大豆蛋白的提取与含量测定PPT演示文稿

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2、器材 (1)离心机 (2)烧杯 (3)滴管 (4)PH试纸等
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操作方法
1、水抽提 将豆粉5g用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添加
搅 拌 , 常 温 下 搅 拌 抽 提 1 5 min, 3800r/min 离 心 15min,取上清液,如上清液不清澈再经过滤。取上 清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定。
Folin酚法所用试剂是由两部分组成,试剂甲相当于双缩 脲试剂,可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸 和磷钨酸在碱性条件下不稳定,易被酚类还原而呈兰色(钼兰 和钨兰混合物)。
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由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色,溶液 兰色的深浅与蛋白浓度成正比。因此用Folin酚法测定 蛋白质含量,灵敏度较高。 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用,如果样 品酸度较高则显色较浅,要提高碳酸钠一氢氧化钠的 浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。 Folin酚法有不少个别改进的操作方法,但基本原理都 是一个,只是在各溶液的浓度及填加量上、保温的温 度及保温时间上有所不同而已,本实验所介绍的是本 室常用的,灵敏度较高的操作方法。
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试剂和器材
1、材料: 本实验所提取大豆蛋白水提取液,经合适稀释至可测 定范围。
2、试剂: (1)0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 (2)200μg/ml的标准酪(牛血清)蛋白溶液。 (3)Folin试剂甲:(俗称碱性铜试剂):10g NaoH溶于400ml水中,再加50gNa2CO3; 称0保.2存取5可g0C用.u5一SgO个酒4月;石。以酸上钾两溶钠液溶混于合8定0容m到lH520O0中m,l,再冰箱加
蛋白质产物重量
蛋白质产率=
×100%
原料总重量
Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分
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二、Folin酚法测定蛋白质含量
目的要求
掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法
实验原理
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质,如比重、紫外 吸收,折射率等测定而得知;或用化学方法,如定氮、双缩脲 反应,Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin 酚法是一般实验室中常用的方法,它们操作简便,迅速,不需 要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高,比双缩脲法灵敏 100倍。
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4、Folin试剂乙:在2升磨口回流装置的烧瓶内,加钨酸钠 (NaWO4·2H2O)100g,钼酸钠(NaMoO·2M2O)25g, 蒸馏水700ml,85%的磷酸50ml,浓盐酸100ml,充分 混合后,小火回流10小时,再加硫酸锂(Li2SO4)150g, 蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min,以驱除过量 的溴,冷却后定容到1000ml,过滤后呈金黄色,于棕色瓶 中保存,可使用多年。
大豆蛋白的提取与含量测定
指导老师 赵建军 曲宁 夏婷 孟繁新
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蛋白质性质与应用技术关系图

氨基酸
疏 水 性
纸 层 析
亲 水 性
酸 碱

极性
蛋白质
电荷
分 形子 状量
离子交换层析 电泳
离 心
凝 胶 层

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一、大豆蛋白的提取
目的要求
1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率
上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右, 几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的浓度作为 应用液,我们是把贮备液于作用前稀释18倍,使之浓度为 0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称 之为应用液,Folin试剂乙贮备液浓度的标定,一般是以酚 酞 为 指 示 剂 , 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1 mol/L 左 右 的 标 准 NaOH溶液,当溶液颜色由红变为紫灰色,再突然变成黑绿 既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙,终点不太好掌握, 溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色,再变为灰紫色为终点。
蛋白质标准液(ml) 0 (mg) 0
提取的样品液(ml)
0.2 0.04
0.4 0.08
0.6 0.12
0.8
1.0
0.16 0.2
0.8
PH7.8的buffer(ml)
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0
0.2
) Folin-甲试剂 (ml
1
1
1
1
1
1
1
于室温下不停地振荡10min
Folin-乙应用液(ml) 4
10
3、器材:
试管10支 试管架一个 移液管:(5ml、1ml) 移液管架 洗瓶 恒温水浴 723型分光光度计
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Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作:
取6支试管(干燥的)按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定 K=0.308 B=--0.009 R*R=0.9909
试管号 0 1 2 3 4 5 S
其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮,用滴 管少量多次慢慢滴加(搅拌),用6mol/L和1 mol/L HCL, 调 PH4.5~5.0,3800r/min, 离 心 1 5 min, 收集沉淀物,反复用丙酮搅拌洗涤离心2次,放入表面 皿上,60度烘干,得到粉末状蛋白质干粉,称重,计 算粗产率。
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4
4Байду номын сангаас
4
4
4
立即摇匀,在55℃恒温水浴中保温5min,用流水冷却1min后,测A650
A650值
? 0 0.184 0.317 0.425 0.536 0.668
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2、样品测定:取三支试管(平行)各加入待测的蛋白质样品液1ml和空
白 ,如下操作:
试管号
空白
1
2
蛋白质稀释液(ml) (mg)
0
PH7.8的buffer(ml)
实验原理
大豆中含有丰富的蛋白质、根据提取方法及其其性质的不同, 可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依 次用上述溶剂提取,并用有机溶剂沉淀,可制得各部分蛋白质的 干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。
称出提出蛋白质的重量,已知原料重量,可以求出蛋白质的收 率。
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试剂和器材
1、试剂 (1)10%Nacl (2)0.2%NaoH (3)75%乙醇 (4)6mol/L HCL (5) 1mol/L HCL (6)1 mol/L NaoH
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1
1
0
0
) 1 Folin-甲试剂 (ml
1
1
于室温下不停地振荡10min
4 Folin-乙应用液(ml)
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立即摇匀,在55℃恒温水浴中保温5min,用流水冷却1min后, 测A650
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