同源重组的细胞与分子机制 (1)

C图：对5'端剪切产物的分析；
D图：（a)未断裂和断裂的DNA双链及其一端 被生物素标记的分子；（b)这些底物在与A 中相同的酶切体系下反应五分钟并分析产物；
对5'端的剪切特异性分析
通过对比试验可以看出，酶切体系对于 5'端的剪切效率远高于3’端： ① 相同反应时间，5'端剪切更快； ② 如果在双链一端加上保护结构生物素链霉素亲和物，那么被保 护的5'端就不会被剪切，而另一端在反应5min后几乎完全被剪切；
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
MRX和Top3–Rmi1的促进作用
1. MRX和Top3–Rmi1对剪切的影响被定 义为一定用量的Dna2和Sgs1对均匀标 记的DNA的剪切效率。 2. 尽管Sgs1 / Dna2 / RPA的组合能够介 导剪切，但MRX或Top3-Rmi1的添加 分别刺激反应大约四倍或八倍。 3. 最有效的剪切体系是MRX和Top3Rmi1两者均加入。
参与剪切的蛋白质分子特异性
1.用Srs2解旋酶（在DNA损伤中起修复作用）代替Sgs1， 用Fen1（参与冈崎片段处理的5'FLAP内切核酸酶， RAD27基因的产物）代替Dna2。
2. Srs2和Fen1无法进行正常的剪切。
3. Srs2的缺失对DSB剪切的发生率和程度没有影响，并 且RAD27基因不能弥补pif1-m2 dna2Δ细胞的远程剪切缺 失。RAD27过表达（YEp24）也不能弥补dna2Δ细胞的 剪切缺失。
作者提出猜测：hRPA和SSB可能抑制了酵母Dna2的核酸酶活性。
4. 为了验证yRPA在剪切中的特异性，我们使用了 带有标记的3'-或5'- ssDNA末端的部分双链 DNA底物来检查yRPA，hRPA和SSB如何影响 Dna2的核酸酶活性。
5. 结果发现，yRPA通过Dna2增强了对5'-DNA剪 切，同时抑制了对3'-DNA剪切。 6. 重要的是，hRPA和SSB对Dna2核酸酶功能确实具 有很强的抑制作用。
2. 在没有Dna2的情况下，我们发现DNA解旋强烈依赖于RPA。同时，hRPA （human RPA）或大肠杆菌的SSB也能够促进DNA解旋，但是却没有剪切的 效果。
3. yRPA（yeast RPA）在剪切中也有独特的作用。 yRPA能够和Dna2发生结合 作用，但是hRPA和SSB都不具备这一能力。
③ 加保护物后最终产物含有5'端被保护的一条DNA单链；
其它验证剪切具有特异性的实验内容
1
超螺旋化的DNA不能被用 同样的酶组合剪切，这再 次证明了DNA剪切具有末 端特异性。
对5'端产物的分析
分别经过2min和5min后的5'端产 物：
①产物的大小从四到八个核苷酸。
②五核苷酸产物占绝对优势。
同源重组的分子机制
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
各个复合物及其功能
1.MRX：Mre11–Rad50–Xrs2 complex；
2.STR： Sgs1–Top3–Rmi1 complex；
Sgs1解旋酶促进DNA链的分离，而Top3–Rmi1复合物和MRX一同起到促
3
4 5
M R X 或 To p 3 - R m i 1 都 可 以 刺 激 S g s 1 介 导 的 解 旋 ， 两 者 共 同 参 与 具 有 加 和 效 果 。
（ 1 ） R PA 具 有 促 进 解 螺 旋 ， 增 强 D n a 2 的 5 ' 核 酸 内 切 酶 活 性 ， 保 护 3 ' - D N A ， 强 化 对5'-DNA特异性剪切的能力。 6 （ 2 ） R PA 可 能 通 过 促 进 剪 切 起 到 更 早 激 活 对 重 组 区 域 检 测 的 作 用 。 这 样 ， R PA 就 提供了一种将DSB末端处理与检测点激活相结合的手段。
同源重组的细胞与分子机制
主讲人：陈峻松
content
结论与展望
02 01 03
文献分析
补充内容
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
Model for the reconstituted DNA motor-driven end resection pathway
Dna2和Sgs1解旋酶对DNA剪切的必要性
2.DNA马达Sgs1和Dna2中的任一者或两者的功能可能是必 需的。
3.利用两种酶的失活突变体dna2-K1080E和sgs1-K706A来判 断哪种酶是解螺旋所必需的。
4.用sgs1-K706A替换Sgs1导致剪切失效， 但dna2-K1080E代替Dna2正常剪切。
7. 部分缺陷的dna2-Δ405N突变蛋白与RPA的相互作用 较弱，受到yRPA的促进作用较弱，因此剪切效果明 显低于正常的Dna2。
总结：RPA促进了Dna2对5'端的特异性剪切， 同时通过与3'端单链相结合保护了3'端。
结论与展望
LOREM IPSUM DOLOR
1 2
剪切具有蛋白质特异性，特定的剪切酶不能被其它组合替代 DNA的解旋依赖于Sgs1蛋白 MRX利用它与DNA末端较高的亲和性，将Sgs1和Dna2聚集在 末端，从而高效地剪切。 To p 3 的 催 化 活 性 对 于 控 制 交 叉 互 换 是 必 要 的 ， 但 对 于 D S B 剪 切 是 不必要的。
①MRX与断裂处3'单链结合；
②STR在MRX的作用聚集在末 端； ③Sgs1从3'端向5'端运动，解旋 DNA； ④Dna2从5'端向3'端运动，逐渐 剪切5'端单链DNA；
⑤RPA在另一侧暴露的3'单链上 结合。
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
5. 结论：Top3的催化活性对于控制交叉互换是 必要的，但对于DSB剪切是不必要的。
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
RPA的作用
1. 我们已经证实了DNA剪切对RPA的依赖，同时推测RPA通过分离由Sgs1产生 的ssDNA来促进DNA解旋。
用 失 活 的 D n a 2 - D 6 5 7 A 蛋 白 与 M r e 11 - 3 蛋白和3'端进行反应，我们发现是Dna2 核酸酶介导了剪切
即 使 加 入 锰 离 子 活 化 M r e 11 核 酸 酶 ， 5 ' 端 的剪切依旧完全依靠Dna2。
3
Sae2蛋白与初始剪切相关联，但它的添 4 加不影响剪切的效率或产品尺寸
4. 单独的MRX或Top3-Rmi1可以刺激 Sgs1介导的3-kb底物的解旋（图C）， 并且具有加和效应。
促进作用的具体机制
1. 通过His6标签（Nickel）或FLAG标签（a-FLAG） 下拉与FLAG-His6标记的Dna2或Sgs1，以测试它 们与MRX（a）或Top3-Rmi1复合物（b）的 结合程度。 2. MRX与Sgs1结合较强，也与Dna2结合。 3. 因为MRX会与DNA末端结合，所以它可能与 Sgs1和Dna2在DNA末端的聚集有关。这个理论 得到了实验的支持，因为已经预处理生成3'ssDNA末端的DNA可以被Sgs1–Dna2–RPA体系 高效地剪切，不论有无MRX。 4. Top3-Rmi1也与Sgs1结合，同时与Dna2之间有 较弱的相互作用。
进的效果。
3.RPA：The ssDNA-binding protein replication protein-A；
保护3'末端不被降解，加强Dna2对5'的特异性剪切。
4.Dna2：具有处理冈崎片段的功能，Dna2 核酸酶对剪切是必要的，而
Mre11 核酸酶并不必要。
对不同酶的作用分析
① 当Dna2, Sgs1或者RPA中的一个被 去掉时，DNA链几乎不被剪切；
1
需要核酸梅/解旋酶Dna2 ，和3'至5'解旋酶 Sgs1
2
由5'至3'双链DNA（dsDNA）外切核酸酶Exo1催化
MRX's different function in free end and blocked end
（1）free end ①The MRX complex is rapidly recruited to DNA ends upon break formation. ②The nuclease activity of Mre11 is not required for resection, but the MRX complex has a role to recruit components of the processive pathways that include either Sgs1-Dna2 or Exo1. ③In some cases, the structural role of the MRX complex can be bypassed.
Top3的作用
1. Top3-Rmi1和Sgs1共同作用可以 抑制有丝分裂交叉形成，这可能 是通过降解霍利迪连接体来实现。 2. 催化无效的top3-Y356F突变体不 影响剪切的效率。 与野生型 Top3对比可以证明top3-Y356F 突变体在剪切上没有缺陷。
3. 体外体系中，Sgs1，Rmi1和Top3均存在时 可以分解霍利迪连接体，但top3-Y356F突 变 体无法则无法做到。 4. top3-Y356F等位基因不能抑制top3Δ细胞中 较高水平的有丝分裂交叉。
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析
E
MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
DNA解旋对ATP的依赖性
DNA解螺旋需要ATP,而且不能 ATP-γ-S或者AMP–PNP代替。
1.DNA剪切对ATP水解具有依赖性。
5.结论：Sgs1解旋酶活性而不是Dna2解旋酶活性 对于DSB解螺旋是必需的
负责剪切工作的具体蛋白是Dna2核酸内切酶
1 Dna2蛋白具有剪切3'或5'核酸内切酶的 活 性 ， 而 M r e - 11 蛋 白 具 有 从 3 ' 到 5 ' 核 酸 内 切酶以及DNA结构特异性内切酶的活性。
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重建系统有助于了解人类DSB切除的机制，因为有证据表明在易发生癌症 的Bloom综合征中，突变的Sgs1同源物BLM以类似方式参与DSB处理。
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同时，检测在线粒体和细胞核中发现的人类Dna2蛋白是否也是以类似于酵母 Dna2的方式介导染色体末端剪切是有很大意义的。
其它补充内容
酿酒酵母中Fra Baidu bibliotek两种剪切途径
0. Spo11蛋白引发DNA双链断裂，产生无
端粒保护的末端；
1. MRX利用它对DNA末端高亲和性的特点， 与末端相连，启动剪切机制； 2. STR复合物驱动DNA双链分离； 3. Dna2蛋白与RPA结合，一同切割5'端的 单链； 4. RPA同时与暴露的3'链结合，防止DNA 双链重新结合，也防止3'端被降解。
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MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析
F
RPA的作用分析
Reconstitution and 5' polarity of DNA end resection.
B图：（a)对3'端标记的剪切效果与反应时 间的关系；（b）对5'端标记的剪切效果与 反应时间的关系；(c)三次平行实验的平均 值和标准差；
② 在缺少Dna2的时候，底物任然能完 全解旋产生ssDNA，但在缺少Sgs1时 则不行；
③ DNA解旋一定程度上也依赖于RPA；
④ 缺少MRX或者Top3–Rmi1时DNA的 剪切效果被减弱。
同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程；
B
C
各个复合物及其功能；
对5'端特异性剪切的验证
D
Dna2和Sgs1的剪切作用分析