高速逆流色谱仪的优势

高速逆流色谱仪的优势

高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC）是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土最先研制开发后由北京市新技术应用研究所在国内开展研发和推广工作。其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。

1. 高速逆流色谱仪原理及特点

HSCCC利用了一种特殊的流体动力学（单向流体动力学平衡）现象。具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。

2. HSCCC的优点

HSCCC主要具有以下几个方面的优点。

2.1 应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。

2.2 操作简便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。

2.3 回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100％。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。

2.4 重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。

2.5 分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究

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高速逆流色谱仪常用溶剂体系选择方法

1. 已知的溶剂体系

被分离物质种类基本两相溶剂体系辅助溶剂

非极性或弱性物质正庚（已）烷-甲醇氯烷烃

正庚（已）烷-乙腈氯烷烃

正庚（己）烷-甲醇（或乙腈）-水

中等极性物质氯仿-水甲醇，正丙醇，异丙醇

乙酸乙酯-水正己烷，甲醇，正丁醇极性物质正丁醇-水甲醇，乙酸

2. 分配系数测定法

一个稳定的两相溶剂体系是否适合于目标物质的分离，通常要看物质在该溶剂体系中的分配系数是否在一个合适的范围内。分配系数K=CS/CM或CU/CL。其中CS指溶质在固定相中的浓度，CM指在流动相中的浓度，CU指溶质在上相中的浓度，CL指溶质在下相中的浓度。一般而言，对HSCCC最合适的K值范围是0.5~2。当CS/CM≤0.5时，出峰时间太快，峰之间的分离度较差；当CS/CM≥1时，出峰时间太长且峰形变宽。而当0.5

溶质的分配系数可以采用分析型HPLC来确定。如果有目标成分的对照品或标准品，当溶质在两个互混溶的液相中分配之后，各组分的浓度即可用HPLC精确测定出来，从而计算出分配系数K值。如果没有目标成分的标准品，混合物中各组分的分配系数值可以通过下述方法进行简单的计算：即先将一定量的样品溶解在体积为Vu的上层溶液中，然后再用体积为VL的下层进行分配，分别测定分配前和分配后上层溶液中各组分的响应值，然后用图1所示的方法即可计算出分配系数。同样，也可以采用薄层色谱法来测定各组分的分配系数。

3. HPLC扫描法

对于一个未知样品，可以通过HPLC扫描的方法，对样品的复杂程度及其组分的极性程度有一个初步的了解。具体来讲，可以将样品注入一根15cm长的C18HPLC柱，以乙腈和水为流动相，以1ml/min流速，从100%乙腈梯度洗脱1h，观察样品出峰的位置。如果绝大部分峰的保留时间都小于15min，也就意味着这些组分是由含量小于25%的乙腈流动相洗脱出来的，在CCC中可以采用极性溶剂体系，如正丁醇-水等；如果峰的保留时间是在15～50min 之间，意味着这些物质具有中等极性，在CCC中可以采用中等极性溶剂；如果绝大部分峰在50min后洗脱出来，也就是由大于80%的乙腈流动相洗脱出来的，那么在CCC分离中应该采用弱极性的容积体系。

4. 薄层色谱法

采用薄层色谱（TLC）法也可选择对HSCCC合适的两相溶剂体系。在硅胶板上作薄层色谱试验，用水饱和的有机层（即两相中的有机相）作展开剂。如果需要分离的组分的Rf ＞0.5（低级性溶质），这说明此种条件适用于这些组分混合物的分离，而且弱极性的有机相适用于作流动相。对于极性较大的溶质Rf＜0.5，则极性较强的那一相可作流动相。这种方法只能给出应选溶剂体系的大体指示，因为TLC本身就包含有分配和吸附两种机理，而CCC 则是纯粹的液-液分配过程。然而，TLC仍不失为一种简便易行的手段，当小量的样品在溶剂体系的两相之间分配时，TLC仍能用来检查其分布状况。比如，如果发现样品几乎全分布在一相之中，那么这个溶剂体系是绝对不能用的。