Elisa影响因素及措施整理

一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30

~60 min，各试剂在使用前充分混匀。②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。

二、操作不当导致

1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；

2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；

3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会

对结果造成较大影响。

4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；

5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；

6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；

7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。

8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空

白值或背景值升高。

三、检测样品处理不当引起溶血或污染

1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性

的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；

2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；

3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；

4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。如果

在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳

性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采

用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。

5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，

使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检

测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此

重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品

的过度混合将引起血清蛋白的变性。

6、地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对

测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所

用单克隆抗体对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。

7、黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶，如用辣根过氧化物酶为标记物，就有可能

产生非特异性显色。血清脂质过高、血红蛋白及血液粘度过大等，都会对Elisa结

果产生较大影响。

8、标本管中添加物质的影响抗凝剂(如肝素、EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA

系统中辣根过氧化物酶活性)及快速分离血清的分离胶均对ELISA测定有一定的干

扰作用。

标本为血清，最好将血液先于室温放置l-2h后，再用3000rpm离心l0 min；标本若为血浆，必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15 min；血清标本宜在新鲜时检测，如在冰箱中保存过久，其中的蛋白质可发生聚合，在间接ELISA中可使本底加深。一般4℃放置的血清标本应在5天内测定，再长时间需低温-20℃或-80℃冻存样品。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀，且要避免产生气泡。

四、内源性干扰因素

内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。在日常的临床血清（浆）标本中，有相当比例不同程度的含有上述各种干扰物质，从而导致测定结果的假阳性。

1、类风湿因子（rheumatoid factors，RF）

在类风湿患者、其他疾病患者以及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的RF，RF 一般为TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人弘链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。为避免RF对ELISA测定的干扰，通常可以采取下述措施：

1）稀释标本：这在判断急性病原体感染的特异IgM抗体如抗HAV IgM，抗HBc IgM，TORCH的IgM抗体检验等尤为有用。因为急性感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高，而RF滴度通常相对要低得多。因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。有些特异IgM检测ELISA试剂盒不要求稀释标本，直接检测，这样虽然方便了实验室技术人员的操作，但容易出现假阳性结果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循环中抗HBe lgM可持续以一定的滴度存在，标本不做稀释即进行检测，即可出现阳性结果，从而失去抗HBc lgM用于HBV急性感染的诊断价值。因此，在临床实验室，一定要使用要求对标本做1:1000稀释的试剂盒进行检验，从而保证相应检测项目结果的可靠性及临床应用价值。

2）改变酶标抗体：由于RF结合的是IgG的Fc片段，如果将待酶标抗体的Fc片段切除，仅留下具有特异结合功能的Fab部分做酶标，在测定中即可避免RF的干扰。

3）标本中RF用变性IgG预先封闭：将经热变性（63℃，10min）的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中，或是将该变性IgG连接至一颗粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入临床血清标本，反应后，再吸出标本进行检测。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG。

4）测定抗原时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂：如2-巯基乙醇等还原剂可使抗体内的巯基裂解，因而可以去除RF的干扰，但只适用于抗原测定。

5）包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体IgY：RF不与鸡IgY反应，如果包被和酶标二抗均为鸡IgY抗体，则不受标本中RF的干扰。

2.补体

在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相特异抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其Fc段的补体C1结合位点被暴露出来，这样C1就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阳性结果或使定量测定结果偏低。由补体引起的干扰可通过下述方法避免：

（1）对临床血清标本加热灭活补体：采用56℃30min加热可使标本中的补体C1灭活。

（2）包被抗体或酶标二抗使用特异的鸡抗体：鸡抗体不激活人的补体系统，因此，使用特异的鸡抗体，不会出现因补体激活而存在的假阳性和假阴性干扰。