高速逆流色谱

• 以下两种疏水性范围很宽的体系：正己烷/ 乙酸乙酯/甲醇/正丁醇/水;氯仿/甲醇/水 • 对于未知样品一般采用正己烷/乙酸乙酯/甲 醇/水(1∶1∶1∶1)，通过检测样品在上下 相中的分配情况再进行修改。选到大概的 比例再进行试验，直到选到适当 的溶剂比 例。
HSCCC在分离中药单体中的应用（蒽醌类）
33.600
-10.000 0.00
24.00
48.00
72.00
96.00
120.00 144.00 168.00 192.00 216.00 240.00 [min]
250
实例
200
A1
Absorbance (OD280nm)
mAU (280nm)
200
B1
150
100
100
50
0
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
HSCCC在分离中药单体中的应用（生物碱类）
A
Absorbance (mAU) / 254 nm
实例4 吴茱萸生物碱的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5:5:7:5) 流速: 2.0 ml/min 转速：900 rpm 样品量：180 mg 粗提物 固定相保留：50% 机型：TBE-300A Ⅰ:吴茱萸碱 98.7％ 28 mg Ⅱ:吴茱萸次碱 98.4％ 19 mg Ⅲ:吴茱萸新碱 96.9％ 21 mg Ⅳ: 1-methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9pentadecadienyl-4-(1H)quinolone. 98.0％ 16 mg Ⅴ: 1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)quinolone 97.2％ 12 mg
0
Time (h)
10
20
30
40
T im e ( m in )
1 60
100
Absorbance (OD280nm)
80
A2
60
mAU (280nm)
1 20 8 0 4 0 0 0 1 0
B2
40
20
2 0
30
40
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time (h)
VI
400
200
0
100
200
300
400
500
Time/min
Journal of Chromatography A,2004,Volume 1052, Issues 1-2, Pages 217-221
HSCCC在分离中药单体中的应用（香豆素类）
实例2 蛇床子有效成分的分离
Asorbance (mAU)
固定相的保留
利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES） 从而实现流动相高速移动时固定相的保留
ຫໍສະໝຸດ Baidu
混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部
以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
Absorbance(mAU)
600
cinnamic acid
500
400
em odin aloe-emodin rhein physcion chrysophanol
300
200
100
0 0 10 20 30 40
Tim e/min
I II
1000
III
IV
V
Absorbance(mV)
800
600
140 120 Absorbance (OD280nm) 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time (h)
T im e ( m in )
2 0 0 mAU (280nm)
A3
B3
1 0 0
0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 T im e ( m in )
高速逆流色谱技术
1 高速逆流色谱原理 2 高速逆流色谱优点 3 高速逆流色谱应用
一、高速逆流色谱原理
液－液分配色谱
利用一种流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂( 利用一种流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定 两相溶剂 相和流动相) 螺旋管中高效地接触、混合、 相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传 中高效 递 其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟 乙烯管绕成的螺旋管中 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质 流动相以一定的速度通过固定相， 分配系数的不同依次洗脱而获得分离
800
Evodiamine
1-Methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9pentadecadienyl -4-(1H)-quinolone Evocarpine
600
Rutaecarpine 400
1-Methyl-2-dodecyl4-(1H)-quinolone
200
0 0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
1000
I II III
IV
V
VI
Absorbance (mV)
800
600
400
200
0
100
200
300
400
500
Time (min)
Journal of Chromatography A, 2004, Volume 1055, Issues 1-2, 71-76
HSCCC在分离中药单体中的应用(黄酮类)
HSCCC的工作流程
实物照片
二、高速逆流色谱优点
不用固态载体的高效液不用固态载体的高效液-液分配色谱技术
不存在样品的不可逆吸附，理论回收率 不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100% 样品负载能力强，制备量大， 样品负载能力强，制备量大，重现性好 操作成本低，无制备柱消耗， 操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低 可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件 操作简单， 操作简单，无需太多样品前处理
芦荟未知物
A 芦荟苷A 芦荟苷B
丹参提取物的HSCCC分离图谱 分离图谱 丹参提取物的
丹酚酸 B
沙棘提取物的HSCCC图谱 图谱 沙棘提取物的
异鼠李素
山奈酚 槲皮素
荔枝草提取物的HSCCC图谱 图谱 荔枝草提取物的
208.000 [mv]
高车前素
泽兰黄酮
164.400
120.800
未知物
77.200
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
三、高速逆流色谱应用
高速逆流色谱技术的应用领域
1 高速逆流色谱在中药现代化中的应用 2 高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用 3 高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用 4 高速逆流色谱在食品行业中的应用 5 高速逆流色谱在化学合成中的应用 6 高速逆流色谱在生物领域中的应用 7 高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用
实例1 大黄有效成分的分离
HSCCC条件： 固定相：乙醚 流动相：1%NaH2PO4-1%NaOH 梯度 洗脱(500min内,由100:0-0:100) 流速: 2.0 ml min-1 转速：800 rpm 样品量：120 mg 粗提物 固定相保留：40% 机型：TBE-300A Ⅰ：rhein（大黄酸）19 mg Ⅱ: cinnamic acid（苯乙烯酸）19 mg Ⅲ: emodin（大黄素）18 mg Ⅳ: aloe-emodin（芦荟大黄素）14 mg Ⅴ: chrysophanol （大黄酚）10 mg Ⅵ: physcion（大黄素甲醚）6 mg 纯度均在98％以上
Imperatorin 800
HSCCC条件： 溶剂系统: 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水 流动相：梯度洗脱
0-150 min:5:5:5:5下相 150-250 min:5:5:6:4下相 250 min后: 5:5:6.5:3.5下相
600 Bergapten Isopimpinellin Xanthotoxin 200 Unknown 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Osthole
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
1000
I
II
Time (min) IV V III
Absorbance (mV) / 254 nm
800
600
400
200 0 100 200 300 400 500 600
Time (min)
J. Chromatogr. A, 2005, vol 1074/1-2 pp. 139-144
芦荟提取物HSCCC分离图谱 分离图谱 芦荟提取物
HSCCC图谱
不同产地丹参提取物
HPLC图谱