高速逆流色谱法
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱法快速分离制备雷帕霉素工艺研究
种 发 酵 水 平 低 下 和 生 产 提 取 路 线 复 杂 ， 由于 雷 帕霉
经活 性炭 脱色 后 ，减压 浓缩 得 雷帕 霉素粗 提 取物 。
２２ ． ＨＳ Ｃ 分 离 雷帕霉 素粗提 物 Ｃ Ｃ
ｓ ｐ ｒ ｔ ｎ ａ ｄ ｐ ｒｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｐ ｍｙ ｉ ｏ ｆｒ ｎ ａ ｉ ｎｂ ｏｈ ｉ ｒ ｅ ｓ ａ ｅ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｕ ｉ ｃ ｔ ｆ ａ ａ ｃｎ ｆ ｍ ｅ ｍｅ ｔｔ ｒ ｔ ｌ ｇ — ｃ ｌ ｏ ｉ ｏ ｒ ｒ ｏ ｎ ａ
．
Ｋｅ ｒ ｓ Ｈ 曲一 ｅｄｃｕ ｔ － ｒ ｎ ｒｍａｏｒｐ ｙ Ｓｐ ｒｔ ｎａｄｐ ｒ ｃｔ ｎ Ｒ ｐ ｍｙｉ； ｃｌ ； ｕ ｔ ｙｗｏｄ ｉ ｓ ｅ ｎｅ ｃ ｒ ｔ ｈｏ ｔｇａｈ ； ｅ ａａｏ ｕｉ ａ ｏ ； ａ ａ ｃ Ｍｙ ｅ ａ Ｐ ｒｙ ｐ ｏ ｒｕ ｅ ｃ ｉ ｎ ｉ ｆ ｉ ｎ ｉ ｌ
２Ｌ ｚ ｏ ｏ ａ ｏ ａ ａｄｔ ｈ ｉａ ｃｌ ｇ ， ｕｈ ｕ６ ６ ０ ） ｕ ｈ ｕｖ ｃｔ ｎ ｌｎ ｃ ｎｃｌ ｏｌ ｅＬ ｚ ｏ ４ ０ ５ ｉ ｅ ｅ
Ａｂ ｔａ ｔ ０ｂｅｔ ｅ Ｔ ｅｑ ｉ ｐ ｒｔ ｎ ｔｏ ｆｈ ｐ ｍｙ ｉ ｏ ｆｒ ｎａｉ ｒｔ ｗ ｓ ｎ ｅｔ ａｅ ｓ ｃ ｒ ｊｃｉ ｈ ｕｃ ｓ ａａｉ ｈ ｄｏ ｅ ａ ａ ｃ ｆ ｍ ｍｅ ｔ ｏ ｂｏｈ ａ ｖ ｓ ｇ ｔｄ ｖ ｋｅ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｎｒ ｅ ｔｎ ｉ ｉ
（ Ｃ Ｃ ｔｃｎ ｌｇ ｓ ｍｐｏ ｅ ，ｎ ｉ ｅｅ ｔｏｖ ｎ ｓ ｍ ａ ａ ｚｄｆｒｈ ｉ ｒ ｕｉｎｅ ｃｅ ｃ． ｓ ｌ ＨＳ Ｃ ）ｅｈ ｏｏ ｙｗａ ｌ ｄ ａ ｄｄｆ ｒｎ ｌｅｔ ｙｔ ｗ ｓ ｎ ｌ ｅ ｅ ｓ ｉ ｔ ｆ ｉ ｙ Ｒｅｕｔ ｅ ｙ ｆ ｓ ｓ ｅ ａ ｙ ｏ ｔ ｄ ｔｂ ｏ ｉ ｎ ｓ
高速逆流色谱法
HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备 性分离。
参数
固定相 机理
溶质与固定相作用
上样量 分离效率
操作 费用 危险性
HSCCC
色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而 进行；
逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实 现分离；
分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯 度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。
（前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）
溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀 和溶解即可达到分离。
二、基本原理
现代逆流色谱仪器体系： 1. 流体静力学平衡体系
2. 流体动力学平衡体系（HSCCC体系） 仪器的两个特征：
a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴； b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，
能产生一个可变的离心力场。
通过公转、自转（同步 行星式运动）产生的二 维力场，保留两相中的 其中一相作为固定相；
广义定义： 1. 任何利用两相不混溶液体的色谱技术； 2. 其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管
或一系列的腔体中； —— 固定相 3. 同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。
—— 流动相
减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作 用；
不仅可以获得高纯度的分离组分；
同时具有较高的回收率和重现性。
离心沉淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱 的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶 解色谱。
高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分
1922010, Vol. 31, No. 20食品科学※工艺技术高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分郑允权 1 ，李泳宁 1 ，王阿万 2 ，陈芬玲 2 ，石贤爱 2 ，郭养浩 1 , 2 , *(1.福州大学药物生物技术与工程研究所，福建 福州 2.福建省医疗器械与医药技术重点实验室，福建 福州 350002； 350002)摘 要：采用高速逆流色谱法(HSCCC)分离纯化红曲发酵产品中 6 种 Azaphilone 类色素组分。
筛选弱极性分离溶剂 系统正己烷 - 醋酸乙酯 - 甲醇 - 水，研究 6 种色素组分在不同溶剂体系中的分配系数，建立两步逆流萃取分离的技术 路线。
经过 HPCCC 分离纯化和丙酮结晶操作，得到 6 种高纯度的 Azaphilone 类色素组分，纯度均大于 98.5%，得 率达到 81.40%～84.78%，所得的 6 种色素组分的摩尔吸光系数分别为 13313、13877、9380、9360、25621、25849 L/(mol·cm)。
本研究可提供一种新型的制备高纯度红曲 Azaphilone 类色素组分的技术路线。
关键词：红曲色素；高速逆流色谱；分离纯化Separation and Purification of Monascus Pigments by High-speed Counter-current ChromatographyZHENG Yun-quan1，LI Yong-ning1，WANG A-wan2，CHEN Fen-ling2，SHI Xian-ai 2，GUO Yang-hao1,2,* (1. Institute of Pharmaceutical Biotechnology and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China； 2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China) Abstract： azaphilone-type pigments were separated from Monascus-fermented solid medium and purified/fractionated by Six by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). A solvent system with weak polarity involving four components nhexane, ethyl acetate, methanol and water was selected and used for HSCCC. Based on a comparative analysis of partition coefficients of target compounds in different solvent systems, a two-step HSCCC routine was developed. After separation by HSCCC and crystallization with acetone, six azaphilone-type pigments with high purity were obtained. The purity of each pigment was above 98.5% and their yields were between 81.40% and 84.78%. Their molar absorption coefficients were 13313, 13877, 9380, 9360, 25621 L/(mol·cm) and 25849 L/(mol·cm), separately. Key words：Monascus pigments；high-speed counter-current chromatography；separation and purification 中图分类号：TS202；Q819 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)20-0192-04红曲霉菌发酵产品的生产与应用在我国已有一千多 年历史，主要用于食品着色、酿酒和传统中药材。
高速逆流色谱
1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黄酮） 1.7 苹果 Malus pumila 原矢车菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin
B。 1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖) 1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。 1.10 红豆杉粗提物 10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），紫杉醇
流速范围:0.1-30ml/min 分离流速：2.0-4.0ml/min； 压力:0-2MPa
紫外检测器波长：使用汞灯 - 滤光片选择 254 、 280nm ( 标配 )
多种滤光片可选： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 选购 )
温控模块（接循环水浴）：温度调控范围 15 ～ 40 ℃，精度 0.5 ℃ ，
轻的为上相，重的为下相），一相为固定相，另一相 为流动相。 b) 被分离物质的分配系数（K）范围在0.5-2。K=Cu/CL， Cu是上相中溶质浓度，CL是下相中溶质浓度。K＜＜ 0.5 会导致峰分离度的下降，而K＞＞2，会使保留时 间太长，样品峰过宽。
表 1 中列举了常用的溶剂系统。查找溶剂系统可以从左边
步骤2:溶剂系统的优化
区域
化合物极性
A
强极性
B
中极性
C
非极性
溶剂系统 正己烷/正丁醇/甲醇/水 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水
正己烷/乙腈
步骤3:溶剂比例的优化
一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果
高速逆流色谱法分离纯化长春花中长春新碱
采 用 高速 逆流 色谱 仪 ， 氯仿一 醇一． ｏ ・ ＨＣ（ ３： ） 甲 ０ ３ｍ ｌ Ｌ １ ４： ２溶剂 体 系， 上相 为 固定相 ， 相 为流 动 相 ， 下 流动 相 流 速 为 ２０ｍ ． Ｌ・ ｎ ， ｍｉ ～ 紫 外检 测 波 长 为 ２ ０ｎ 主机 转速 为 ８ ０ｒ ８ ｍ， ０ ・ｍｉ＿ ， 温循 环 温 度 为 ２ ｎ 。恒 ８℃ 。 结果 业 生产 高 纯 度 产 品 。 关键词 ： 高速 逆 流 色谱 ； 春 花 ； 长 长春 新碱
ｓ ｅ ｄｃ ｕ ｔ ｒ ｕ ｒｎ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｓｕ ｅ ｉ ｈｏ ｏ ｏ ｍ ｍｅｈ ｎ ｌ ． ｏ ． ＨＣ ４：３： ）ａ ｈ ｏｖ ｎ ｙ ｔｍ． ｐ ｅ ｏ ｎ ｅ－ ｒｅ ｔ ｒ ｍａｏ ｒｐ ｙｗａ ｓ ｄ ｗ ｔ ｃ ｌｒ ｆｒ — ｔａ ｏ－ ３ ｍ １ Ｌ ｃ ｃ ｈ ０ ｌ（ ２ ｓｔ ｅｓ ｌｅ ｔ ｓｅ ｓ
西 北 药 学杂 志
２１ ０ １年 １ 第 ２ ２月 ６卷
第 ６ 期
３５ ９
高速 逆 流 色 谱 法分 离 纯化 长 春 花 中长春 新 碱
韩 艳 ， 张 琰 ， 新友 ， 刘 覃 华 ， 小燕（ 杜 第四军医大学唐都医院药剂科， 陕西 西安 ７０ ３） １０８
应用高速逆流色谱分离中药中有效成分及质谱结构研究
应用高速逆流色谱分离中药中有效成分及质谱结构研究I. 研究背景在中医药学的发展过程中，中药已经成为了人们日常生活中不可或缺的一部分。
随着科技的进步，人们对中药的研究也越来越深入，尤其是对中药中有效成分的提取和分离技术。
高速逆流色谱(HSLC)作为一种高效的分离技术，已经在中药研究领域得到了广泛应用。
本研究旨在通过HSLC技术分离中药中的有效成分，并利用质谱技术对其进行结构解析，以期为中药的现代化研究和开发提供理论依据和技术支撑。
在过去的几十年里，我国中医药事业取得了世界公认的辉煌成果。
然而随着现代医学的发展，中医药面临着前所未有的挑战。
为了更好地传承和发扬中医药文化，我们需要不断地对中药进行创新研究，提高其药效和安全性。
高速逆流色谱作为一种新兴的分离技术，具有操作简便、分离效率高、适用范围广等优点，为中药的有效成分提取和分离提供了有力保障。
质谱技术作为现代分析科学的重要手段，已经在生物医药领域取得了显著的应用成果。
通过对中药中有效成分的结构解析，我们可以更深入地了解其药理作用机制，为新药的研发提供理论依据。
此外质谱技术还可以用于中药的质量控制和评价，确保药品的安全性和有效性。
中药中有效成分的研究意义及现状在我们的日常生活中，中药已经成为了许多人的日常调理和疾病治疗的重要手段。
而其中最让人着迷的，莫过于中药中那些神奇的有效成分。
这些成分不仅能够治病救人，还能够为我们的生活带来诸多健康益处。
因此研究中药中有效成分的意义不言而喻。
然而尽管中药有着悠久的历史和丰富的经验，但在现代科学技术的发展下，我们对中药中有效成分的认识仍然有限。
这主要是因为中药中的有效成分种类繁多，分离提取难度较大，而且很多成分的结构性质尚不清楚。
因此如何高效、准确地从中药中提取出这些有效成分，成为了一个亟待解决的问题。
近年来随着高速逆流色谱等现代分离技术的不断发展，我们对中药中有效成分的研究取得了一定的进展。
通过对大量中药样品的分析，我们已经发现了许多具有潜在药用价值的化合物。
高速逆流色谱法
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分物碱的分离
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
二、分离原理
连续液液萃取过程,固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢,一般需要两天或更长时间.
➢ 流体动力学平衡系统
4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术,不 宜进行复杂混合物的全分析.
5. 适合用于分离纯化,预处理条件宽松,回收率高,制备量大.
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验,实验结果决定流速和洗脱 方式
分离：溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续 地予以完成.各个组分也就会按其在两相中的分配系数分 离开来.
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体,完全排除了载体对样品组分的吸附、 玷染、变性、失活等不良影响,能避免不可逆吸附造成的色谱峰拖 尾现象,实现高回收. 2．分离柱容积可大, 没有填料,柱内空间均为有效空间.因此,样品 负载量较大,制备量可从毫克到克量级. 3． 逆流色谱不用填料,分离过程不是淋洗或洗脱过程,而是对流穿 透过程.溶剂用量少,成本低.
三、仪器结构
高速逆流色谱的仪器流程
柱：长的软管如聚四氟乙烯管绕制成
载体：无
固定相：液体.用某一种有机／水两相溶剂体系或双水和 溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相,用离心力 场来支撑住柱内的液态相.
高速逆流色谱法
两相溶剂的流体动力学分布
混合区：靠近中 心轴的将近 1/4 的区域，在此处 两相发生剧烈的 混合。 静置区：两相分离 成两层，重相占据 螺旋管的每一段的 外部，轻相占据每 一段的内部，并且 两相沿螺旋管形成 一个清晰的线性界 面。
HSCCC工作流程
技术特点
不用固体支撑体，避免了物质的不可逆吸附、失活和 变性等； 滞留柱中的样品可通过多种洗脱方式予以完全回收 有广泛的两相溶剂体系可供选择，大大增加其适用范 围； 粗样可以直接上样而不会对柱子造成任何损害； 操作成本低，制备量大； 操作灵活，固定相和流动相之间可以互换作用； 心力，使两种互 不相溶的溶剂在高速旋转的螺旋管中单向分布， 其中一项作固定相。
载有样品的流动相由恒流泵输送穿过固定相，利 用样品在两相中分配系数的不同实现分离。
分离基础
由于螺旋管柱的行星式运动产生了一个在强
度和方向上变化的离心力场，使在螺旋柱中
互不相溶的两相不断混合从而达到稳定的流 体动力学平衡。
HSCCC的应用
1.天然产物已知有效成分的分离纯化 2.化学合成物质的分离纯化 3.中药一类、五类新药的开发 4.中药指纹图谱和质量控制研究 5.抗生素的分离纯化 6.天然产物未知有效成分的分离纯化（新化合 物开发） 7.海洋生物活性成分的分离纯化 8.放射性同位素分离 9.多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手性分 离等
高速逆流色谱法
High-speed Countercurrent Chromatography
HSCCC分离原理
HSCCC是一种无需任何固态载体支撑的连续
高效的液—液分配色谱分离技术，结合了液 液萃取和分配色谱的优点。
在高速逆流色谱仪中，有两个轴，一个为公
高速逆流色谱仪
高速逆流色谱仪原理高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography ，HSCCC ）是20 世纪80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。
它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。
目前HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。
我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。
美国FDA 及世界卫生组织（WHO ）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90 年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
1.逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化，溶剂耗量大，分离时间长。
2.20世纪70年代，出现了液滴逆流色谱（DCCC）特点：（1）流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES）（2）分离时间过长、连接处容易出现渗漏等3.20世纪70年代出现了离心分配色谱仪（Centrifugal partition chromatography，CPC）特点：（1）基于流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES），利用公转产生的单一力场（2）连接处较多而且容易出现渗漏，清洗维护复杂4．20世纪80年开始出现了现在的高速逆流色谱，可称为最先进的逆流色谱特点：（1）基于流体动力学原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）（2）通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相程5.HSCCC分离流程图举例1．高速逆流色谱分离黄柏中的小檗碱和巴马亭1实验部分1. 1仪器与试剂HSCCC2TBE300 型高速逆流色谱仪, 深圳同田生化有限公司;HD2212C2B 核酸蛋白检测仪, 上海康华生化仪器厂;R2201 旋转蒸发器, 上海申胜生物技术有限公司;LC210A T 高效液相色谱仪, 日本岛津色谱仪器公司;氯仿、甲醇、正丁醇、乙酸均为国产分析纯, 水为重蒸水, 黄柏购于杭州胡庆余堂, 为川黄柏。
高速逆流色谱分离技术
生药
HPLC法测定分配系数
AUi 2 VL AUi 2 VL Ki Ki A A V Ui 1 Ui 2 U A A V
Ui1 Ui 2 U
生药
溶剂系统选择的基本步骤
(1)首先预测要分离物质的极性, 溶解性特点，粗 选几个溶剂体系。 (2)建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 （3）利用HPLC测定K，并计算容量因子a，2>K>0.5, a>2，能够获得理想的分离。 （4）制备性分离。
利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定
相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递
其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管 绕成的螺旋管中 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系 数的不同依次洗脱而获得分离
特殊的流体动力学
生药
固定相的保留
缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
生药
3.高速逆流色谱的原理
利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不 相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒 流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按 分配系数的次序，被依次洗脱。
生药
液－液分配色谱
利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES） 从而实现流动相高速移动时固定相的保留
生药
混合区：在靠近离心轴
心大约有四分之一的区 域，两相的激烈混合
静置区：两相溶剂分成
两层，重相在外部，轻 相在内部来自以1000转/分的速率进行旋 转，在二维力场的作用下 分离管柱内混合和传递的 频率可达到17次/S，从而 实现高效的分离
高速逆流色谱
2 溶剂体系选择的步骤
预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系； （1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系； 取少量样品于上下相各 毫升的溶剂体系中 的溶剂体系中， （2）取少量样品于上下相各2毫升的溶剂体系中，用 TLC进行检验，可加入甲醇 乙醇、醋酸乙酯等来调节 甲醇、 TLC进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节 进行检验 溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K为 溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K 0.5~2为止； 为止； 为止 HPLC测定 测定K （3）用HPLC测定K值； 分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速逆 HSCCC进行预分离 （4）用分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速逆 流色谱进行分离。 流色谱进行分离。 进行分离
中等极性溶剂体系
强极性溶剂体系
两相由正己烷和水组成 可用甲醇 乙醇、 组成， 甲醇、 两相由正己烷和水组成，可用甲醇、乙醇、醋酸 等来调节溶剂系统的极性。 乙酯等来调节溶剂系统的极性 乙酯等来调节溶剂系统的极性。 典型的溶剂体系有 典型的溶剂体系有： 正己烷-醋酸乙酯-乙醇正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水 正己烷-醋酸乙酯-甲醇正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水
强极性溶剂体系的两相基本物质是正丁醇和水， 强极性溶剂体系的两相基本物质是正丁醇和水，可以 两相基本物质是正丁醇和水 加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的 加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂来调节溶剂系统的 甲醇 极性，也可以在氯仿水体系中调节pH值来增大极性, 极性，也可以在氯仿水体系中调节pH值来增大极性,或 pH 适量的酸和碱. 在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱 在异丁基甲醚水体系中加入适量的酸和碱.适合于极性 很强的生物碱类化合物的分离。 很强的生物碱类化合物的分离。 典型的溶剂体系: 典型的溶剂体系: 氯仿-甲醇氯仿-甲醇-HCl 异丁基甲醚有机相加三乙胺，水相加盐酸） 异丁基甲醚-水（有机相加三乙胺，水相加盐酸）
逆流色谱技术
消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失， 在实验中只要调整好分离条件，一般都有离效果的因素
1. 固定相的保留值
在逆流色谱中，留在管中固定相的量是影响溶质峰分离度的 一个重要因素，高保留量将会大大改进峰分离度。（仪器 因素和溶剂系统因素）
二、两相溶剂的选择
经典溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己 烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和 正丁醇-甲醇-水等
二、两相溶剂的选择
乙酸乙酯:水（1：1）
大部分目标化合物集中在上相
乙酸乙酯:乙醇:水
化合物的分配比得到了改善，但 是化合物的分离时间又过长
正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:5:5:5) 正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:5:7) 正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水(5:3:6:6)
日本学者Ito等首先在日本，随后在美国的国家 医学科学研究院发现了一种有趣的现象：不互 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小口径管子里能 在重力场的作用下实现物质在两相溶剂间的连 续分配。而当螺旋管柱在一离心力场内转动时， 随着转速的增加，两相溶剂的混合程度，分配 效率，管柱的利用率及物质在固定相的保留值 也随之增加。如果把待分离样品从管子的入口 引入，连续分配传递过程就会在管柱里进行， 从而实现连续的液一液分配分离，并由此设计 制造了多种逆流色谱仪。
液滴逆流色谱仪
DCCC仪器的工作原理示意 a. 上行方式；b. 下行方式 1．储液器；2泵；3．样品室；4分离管柱；5．收集器
离心式DCCC的工作原理示意图
旋转腔室逆流色谱仪示意图
回旋腔室逆流色谱示意图
－
环绕螺旋管离心分离仪
同步螺旋管行星式逆流色谱
高速逆流色谱
高速逆流色谱(HSCCC)是一种液 -液色谱分离技术，它的固定相 和流动相都是液体，没有不可 逆吸附，具有样品无损失、无 污染、高效、快速和大制备量 分离等优点。由于HSCCC与传统 的分离纯化方法相比具有明显 的优点，因此己被广泛应用于 中药成分分离、保健食品、天 然产物化学、有机合成、环境 分析等领域。
高速逆流色谱分离环氧化合物开环反应产物
2012年第29期(总第44期)科技视界Science &Technology VisionSCIENCE &TECHNOLOGY VISION 科技视界环氧化合物是有机合成中一个很有用的结构单元,也是一种比较活泼的化合物,在多种试剂及物理因素作用下都可以进行开环反应,它是合成二醇、卤代醇、氨基醇、及其它醇的衍生物的重要中间体,常用的亲核试剂主要是胺,醇,硫醇以及卤素等[1-2]。
环氧化合物与胺的发生的开环反应,产物为β氨基醇是合成天然化学品和药物的重要中间体在有机合成中具有广阔的应用前景。
但在开环反应过程中,因亲核反应位点的不同而区域选择性地产生不同的异构体产物,如果图1.化合物1为空间有利的产物,但也会有部分2作为副产物产生,化合物1和2为异构体,采用一般的分离手段较难分离[3]。
图1环氧化合物和胺的反应高速逆流色谱(high speed countercurrent chromatography,简称HSCCC)是一种基于液液分配为基础的新型分离技术,可以在短时间内实现高效分离和制备,可以达到几千个理论塔板数[4]它的突出特点是在用很长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成的色谱柱内不加入任何固态支撑体或填料。
HSCCC 利用的是螺旋管的方向性与高速行星式运动相结合产生的一种独特的流体动力学现象,使两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。
使用时根据被分离混合物的理化特征,选择某一种有机/有机两相溶剂体系或有机/水溶剂体系,此体系可以是二元的或多元的。
用此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相,首先将其注满管柱内,然后让此管柱作特定的旋转运动,用由此形成的离心力场来支撑住柱内的液态相。
这时,若用溶剂体系中的另一层作为流动相,带着混合物样品由泵的压力推入分离管柱,样品就会穿过两个液相对流的整个管柱空间,各个组分也就会按其在两相中的分配系数分离开来。
由于HSCCC 不需固相载体作固定相,克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点,另外,逆流色谱不需填料,它的分离柱容易做的大一些,柱内空间全部是有效空间,因而样品的负载能力强,制备量较大。
高速逆流色谱法在中药有效成分分离中的应用研究
高速逆流色谱法在中药有效成分分离中的应用研究【摘要】高速逆流色谱是近几年发展起来的新型色谱技术，由于其独特之处已被广泛应用于各个领域，本文就人们关心的热点中药有效成分的分离，采用新的色谱技术高速逆流色谱技术分离取得的成就进行总结，并展望未来的前景。
【关键词】高速逆流色谱法；中药有效成分；分离；应用中图分类号r283 文献标识码 b 文章编号1674-6805（2012）35-0156-01近年来，随着中国经济的高速发展，中草药已经越来越受到人们的关注。
而中药的有效成分复杂，如何获得高效的有效成分，分离效果成为研究的热点。
高速逆流色谱法（high-speed countercurrent chromatography，hsccc）具有分析能量大、分离效率高、结果重现性好等其他色谱无法替代的优点。
现高速逆流色谱技术这种新型的液-液分配色谱已广泛应用于医药、农林、化工等各领域[1]。
应用新型的高速逆流色谱分离成分复杂的中药有效成分可取得良好的效果，具体总结如下。
1 工作原理高速逆流色谱hsccc是应用不同物质在固液两相中的分配系数不同进行分离。
一台高速逆流色谱仪是由输液泵、分离柱、检测器、工作站、数据采集系统及馏分收集器等组成。
首先选择固定相，是将两相预先平衡好的溶剂中的一相填充满螺旋管柱，将流动相以一定的流速泵入高速旋转的螺旋管柱内。
在有液体流动相流出时，说明体系达到平衡，此时将样品注入高速逆流色谱体系中，螺旋管分离柱将依据不同成分在固液两相中的分配系数不同达到分离，依据工作站和数据采集系统将分离后的结果进行记录并积分处理。
在仪器运行的时候，可调节溶剂、固定相、流动相、样品浓度、柱温、洗脱方式、进样方式、流动相的流速及转速等使分离效果达到最好。
还需要根据所检测样品的特点，选择不同的检测器，uv-vis（紫外-可见光检测器）、elsd（蒸发光散射检测器）或者质谱检测器等[2]。
2 中药的有效成分各种植物中所含的有效成分分类为生物碱、黄酮、苷、萜、蒽醌、木脂素、香豆素、有机酸等。
高速逆流色谱技术名词解释
高速逆流色谱技术名词解释
高速逆流色谱法（High Performance Reversed Phase，HPLC）是用于分离高分子物质的一种有效的分析技术。
其原理是利用两相溶液的相分离效应，将分子大小和组成的不同物质分离出来，以提高分析的灵敏度和准确度。
HPLC是一种高精密和快速的技术，在多学科领域有着广泛的应用，比如说化学、分析化学、药理、免疫学和生物学等。
高速逆流色谱法的关键是精确控制好柱温，使用色谱液和流速。
色谱液中含有目标分离物质，可以用弱酸或碱性溶液，以及选择性的表面活性剂进行改性，以形成两种不同的溶剂，用不同的流速进行分离。
扩散和摩擦力作用会导致分离物质在柱内停留不同时间，以达到分离目的。
使用高速逆流色谱分离物质时，必须使用高品质的过滤器和检测仪，以确保色谱柱中的溶液质量，并获得准确的分离结果。
这种技术不仅能用于分离物质，而且还能
快速检测滤失和含量，甚至可以检测目标物的性质。
HPLC在药物的研制和测试方面也有着重要的作用。
它能够准确地检测出药物制剂中不同原料之间的比例，从而保证制剂质量，同时也能快速测定药物的组分和结构含量等。
另外，高速逆流色谱法还可用于药物的发掘，通过检测不同地质环境中各类有用的生物活性物质，可以大大提高寻找新药的效率。
可以看出，高速逆流色谱法影响着一系列领域的分析方法，它可以提高分析的准确性，简化试验过程，还可以避免出现许多不必要的错误。
虽然HPLC有着一系列优良的性能，但是在使用时，仍然应该采用谨慎，确保滤失和污染等方面的控制，为科研和实验提供准确可靠的数据。
高速逆流色谱法
高速逆流色谱法分离小花黄堇中延胡索乙素和原阿片碱1植物来源：样品小花黄堇采收自福建省永春县, 经福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定为罂粟科小花黄堇Corydalisracemosa( Thunb1) Pers1的全草。
2化合物分子结构图及化合物用途：小花黄堇为罂粟科紫堇属植物小花黄堇Corydalis race-mosa(Thunb1) Pers1的全草或根。
味苦, 性寒, 有毒。
具有清热利尿,解毒杀虫之功效。
主治湿热泄泻, 痢疾,黄疸, 目赤肿痛, 亭耳流脓, 疮毒, 疥癣,毒蛇咬伤。
3提取前处理方法：总生物碱的提取取小花黄堇药材1kg,用95%的乙醇( 含011%HCl)回流提取3次, 次115h, 合并提取液,过滤,回收乙醇, 至无醇味。
加入5%的HCl 溶液, 调节pH值至2左右, 置12h, 过滤,弃去沉淀;再往滤液中加入NaOH, 调节pH值至12左右, 静置12h, 过滤, 取沉淀,干燥, 即得总生物碱粉末。
4具体提取过程：将正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水按照体积比8:8:12:8振摇充分混合,静置平衡后分得上相(固定相)和下相( 流动相), 分别超声脱气15min, 备用。
称取小花黄堇总生物碱粉25mg,加人溶剂系统的上、下相各10mL, 振摇使之溶解,作为样品溶液。
上相以流速为10mL/min-1进入HSCCC螺旋管, 待螺旋管完全充满固定相后, 开启HSCCC主机, 转方向为顺时针,使转速逐渐增加到800r/min-1, 同时以210mL/min-1的流速抽入下相( 流动相) 。
当流动相从螺旋管尾端流出时, 系统即达到动力学平衡, 基线平稳后即可进样。
紫外检测器检测波长设为280nm, 根据色谱图收集各流分。
按HSCCC图谱( 3) 上的各成分峰收集流分, 得到5个组分, 分别用HPLC法测其纯度。
5个组分通过HPL检测, 结果表明,组分1、2、3均为未知成分的混合物, 组分4和5为目标成分,以面积归一化法计算其纯度分别为9916%和9912%。
高速逆流色谱
高速逆流色谱属于逆流色谱的范畴，逆流色谱是一种新型的分离手段，它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的，值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体，其主要优点是没有传统色谱的死吸附，样品的回收率高等特点。
逆流色谱源于逆流分溶法，也就是用实验室经常使用的分液漏斗进行连续的液液萃取，根据样品在两种互不相溶的溶剂中分配比不同而进行分离。
逆流色谱早期发展的方法有液滴逆流色谱，旋转小室逆流色谱等。
但是作为一种分离手段，早期发展的逆流色谱不能满足高效快速的分离，分离的周期很长，效率很低。
在70年代，Ito 博士成功开发了一种能够高效快速分离的逆流色谱－高速逆流色谱。
但高速逆流色谱也有很多种设计，经过几十年的发展，现在的高速逆流色谱一般是采用同步行星式的设计，其主要是利用在高速旋转状态产生的二维离心力场的作用下使两种互不相溶的溶剂快速有效的对流或分割----或者说混合或分层，从而使样品能够在短时间内进行成千上万次萃取，根据样品中的物质分配系数的不同而进行分离的一种方法。
HSCCC 有几个突出优点：（1）无不可逆吸附。
聚四氟乙烯管中的固定相无需载体液-液色谱系统，故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；（2）高回收率。
由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同步完成，故特别适于制备性分离；（3 ）操作简便。
因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。
与HPLC 相比，HSCCC 进样量较大，最多可达数克，是HPLC 的数百倍；与常压、低压色谱相比，HSCCC 的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。
高速逆流色谱作为一种比较新颖的分离方法，影响因素主要有溶剂体系的选择，旋转速度，流动相的流速，温度等影响。
溶剂体系选择即条件的摸索，相当于传统色谱摸流动相的条件，不同的是高速逆流色谱条件的摸索主要是指样品在固定相和流动相两者之间的分配的比值，待分离的样品的K值最好在0.6-1.5范围之内，这样才会有一个好分离效果。
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High Speed Countercurrent Chromatography
HSCCC
一、概述
Ito，70年代提出，80年代提出CCC，一种液液 色谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
参考书
1.《逆流色谱技术》张天佑，北京科学技术出版社， 1991年 2.《高速逆流色谱分离技术与应用》曹学丽，化学工 业出版社，2009年
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度
样品在系统中有合适的分配系数
固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验，实验结果决定流速和洗 脱方式 样品要溶解于流动相或固定相之中
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析
氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分析 蛋白质、细胞至微生物的分离等
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体，完全排除了载体对样品组分的吸 附、玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附造成的色 谱峰拖尾现象，实现高回收。 2．分离柱容积可大， 没有填料，柱内空间均为有效空间。因此， 样品负载量较大，制备量可从毫克到克量级。 3． 逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对 流穿透过程。溶剂用量少，成本低。 4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术， 不宜进行复杂混合物的全分析。 5. 适合用于分离纯化，预处理条件宽松，回收率高，制备量大。
黄连生物碱的分离
二、分离原理
连续液液萃取过程，固定相和流动相均为液体
问题是：如何在流动相流动时使固定相不动？ 两种基本模式 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢，一般需要两天或更长时间。
流体动力学平衡系统
三、仪器结构
高速逆流色谱的仪器流程
柱：长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成
载体：无 固定相：液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水 和溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离 心力场来支撑住柱内的液态相。 流动相：若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混 合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液 相完成。各个组分也就会按其在两相中的分配系数 分离开来。