3-高速逆流色谱技术原理及应用领域
高速逆流色谱技术
l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。
大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。
30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。
HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。
● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。
● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。
● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。
● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。
新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。
与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。
● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。
高速逆流色谱的原理及活性成份提取的进展
雷公藤 春碱
．
陈皮 ］
石油醚一 乙酸 乙酯一 甲醇一 （体积 比为 ２４： ： ： 水 ： ３３）
正 已烷一 乙酸 乙酯一 甲醇一 （体积 比 ３ ５ ３ ５ 水 ： ： ：） 石油醚一 乙酸 乙酯一 甲醇一 （ 水 体积 比 ２ ：５ ２ ：７ ２ ２ ：３ １ ）
陈皮苷 、 桔皮素
⑤ 抗 生素的分离纯化 ；
图 １ 多级 萃 取 技 术
⑥ 天然产物未知有效成分 的分离纯化（ 新化合物 开发） ；
⑦ 海洋生物活性成分 的分离 纯化 ；
⑧ 放射性 同位素分离 ；
⑨ 多肽和蛋 白质等生物 大分 子分离以及手性分离等 。 我 国是继美 国、 日本之后最早开 展逆流色 谱应用 的 国家 ，
３ （ － ｙ ｒ ｘ －ｎ ｙ ）５ ７ｄｈ ｄ ｏ ｙ ６ｍｅｈ － ４ｈ ｄ ｏ ｙｅ ｚ １ － ， － ｉｙ ｒ ｘ － 一 ｔ —
叶黄素 异戊烯基黄酮
黄 酮 茄 尼 醇 １羟 基 一一 一 ２ 甲基 一 蓖 蒽 二 苯 乙 烯 苷 菊 苣 酸
大 麻 ］ 乌 药 叶 ］
关键词 ： 高速逆流色谱 ； 应用 ； 研究进展
ｄ ｉ１ ．９ ９ Ｊ ｉ ｎ ０ ４４ ３ ． ０ １０ ．３ ｏ：０ ３ ６ ／ ．ｓ ．１ ０－３ ７ ２ １ ．６ ０ ２ ｓ
逆流色 谱 （ ｏ ｎｅｃ ｒｅｔ ｈｏ ｔｇ ａｈ ， Ｃ ） 合 了 Ｃ ｕ ｔｒｕｒｎ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ Ｃ Ｃ 结 Ｃ
赵 芳
（ 石河 子大 学化 学化 工学 院
新疆 石 河子 ８ ２０ ） ３００
要 ： 综 述 Ｈ Ｃ Ｃ的原理及从天然产物中提取活性成份 的应用及 进展 ： ＳＣ 高速逆 流色谱 （ ｉ －ｐｅ ｏ ｎｅ ｕｒ ｔ ｈｏ ａ ｈ ｈｓ ｅ ｃ ｕ ｔ ｃ ｒ ｎ ｒｍ — ｇ ｄ ｒ ｅ ｃ
高速逆流色谱_HSCCC_在食品色素制备中的应用
tein) 、紫黄素 (V iolaxanthin) 、新黄素 (Neoxanthin) 、 β - 胡 萝卜 素 、玉米黄 素 、番茄 红素 和 辣 椒 红 素 等 [ 2 ] 。Vesper, H. , N itz, S. ( 1997 年 ) [ 3 ] 利 用 HPLC法配合个人数字监测仪 ( PDA detection) 对 红辣椒 ( Cap sicum annuum L. )中类胡萝卜素成分 进行分析和半定量测定 。根据它们的紫外可见光 光谱 , 检 测 成 分 可 分 为 玉 米 黄 素 类 ( zeaxanthin Ο like)和辣椒红类 ( cap santhinΟlike) 。基于色谱分析 结果 , 它们 可分 成未酯 化 ( unesterified ) 、单 酯 化 (monoesterified)和双酯化类胡萝卜素 ( diesterified carotenoids) 。运用 HSCCC 和不同柱色谱 ,从同一 红辣椒提取物中分离出 8种最主要的类胡萝卜素 。 用质谱 (mass spectrometry,M S)鉴定酯化的类胡萝 卜素 。DC I - M S 是最适合的分析技术 。经鉴定 , 类胡萝卜素酯 ( carotenoid esters) 为 , 被肉豆蔻酸 (myristic acid) 、月桂酸 ( lauric acid)和棕榈酸 ( pal2 m itic acid)酯化了的辣椒红 。
200mg样品洗脱出 3 个峰 ,分别为茶黄素 ( theafla2 分泌物称为紫胶 ,含有蒽醌类( theaflavin - 3) 、3, - 没食子酸盐 ( laccaic acid ) 。 H isao Oka . Yoichiro Ito ( 2000
84
Degenhardt, A. , Knapp , H. 等 ( 2000年 ) 建 [ 7 ] 立了从红葡萄酒中快速制备锦葵色素的方法 :红葡 萄酒先经 Amberlite离子交换树脂 (XAD - 7)柱的 清洗 ,以 TBM E - 正丁醇 - 乙腈 - 水 ( 2 ∶2 ∶1 ∶5,用 0. 1% TFA 进 行 酸 化 ) 作 为 流 动 相 , 再 经 HSC2 CC1000型 (美国马里兰州 PTR 公司产 )进行分离 锦葵色素 (malvidin 3 - glucoside) 。用 1998年产西 式窖藏加州红葡萄酒 (W estern Cellars Californian red w ine ) 和 1997 年 产 德 国 红 葡 萄 酒 ( Hex vom Dasenstein Spaetburgunder)进行试验 。 1 瓶葡萄酒 可分离提纯 65 mg锦葵色素 (malvidin 3 - gluco2 side) 。经 HPLC - DAD , ESI - M S /M S和 1H NMR 检测 ,该提取物足以作为参考样品 ( reference com2 pound) 。该方法为从葡萄酒和葡萄皮中 ,提取锦葵 色素提供了良好的借鉴 。
高速逆流色谱技术原理及应用领域
• 20世纪70年代，逆流色谱(CCC)。首先 出现液滴逆流色谱(DCCC)
溶剂 泵
进样器
进样器
溶剂 约300根管柱 上行法 收集器
泵 收集器 约300根管柱 下行法
优点：DCCC仪器轻巧简便，能避免乳化或泡沫的产生。 缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．
分离管内侧 ——————————————————————————————————————— ………………………………ooooo……ooooo②……oooo……………………………………… ………………………………………ooo…………oooo………………③……………………… ………………………………oooo①oo……ooooooo……oooo…①…………………………… ①②③④ ooooooooooooooooooooooooo……③……oooo…………ooooooooooooooooooooooooooooooo ooooooooooooooooooooooooo…oo……ooo④oo……ooo…ooooooooooooo④oooooooooooooo oooooooooooooooooooooooooo………oooo……oooo………oooooooooooooooooo②ooooooooo ——————————————————————————————————————— 分离管外侧 ①③组分，由于在轻相中的分配系数过大不易被流动相洗脱下来 ②④组分，根据在重相的分配系数大小按顺序洗脱出来分离区 ………………――――轻相 oooooooooooo――――重相 ①②③④——样品（4组分）
作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型 专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者， 我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司 （ GE Healthcare Bio-sciences co.,ltd . ） 建立 了长期的合作伙伴关系 .
高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱的仪器设备
高速逆流色谱系统由高压泵、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等组 成，其中色谱柱是核心部件。
高速逆流色谱的应用领域
高速逆流色谱在药物分析、天然产物研究、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用。
高速逆流色谱与传统色谱快、样品损失少等优点，适用于复杂样品的分析。
高速逆流色谱的优势和局限性
高速逆流色谱具有高灵敏度、高分辨率和多样性等优势，但对样品前处理要求严格，并且柱寿命较短。
总结与展望
高速逆流色谱作为一项重要的分析技术，将继续发展并在更多领域中发挥重要作用，为科学研究和工业应用提 供支持。
高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱（HPLC）是一种高效、准确的分析技术，广泛应用于生物医药、 食品安全和环境监测等领域。
高速逆流色谱的介绍
高速逆流色谱是一种液相色谱技术，利用高压泵将样品溶液通过色谱柱，以不同的化学性质分离样品中的化合 物。
高速逆流色谱的原理
高速逆流色谱基于溶质的分配与吸附过程，通过调节移动相和静态相的性质，实现对样品中化合物的分离和分 析。
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用-PPT
作者 王凤美
原料 丹参水溶性成分 丹酚酸类物质
溶剂体系 正己烷-醋酸乙酯-水-甲苯 (1.5:5:5:1.5)
分离物质 丹酚酸 B
Tian G L 山茱萸
乙酸乙酯-正丁醇-水(5:1.8:6) 乙酸乙酯-乙醇-水(5:0.5:6)
没食子酸
黄健光
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(7:3:6:4) 邻苯二酚和对苯二酚
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
原料 吴茱萸 黄花乌头 附子 金果榄
绿茶
溶剂体系 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5∶5∶7∶5) 正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.2mol/L HCl (1∶3.5∶2∶4.5) 氯仿-甲醇-0.3mol/L 盐酸 (4:3:2) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸 (2:1:1) 氯仿-甲醇-0.2mol/L 盐酸
Liu R M 秦皮
正丁醇-甲醇-0.5%乙酸(5:1.5:5)
秦皮素、七叶甙、秦 皮甙和七叶素
3、7 其她类化合物得分离提取
作者 佘佳红
原料 银杏叶
溶剂体系 氯仿-甲醇-水(4:3:2)
分离物质 白果内酯
Du Q Z
穿心莲
正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1:4:2.5:2.5)
穿心莲内酯和新穿心 莲内酯
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
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a、仪器对保留值得影响(外因)
高速逆流色谱仪原理特点及应用
高速逆流色谱仪原理特点及应用一、简介高速逆流色谱（HPLC）是一种高效、精准的分析技术，它广泛应用于化学、制药、环保、食品等领域。
高速逆流色谱仪是高速逆流色谱技术的核心设备，能够对各种化合物进行分离和检测。
在本文中，我们将介绍高速逆流色谱仪的原理、特点及应用。
二、原理高速逆流色谱仪使用液相色谱技术，其基本原理是将待测样品溶液经过一定的处理后，注入色谱柱，通过色谱柱内液相的物理化学作用，将各种组分分离出来，并用检测器检测分离出来的化合物。
高速逆流色谱仪相较于其他色谱仪的优势在于可以在极短的时间内完成大量的分离、检测等操作。
高速逆流色谱仪的原理是基于其内部的色谱柱，其内部结构可以细分为装载柱、色谱柱和联接管。
样品通过色谱柱时，每种组分将被一步一步地分离出来，直到达到检测器，最后数据将被转换为电子信号，并通过数据处理软件进行分析和处理。
三、特点1. 高效HPLC技术的一大优势在于其高效性，使用HPLC技术可以在更短的时间内分离出更多的物质成分，从而提高分析效率。
2. 精准由于高速逆流色谱仪的高分辨率和灵敏度，其能够分离出复杂物质的成分，从而提供更加准确的结论。
3. 多种检测方式高速逆流色谱仪可使用不同类型的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，可以检测多种类型的化合物成分。
4. 适用范围广高速逆流色谱仪不仅适用于小分子化合物的分离和检测，也可以用于生物大分子、天然产物、有机和无机化合物等物质的分离和检测。
四、应用高速逆流色谱仪广泛应用于化学、生命科学、环境科学、食品科学等领域，其准确性和高效性为这些领域的研究和实践提供了重要的技术支持。
1. 化学在化学领域中，高速逆流色谱仪通常在合成新药物、分离小分子化合物、分析毒物、研究反应机理等方面有着广泛的应用。
2. 生命科学高速逆流色谱仪在生命科学领域可以用于分析蛋白质、氨基酸、核酸和多糖等生物大分子，可以检测蛋白质含量和组成，研究生物大分子的三维结构，为分子生物学、细胞生物学和基因工程研究提供技术支持。
高速逆流色谱
400
流速: 2.0 ml 转速：800 rpm 样品量：150 mg 粗提物 机型：TBE-300A 固定相保留： 60% Ⅰ：花椒毒素 95.0％ 7.6 mg Ⅱ: 异茴芹素 99.6％ 7.6 mg Ⅲ: 佛手苷内酯 99.7％ 9.7 mg Ⅳ: 欧前胡素 100％ 60.5 mg Ⅴ: 蛇床子素 100％ 50.6 mg Ⅵ:未知化合物 98.1％ 10.2 mg min-1
实例3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离
溶剂系统: 正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水 (5:6:6:6) 流动相：下相 流速: 1.0-2.0 ml min-1 转速：850 rpm 样品量：400 mg 粗提物 固定相保留： 65% 分离温度: 25°C 机型：TBE-300A Ⅰ: orotinin （牡荆苷）99.2％ 38.2 mg Ⅱ: orotinin-5-methyl ether 98.5％ 19.8 mg Ⅲ: licoagroachalcone B 97.6％ 21.5 mg Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
两相溶剂体积选择
• 色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数。溶剂 体系的选择对于HSCCC十分关键,通常来说,两相溶剂体系 应满足以下要求: • (1)为保证固定相保留值合适(不低于50% ) ,溶剂体系的分 层时间要小于30 s。 • (2)目标样品的分配系数K接近于1,容量因子应大于1. 5。 • (3)上下两相的体积大致相等,以免浪费溶剂。 • (4)尽量采用挥发性溶剂,以方便后续处理,易于物质纯化。 • Ito博士根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系 。
Absorbance(mAU)
高速逆流色谱仪原理特点及应用
高速逆流色谱仪原理特点及应用气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇气路管路、进样器、注射器的清洗清洗气路连接管时，应首先将该管的两端接头拆下，再将该段管线从色谱仪中取出，这时应先把管外壁灰尘擦洗干净，以免清洗完管内壁时再产生污染。
清洗管路内壁时应先用无水乙醇进行疏通处置，这可除去管路内大部分颗粒状堵塞物及易被乙醇溶解的有机物和水分。
在此疏通步骤中，如发觉管路不通，可用洗耳球加压吹洗，加压后仍无效可考虑用细钢丝捅针疏通管路。
如此法还不能使管线畅通，可使用酒精灯加热管路使堵塞物在高温下炭化而实现疏通的目的。
用无水乙醇清洗完气路管路后，应考虑管路内壁是否有不易被乙醇溶解的污染物。
如没有，可加热该管线并用干燥气体对其吹扫，将管线装回原气路待用。
假如由分析样品过程判定气路内壁可能还有其它不易被乙醇溶解的污染物，可针对实在物质溶解特性选择其它清洗液。
选择清洗液的顺序应先使用高沸点溶剂、而后再使用低沸点溶剂浸泡和清洗。
可供选择的清洗液有萘烷、N、N—二甲基酰胺、甲醇、蒸馏水、丙酮、乙醚、氟里昂、石油醚、乙醇等。
对进样器（包含汽化室）的清洗应以疏通为先导。
通常在进样器中的堵塞物是进样隔垫的碎片，样品中被炭化了的高沸点物，对这些固态杂质可用不锈钢捅针疏通，然后再用乙醇或丙酮冲洗。
为了使清洗更彻底，可选用2：1：4的H2SO4/HNO3/H2O混合溶液先对进样器清洗，然后再用蒸馏水，最后再用丙酮或乙醇清洗。
清洗完后烘干，装上仪器通载气半小时，加热到120℃待几小时后即可正常工作。
在拆装进样器时需注意不要碰断加热器引线或使引线碰到外壳；测温元件也应在装回进样器之后，按原先测温点装回。
通常测温元件和进样器加热体是紧密接触的，如距离过大将会造成过高的汽化温度。
注射器使用前可先用丙酮清洗，以免玷污样品，但可以还是用待注射样品对注射器自身做一二次清洗。
高速逆流色谱应用及发展
2 抗生素
用HSCCC 分析抗生素时，进样量一般为 1mg~5g，分离度和样品回收率高的优势，使 得 HSCCC 在抗生素单组份标准品的制备和多组分同 系物的分离纯化得到更为广泛的应用。 在HSCCC 中，一般用疏水性体系分离抗生素。 对于强极性组分用含有正丁醇的体系，中等疏水体 系用含有氯仿的体系，疏水性用含有正己烷的体系。
较小：多次萃取
逆流分配法，20世纪40年代,创始人Craig
高速逆流萃取：利用螺旋柱在行星运 动时产生的多维离心力场，使互不相溶的 两相不断混合，同时保留其中的一相（固 定相），利用恒流泵连续输入另一相（流 动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两 相之间反复分配，按分配系数的次序，被 依次萃取分离出。 在流动相中分配比例大的先被洗脱， 反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱， 从而实现分离。
（ 1 ）天然产物已知有效成分的分离纯化 （ 2 ）化学合成物质的分离纯化 （ 3 ）中药一类、五类新药的开发 （ 4 ）中药指纹图谱和质量控制研究 （ 5 ）抗生素的分离纯化 （ 6 ）天然产物未知有效成分的分离纯化及新 化合物开发 （ 7 ）海洋生物活性成分的分离纯化 （ 8 ）放射性同位素分离 （ 9 ）多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手 性分离等
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③相对于错流萃取和逆流萃取等传统的溶 剂萃取技术，具有适用范围广、操作灵活、 快速、制备量大、费用低、环保高效等优 点。 ④由于不需要固体支撑体，物质的分离依据 其在两相中分配系数的不同而实现，因而 避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、 失活、变性等，不仅使样品能够全部回收， 回收的样品更能反映其本来的特性，特别 适合于天然生物活性成分的分离。 ⑤由于被分离物质与液态固定相之间能够充 分接触，使得样品的制备量大大提高，是 一种理想的制备分离手段。
高速逆流色谱原理及应用
A:
bergapten 96.5% 45.8 mg
B:
imperatorin 98.2% 118.3 mg
92.1 、93.7%
精选课件
21
Journal of Chromatography A, 1061 (2004) 51–54
逆流色谱分离中药应用(V流动相)
实例3 CCC分离短瓣金莲花黄酮苷
2.5 ml/min
1: quercetin-3-O-neohesperidoside 85.1% 9.3 mg
2: orientin(荭草素) 97% 95.8 mg
3: 未知化合物 97%
4:
vitexin(牡荆素) 97% 11.6 mg精选课件
22
Journal of Chromatography A, 1092 (2005) 216–221
Introduction
Experimental
Apparatus. Reagents and materials. Preparation of crude sample. Measurement of partition coefficients Preparation of the two-phase solvent system and sample solution. HSCCC separation HPLC analysis and identification of HSCCC peak fractions Results and Discussion Selection of the two-phase solvent system and HSCCC conditions Structural identification Acknowledgements
高速逆流色谱法的概况及应用
高速逆流色谱法的概况及应用高速逆流色谱( High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC) 是Yoichiro Ito 博士于二十世纪八十年代首先研发、应用并发展起来的一种新型液-液分配色谱技术；HSCCC运用同步多层螺旋管进行行星式离心运动，使得在互不相溶的两相溶剂系统中可以实现样品在短时间内的高效分离，从而制备样品[1,2]。
高速逆流色谱技术不需要固体支撑物，主要根据样品在两相中所具有的不同分配系数进而对样品进行分离，相对于其他色谱技术如高效液相色谱、柱色谱等来说，具有高回收率、无吸附损耗、无峰拖尾等优点。
1、HSCCC法概况1.1 HSCCC法的基本原理HSCCC属于液 -液分配色谱，所以其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，即利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。
而 HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内 ,建立起一种单向性流体动力平衡体系。
螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，成行星运动[3]。
这样 ,加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。
HSCCC技术已经广泛应用于天然产物的分离。
1.2 溶剂系统的选择利用 HSCCC分离物质的关键是溶剂系统的选择。
经查阅多篇文献，总结要点如下。
对用于 HSCCC分离的溶剂体系，应该满足这几方面的要求：1)不造成样品的分解与变性；2)足够高的样品溶解度；3)样品在系统中有合适的分配系数值；4)固定相能实现足够高的保留[4]。
而对于溶剂体系选择的原则，Ito博士本人总结的几个要点是这样描的：1)待分析组分应易溶于溶剂系统 ,并不与之发生反应；2)溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相，以免浪费溶剂；3)组分在溶剂系统中的分配系数 K应为适当的定值 (0.5≤K≤1)；4)固定相的保留值要满足一定要求 (保留值越大峰形越好 )。
高速逆流色谱
高速逆流色谱综述高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)，于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术。
该技术由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等问题，具有传统的液-固色谱所不具备的独特优势，特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域[1]。
1 高速逆流色谱原理[1-2]图.1高速逆流色谱仪利用螺旋管的自转和公转同步同向行星式运动所产生的变化离心力场将固定相保留在螺旋管中，允许流动相快速流过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，达到一种特殊的流体动力学平衡——单向流体动力学平衡，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都反复进行着混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，在800rpm转速下时，混合和分配的频率可以达到13次/s。
大大提高了两相溶剂的混合效率，可以极大地缩短分离时间，这就是高速逆流色谱分离效率高的原因。
如图.1。
2 高速逆流色谱(HSCCC)的特点及与制备型高效液相色谱（prep-HPLC）的比较[3-4]目前制备出高纯度的天然产物的方法中，制备型高效液相色谱是使用最为广泛的。
与其相比，高速逆流色谱具有以下一些突出的优点。
（1）HSCCC回收率高：由于HSCCC不需要固体支撑体，避免了样品在分离过程中的不可逆吸附、分解、变性等问题。
理论上，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收；实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
粗样可以直接上样而不会对柱内固定相造成任何损害。
而prep-HPLC在样品吸附过程中会出现死吸附的现象，在制备高纯品的过程中，必然会以牺牲得率为代价，这是prep-HPLC不可避免的。
张苗 高速逆流色谱原理及应用讲解
chromatography (HSCCC)
❖ 班级：工业分析01 ❖ 主讲人：余俊 ❖ 同组者：汪雅洁 王星 杨云
张茜
1 高速逆流色谱发展 2 高速逆流色谱原理及工作方法 3 高速逆流色谱发展过程中形成的新技
术新方法 4 高速逆流色谱的应用及展望
摘要
❖ 摘要：高速逆流色谱是近年发展起来的，不 使用固定相载体的新型液液逆流色谱。本文 介绍了高速逆流色谱的工作原理，HSCCC在 的分离方面具有很大的优势，具有非常广阔 的应用前景。本文主要综述了HSCCC在天然 产物、生物医药和其他方面的应用情况。
❖ Abstract: The high-speed countercurrent
液－液分配色谱
➢ 利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶 剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分 配和传递
➢ 其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟 乙烯管绕成的螺旋管中
➢ 流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质 分配系数的不同依次洗脱而获得分离
特殊的流体动力学？
❖ 它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作 灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前 HSCCC技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技 术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等 领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分 离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。
固定相的保留
➢利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES）
➢从而实现流动相高速移动时固定相的保留
混合区：在靠近离心轴
高速逆流色谱法及其在药物纯化领域中的应用
高速逆流色谱法及其在药物纯化领域中的应用
黄秋霞;周如意;国大亮;刘玉璇
【期刊名称】《药学研究》
【年(卷),期】2010(029)010
【摘要】目的综述了高速逆流色谱法原理及其在药物分离制备领域中的应用.方法分析归纳了高速逆流色谱法的原理、溶剂体系及其在中药、抗生素、生物大分子、有机小分子和无机物分离纯化时色谱条件的选择和分离效果,简述了高速逆流色谱法在指纹图谱和仪器联用方面的新进展.结果及结论高速逆流色谱技术经过20多年的完善和发展已经初步形成一套比较完整的理论体系,高速逆流色谱仪已经在药物制备、纯化和质量控制等领域得到广泛应用.
【总页数】4页(P616-619)
【作者】黄秋霞;周如意;国大亮;刘玉璇
【作者单位】天津中医学院,天津,300193;天津中医学院,天津,300193;天津中医学院,天津,300193;天津中医学院,天津,300193
【正文语种】中文
【中图分类】O657.7
【相关文献】
1.高速逆流色谱法及其在天然药物研究中的应用进展 [J], 姜宁;陈执中
2.大孔吸附树脂法与高速逆流色谱法分离纯化虎杖中白藜芦醇的比较研究 [J], 程丽英;任红涛;刘树兴
3.大孔吸附树脂-高速逆流色谱法分离纯化苦水玫瑰花渣中的鞣花酸 [J], 吴梦琪;黄海;蔡狄宏;徐志珍;夏玮;张文清
4.高速逆流色谱法分离纯化大风艾中的黄酮类成分 [J], 谭道鹏;郭振虎;何莉;秦琳;何芋岐
5.高速逆流色谱法分离纯化麦芽糖基-β-环糊精 [J], 吴雪;邱超;王金鹏
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高速逆流色谱原理及应用
高速逆流色谱High Speed Counter Current Chromatography(HSCCC)Outline1. Principle2. Properties3. Applications分配定律：Nernst, 1891 年，Ｋ＝Ｃ1／Ｃ2两组分K相差较大：较小：一次萃取可得到分离多次萃取•1941, Martin & Synge级联链型萃取，开创了分配色谱技术•1944，Craig 非连续式逆流分溶(countercurrent distribution, CCD)•1966，Ito 离心式螺旋管逆流色谱(countercurrent chromatography,CCC)•1981，Ito 高速逆流色谱High Speed Counter Current Chromatography (HSCCC)液液分配色谱的新纪元CCD法（Countercurrent distribution，反流分布法，逆流分溶法）：是一种多次连续的液-液萃取分离过程Principle 液－液分配色谱or 逆流色谱¾利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递¾其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中¾流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊的流体动力学？逆流色谱(CCC)的原理•流体静力平衡体系（hydrostatic equilibrium system,HSES)•流体动力平衡体系（hydrodynamic equilibrium system,HDES)HSES液滴逆流色谱(droplet CCC, DCCC)收集器进样器溶剂泵约300根管柱上行法收集器进样器溶剂泵约300根管柱下行法优点：DCCC仪器轻巧简便，能避免乳化或泡沫的产生。
高速逆流色谱
高速逆流色谱属于逆流色谱的范畴，逆流色谱是一种新型的分离手段，它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的，值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体，其主要优点是没有传统色谱的死吸附，样品的回收率高等特点。
逆流色谱源于逆流分溶法，也就是用实验室经常使用的分液漏斗进行连续的液液萃取，根据样品在两种互不相溶的溶剂中分配比不同而进行分离。
逆流色谱早期发展的方法有液滴逆流色谱，旋转小室逆流色谱等。
但是作为一种分离手段，早期发展的逆流色谱不能满足高效快速的分离，分离的周期很长，效率很低。
在70年代，Ito 博士成功开发了一种能够高效快速分离的逆流色谱－高速逆流色谱。
但高速逆流色谱也有很多种设计，经过几十年的发展，现在的高速逆流色谱一般是采用同步行星式的设计，其主要是利用在高速旋转状态产生的二维离心力场的作用下使两种互不相溶的溶剂快速有效的对流或分割----或者说混合或分层，从而使样品能够在短时间内进行成千上万次萃取，根据样品中的物质分配系数的不同而进行分离的一种方法。
HSCCC 有几个突出优点：（1）无不可逆吸附。
聚四氟乙烯管中的固定相无需载体液-液色谱系统，故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；（2）高回收率。
由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同步完成，故特别适于制备性分离；（3 ）操作简便。
因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。
与HPLC 相比，HSCCC 进样量较大，最多可达数克，是HPLC 的数百倍；与常压、低压色谱相比，HSCCC 的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。
高速逆流色谱作为一种比较新颖的分离方法，影响因素主要有溶剂体系的选择，旋转速度，流动相的流速，温度等影响。
溶剂体系选择即条件的摸索，相当于传统色谱摸流动相的条件，不同的是高速逆流色谱条件的摸索主要是指样品在固定相和流动相两者之间的分配的比值，待分离的样品的K值最好在0.6-1.5范围之内，这样才会有一个好分离效果。
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用ppt文档
a.仪器对保留值的影响（外因）
研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半 径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转 螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使 值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性 流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件 使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运 动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的 中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力 条件的影响。
• 2.2.4 温度的影响
温度的提高溶剂的黏度有很大的影响，一般提高 温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低 的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用 的都是有机溶剂，沸点很低。
3.在分离天然产物中的应用
从天然产物中提取的活性成分是防治疾病和强身 健体的物质基础。从天然产物活性成分中发展新药 、寻找先导化合物并进行结构修饰是药物研发的重 要内容,目前,许多市场销售和进入临床阶段的抗肿瘤 和抗感染药物都来源于天然产物。
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
1.2 发展史
• 二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国 家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相 溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段 割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。
• ITO及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一 系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行 星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用 于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后ITO把流 通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现 代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测 和收集，并建立了两个基本的流通体制。
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• 利用分析型高速逆流色谱仪(TBE-20A) 筛选溶剂条件：
• 1.效率高 • 2.重现性佳（分析型到制备型）
分析型HSCCC
制备型HSCCC
高速逆流色谱技术的应用领域
一. 高速逆流色谱在中草药有效成分 提取分离中的应用
实例1 实例
HSCCC分离纯化香豆素类化合物
100％
95％ 99.6％ 99.7％ 100％
高速逆流色谱的技术原理及应用领域
上海同田生物技术有限公司公司位于上海张 江科技园，占地约 30 亩，建筑面积约 20000 平方 米，总投资人民币 6000 万元，其前身是成立于 1999 年 2 月位于深圳市清华大学研究院的深圳市 同田生化技术有限公司。
公司致力于高速逆流色谱仪（ HSCCC ）、 高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料 / 中间体的研究开发、生产和销售。
实例7 实例 溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:3:4:2.5,V/V）， 检测波长：254nm；柱温：25℃；进样量：300mg
I+ I I III
异戊酰螺旋霉素 I+ 异戊酰螺旋霉素 I I＝95％以上 异戊酰螺旋霉素 I I I＝95％
三. 高速逆流色谱在蛋白质 分离纯化中的应用
实例8 实例
利用HSCCC分离标准蛋白质混合物
溶剂体系：PEG1000-磷酸盐体系-水＝ 14-16-70(%,w/w) 样品：1mg 细胞色素C、 20mg 溶菌酶、5mg 血红蛋白
8 6 Signal (mV) 4 2 0 0 100 200 Time (min) 300
3 1.Cytochrome C; 2 2.Lysozyme ; 3.Hemoglobin (反
溶剂体系：正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(V/V)＝5:6:6:6 进样量＝400mg 白花败酱粗提物
HSCCC馏分的HPLC纯度检测结果 1. 99.2％，2.98.5％，3.97.6％
*引用文献：Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50
实例4 实例
朝鲜淫羊藿的分离
实例10 实例
利用HSCCC从鸡蛋清分离了高纯度卵白蛋白
1
8
10 8 Signal (mV) 6 4 2 0 0
1 2
6 Signal (mV) 4
2
2 0 0 100 Time (min) 200 300
3
50
100 Time (min)
150
200
Sigma鸡蛋清蛋白质干粉 鸡蛋清蛋白质干粉
逆流色谱的原理
• 液－液分配色谱：利用样品中各组分在两相溶 液分配色谱： 剂间分配比的差异，进行分离。 剂间分配比的差异，进行分离。它是不用固态 载体的全液态的液-液分配色谱技术 液分配色谱技术. 载体的全液态的液 液分配色谱技术 • 优点： 优点： • 不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为100％ 不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为 ％ • 极大地避免了样品的变性问题 • 操作简单，无需太多样品前处理等。 操作简单，无需太多样品前处理等。
• 同田对照品纯度达99%以上,均通过严格的质 量检测,包括HPLC,NMR,MS,UV等方法的鉴定.
银杏内酯 B
银杏内酯 A
Hale Waihona Puke 银杏内酯 C• 部分对照品获得国家质量监督检 验检疫总局颁发的标准物质证书
• 天然植物<银杏,大豆>单体 提取物-上海市高新技术成 果转化项目
• <石杉碱甲>-上海市高 新技术成果转化项目
作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型 专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者， 我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司 通用电气医疗生物科学中国有限公司 （ GE Healthcare Bio-sciences co.,ltd . ） 建立 了长期的合作伙伴关系 .
TBE300A＋ÄKTA Prime ＋
• 20世纪50年代，逆流分溶法(CCD) • 由Craig发明的非连续性分溶装置 (设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化、溶 剂耗量大、分离时间太长) • 20世纪60年代被液相色谱代替
• 20世纪70年代，逆流色谱(CCC)。首先 出现液滴逆流色谱(DCCC)
溶剂 泵
进样器
进样器
溶剂 约300根管柱 300根管柱 上行法 收集器
溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:5,v/v) 样品：吴茱萸粗提物180mg
1.Evodiamine; 2.rutaecarpine; 3.evocarpine; 4.1methy-2-[(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)quinolone; 5.1-methy-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone;
溶剂体系：氯仿:甲醇:水(V/V)＝4:3.5:2 进样量＝200mg 朝鲜淫羊藿提取物
HSCCC馏分的HPLC纯度检测结果 1.98.2％，2.99.7％，3.98.5％
*引用文献：Journal of Chromatography A,1064(2005)53-57
实例5 实例
HSCCC分离生物碱类化合物
• 同田对照品质量目前已得到美国，德国， 瑞士，英国，新加坡等多家标准品经销 商及科研院校的认可，公司与国内外多 家科研单位保持长期稳固的合作。
高速逆流色谱 High Speed Counter-Current Chromatography
一、逆流色谱(CCC)原理及分类 二、高速逆流色谱(HSCCC)的原理 三、高速逆流色谱的应用实例
溶剂体系:石油醚:乙酸乙酯:甲醇:水(V/V)＝5:5:5:5，5:5:6:4， 5:5:6.5:3.5(梯度洗脱)；进样量＝150mg(蛇床子提取物)
样品的HSCCC图谱
样品的HPLC图谱
*注：Ⅵ是未知化合物，纯度为 98.1％ 注 98.1％ 是未知化合物， *引用文献:Journal of Chromatography A,1055(2004)71-76
转出峰，上相为流动 相)
1
*引用文献：色谱，2005,Vol.23 No.1 12～17
实例9 实例
溶剂体系：PEG1000-磷酸二氢钾-水＝15-17-68(%,w/w) 样品：1mg 细胞色谱、8mg 肌红蛋白、20mg溶菌酶
1.Cytochrome C; 2.Myoglobin 3.Lysozyme
• 用分析型HPLC筛选溶剂体系，主要是利 用HPLC来确定溶质的分配系数，分配系 数K=CS/CM 或CU/CL • HSCCC最合适的K值范围是0.5－2 • 当CS/CM＜＜0.5时，出峰时间太快，峰 之间的分离度较差，当CS/CM＞＞2时， 出峰时间太长，且峰形变宽
实例 根据文献报道，筛选出芦荟甙HPLC分离的色谱条件，得到芦荟甙 提取物的HPLC图谱如下，1芦荟未知物，2芦荟甙A，3芦荟甙B
二. 高速逆流色谱在抗生素 分离纯化中的应用
实例6 实例 溶剂体系：石油醚-丙酮-水（3:3:2,v/v） 样品：250mg 环孢菌素粗品 检测条件：ELSD
环保菌素 A－98.6%， 90.2%(收率) 环孢菌素 C－99.3％， 85.0%(收率) 环孢菌素 B－98.7％， 88.5%(收率) 环孢菌素 D－98.5％， 86.3%(收率)
在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批 量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆 流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、 制备型等7种不同产品：
德国
泰国
• 国内最大最早的专业对照品标准品研发及 生产企业之一 • 拥有长达8年的对照品研发及生产经验
•配备有完整的对照品研发中心,检测中心和 生产中心(对照品高速逆流色谱生产线)
HSCCC的工作流程简易图
HSCCC分离条件 分离条件
溶剂 条件
样品 分离 效果
转速
温度
流速
HSCCC的溶剂条件选择 的溶剂条件选择
• HSCCC采用液-液分配原理，增加了 固定相选择环节，因此它的溶剂条件 选择方法与其他色谱技术不同。
溶剂条件的筛选方法
1、文献报道的溶剂条件 经典体系1：氯仿-甲醇-水：4-3-2 经典体系2：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水：1-1-1-1 2、TLC方法初步筛选 初步判断样品在上、下相中的分配情况 3、HPLC方法分析分配系数 、 方法分析分配系数 分析目标组分在两相中的分配系数K值 4、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点
HDES 可变的引力场
离心力 引力 离心力
同步行星式运动 CPC DCCC RLCCC HSCCC
高速逆流色谱(HSCCC)的原理
流体静力学 平衡(HSES) 平衡 流体动力学 平衡(HDES) 平衡
逆流色谱的基本体系示意图
固定相的保留原理
如上图所示，螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶 剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受 到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。 不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按 一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并 且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。
实例2 实例 溶剂体系:石油醚:乙醇:乙醚:水(V/V)＝5:4:0.5:1， 进样量＝658mg 姜黄根挥发油
*HSCCC馏分的HPLC纯度检 测，纯度>95％
*引用文献:Journal of Chromatography A,1070(2005)207-210
实例3 实例
HSCCC分离黄酮类化合物
－ 上层 － 下层
体系
氯仿/异丁醇/甲醇/水 4：0.25：3：2 芦荟未知物 0.9 2.3h 芦荟甙A 1.9 4.0h 芦荟甙B 2.3 5.3h
目标物质 分配系数K 分配系数 300BHSCCC保留时间