尺寸
0. Spo11蛋白引发DNA双链断裂，产生无
端粒保护的末端；
1. MRX利用它对DNA末端高亲和性的特点， 与末端相连，启动剪切机制； 2. STR复合物驱动DNA双链分离； 3. Dna2蛋白与RPA结合，一同切割5'端的 单链； 4. RPA同时与暴露的3'链结合，防止DNA 双链重新结合，也防止3'端被降解。
7
重建系统有助于了解人类DSB切除的机制，因为有证据表明在易发生癌症 的Bloom综合征中，突变的Sgs1同源物BLM以类似方式参与DSB处理。
8
同时，检测在线粒体和细胞核中发现的人类Dna2蛋白是否也是以类似于酵母 Dna2的方式介导染色体末端剪切是有很大意义的。
其它补充内容
酿酒酵母中的两种剪切途径
同源重组的细胞与分子机制
主讲人：陈峻松
content
结论与展望
02 01 03
文献分析
补充内容
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
Model for the reconstituted DNA motor-driven end resection pathway
Top3的作用
1. Top3-Rmi1和Sgs1共同作用可以 抑制有丝分裂交叉形成，这可能 是通过降解霍利迪连接体来实现。 2. 催化无效的top3-Y356F突变体不 影响剪切的效率。 与野生型 Top3对比可以证明top3-Y356F 突变体在剪切上没有缺陷。
3. 体外体系中，Sgs1，Rmi1和Top3均存在时 可以分解霍利迪连接体，但top3-Y356F突 变 体无法则无法做到。 4. top3-Y356F等位基因不能抑制top3Δ细胞中 较高水平的有丝分裂交叉。
1
需要核酸梅/解旋酶Dna2 ，和3'至5'解旋酶 Sgs1
2
由5'至3'双链DNA（dsDNA）外切核酸酶Exo1催化
MRX's different function in free end and blocked end
（1）free end ①The MRX complex is rapidly recruited to DNA ends upon break formation. ②The nuclease activity of Mre11 is not required for resection, but the MRX complex has a role to recruit components of the processive pathways that include either Sgs1-Dna2 or Exo1. ③In some cases, the structural role of the MRX complex can be bypassed.
进的效果。
3.RPA：The ssDNA-binding protein replication protein-A；
保护3'末端不被降解，加强Dna2对5'的特异性剪切。
4.Dna2：具有处理冈崎片段的功能，Dna2 核酸酶对剪切是必要的，而
Mre11 核酸酶并不必要。
对不同酶的作用分析
① 当Dna2, Sgs1或者RPA中的一个被 去掉时，DNA链几乎不被剪切；
C图：对5'端剪切产物的分析；
D图：（a)未断裂和断裂的DNA双链及其一端 被生物素标记的分子；（b)这些底物在与A 中相同的酶切体系下反应五分钟并分析产物；
对5'端的剪切特异性分析
通过对比试验可以看出，酶切体系对于 5'端的剪切效率远高于3’端： ① 相同反应时间，5'端剪切更快； ② 如果在双链一端加上保护结构生物素链霉素亲和物，那么被保 护的5'端就不会被剪切，而另一端在反应5min后几乎完全被剪切；
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
MRX和Top3–Rmi1的促进作用
1. MRX和Top3–Rmi1对剪切的影响被定 义为一定用量的Dna2和Sgs1对均匀标 记的DNA的剪切效率。 2. 尽管Sgs1 / Dna2 / RPA的组合能够介 导剪切，但MRX或Top3-Rmi1的添加 分别刺激反应大约四倍或八倍。 3. 最有效的剪切体系是MRX和Top3Rmi1两者均加入。
2. 在没有Dna2的情况下，我们发现DNA解旋强烈依赖于RPA。同时，hRPA （human RPA）或大肠杆菌的SSB也能够促进DNA解旋，但是却没有剪切的 效果。
3. yRPA（yeast RPA）在剪切中也有独特的作用。 yRPA能够和Dna2发生结合 作用，但是hRPA和SSB都不具备这一能力。
①MRX与断裂处3'单链结合；
②STR在MRX的作用聚集在末 端； ③Sgs1从3'端向5'端运动，解旋 DNA； ④Dna2从5'端向3'端运动，逐渐 剪切5'端单链DNA；
⑤RPA在另一侧暴露的3'单链上 结合。
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
3
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M R X 或 To p 3 - R m i 1 都 可 以 刺 激 S g s 1 介 导 的 解 旋 ， 两 者 共 同 参 与 具 有 加 和 效 果 。
（ 1 ） R PA 具 有 促 进 解 螺 旋 ， 增 强 D n a 2 的 5 ' 核 酸 内 切 酶 活 性 ， 保 护 3 ' - D N A ， 强 化 对5'-DNA特异性剪切的能力。 6 （ 2 ） R PA 可 能 通 过 促 进 剪 切 起 到 更 早 激 活 对 重 组 区 域 检 测 的 作 用 。 这 样 ， R PA 就 提供了一种将DSB末端处理与检测点激活相结合的手段。
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
Reconstitution and 5' polarity of DNA end resection.
B图：（a)对3'端标记的剪切效果与反应时 间的关系；（b）对5'端标记的剪切效果与 反应时间的关系；(c)三次平行实验的平均 值和标准差；
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
DNA解旋对ATP的依赖性
DNA解螺旋需要ATP,而且不能 ATP-γ-S或者AMP–PNP代替。
1.DNA剪切对ATP水解具有依赖性。
7. 部分缺陷的dna2-Δ405N突变蛋白与RPA的相互作用 较弱，受到yRPA的促进作用较弱，因此剪切效果明 显低于正常的Dna2。
总结：RPA促进了Dna2对5'端的特异性剪切， 同时通过与3'端单链相结合保护了3'端。
结论与展望
LOREM IPSUM DOLOR
1 2
剪切具有蛋白质特异性，特定的剪切酶不能被其它组合替代 DNA的解旋依赖于Sgs1蛋白 MRX利用它与DNA末端较高的亲和性，将Sgs1和Dna2聚集在 末端，从而高效地剪切。 To p 3 的 催 化 活 性 对 于 控 制 交 叉 互 换 是 必 要 的 ， 但 对 于 D S B 剪 切 是 不必要的。
② 在缺少Dna2的时候，底物任然能完 全解旋产生ssDNA，但在缺少Sgs1时 则不行；
③ DNA解旋一定程度上也依赖于RPA；
④ 缺少MRX或者Top3–Rmi1时DNA的 剪切效果被减弱。
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
5.结论：Sgs1解旋酶活性而不是Dna2解旋酶活性 对于DSB解螺旋是必需的
负责剪切工作的具体蛋白是Dna2核酸内切酶
1 Dna2蛋白具有剪切3'或5'核酸内切酶的 活 性 ， 而 M r e - 11 蛋 白 具 有 从 3 ' 性。
2
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
各个复合物及其功能
1.MRX：Mre11–Rad50–Xrs2 complex；
2.STR： Sgs1–Top3–Rmi1 complex；
Sgs1解旋酶促进DNA链的分离，而Top3–Rmi1复合物和MRX一同起到促