DNA重组技术的基本工具

将不同种来源的DNA片段连接起来
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思考与探究 P7
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，含有某种限制酶的 细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制 酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将 甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制 酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有 某种限制酶也不会使自身的DNA被切断， 并且可以防止外源DNA的入侵。
3、质粒
分布：许多细菌
有切割位点
本质：小型环状DNA分子。 有标记基因 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
工具3：运载体
1、需要的条件： ⑴有1~多个限制酶切点 ⑵能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制 ⑶有某些标记基因，便于筛选 ⑷对受体细胞无害 2、常用运载体： 质粒、λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒 3、质粒
P7.思考与讨论：限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开 吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能 用DNA连接酶将它们连接起来？ GC… …G … CTGCA ②…AC ③ ④ ①
…G …TG CG… …CTTAA G… ⑤ ACGTC… …GC ⑥ …CG GT… ⑦CA… AATTC… ⑧ G…
反馈练习：
5、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析： ①GC… ②AATTC… ③ …GC ④ …CTTAA CG… G… …CG …G (1)其中①和 是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用DNA连接 酶通常是 。 （2） 和 是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常 是 。
• •• ••
3、特点:识别特定核苷酸列,
切割特定切点 （专一性） 切割DNA 4、作用： 5、结果： 产生黏性未端或平末端
思考?
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 • 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两 者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合 成重组的DNA分子了。
专题1.
基因工程
基因工程的概念 基因工程的发展史
1.1 基因工程的基本工具 1.2 基因工程的基本操作程序 1.3 基因工程的应用
1.4 蛋白质工程的崛起
你还记得我们吗？
• 氢键 • 磷酸二酯键 • DNA聚合酶
基因工程的概念：
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计， 并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的 遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型 和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设 计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。
• • • • •
基因拼接技术或DNA重组技术 别名： 操作环境： 生物体外 基因重组 原理： 操作水平： DNA分子水平 结果： 定向地改造生物的遗传性状，获得 人类所需要的品种。
基因工程的产物
普通棉花
抗虫棉
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
提取
普通棉花(无抗虫基因) 棉花细胞(含抗虫基因) 转基因棉花植株
三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”
1、载体必须具备的条件： ①能够在宿主细胞中复制或整合到受体细胞
的染色体DNA上复制 ②具有一至多个限制酶切点，以便与 外源基因连接 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④对受体细胞无害
• 2、常用的载体：
• • • 质粒（最常用) λ噬菌体的衍生物， 动植物病源自文库等
抗虫基因
与运载体DNA拼接 导入
1 .1、DNA重组技术的基本工具 “分子手术刀”-- 限制性核酸内切酶 “分子缝合针”-- DNA连接酶 “分子运输车”-- 运载体
一、限制性核酸内切酶 ——“分子手术刀” • 1、简称：限制酶 • 2、分布： 主要在原核生物中 • 寻根问底(P4)
• 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是 是什么吗？
生物A基因片段 ……GAATTC…… ……CTTAAG……
生物B基因片段 ……GAATTC…… ……CTTAAG……
EcoRⅠ 酶切
……G AATTC…… ……CTTAA G…… ……G AATTC…… ……CTTAA G…… 不同来源的DNA片段混合 ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG……
二、 DNA连接酶 ——“分子缝合针”
1、作用: 把DNA片段拼接成新的DNA， 2、作用原理： 催化磷酸二酯键形成 , 不是氢键
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4DNA连接酶
3、类型：
类型
来源 功能 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和 平末端
2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 （ D）
D、它是环状DNA
3、下列不适合用于基因工程的运载体 是（ C ） A、质粒 B、噬菌体 选 审题 我 C、细菌 D、病毒 4、下列说法正确的是：（ D ） A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、 连接酶、运载体 选 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 我 进行大量复制的过程可称为“克隆”
②和⑦能连接形成
…ACGT… …TGCA…
③和⑥能连接形成
…GCGC… …CGCG…
反 向 对 称
④和⑧能连接形成
…GAATTC… …CTTAAG…
①和⑤能连接形成 …CTGCAG…
…G ACGTC…
思考与探究 P7
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ 迄今为止，所发现的DNA连接酶都 不具有连接单链DNA的能力，至于原因， 现在还不清楚，也许将来会发现可以连 接单链DNA的酶。
6)第一例转基因动物问世
1980年第一个转基因小鼠问世 1982 年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠” 1983年培育出第一例转基因烟草
7)PCR技术的发明
1988 年穆里斯发明了 PCR 技术 , 使基因工程 技术得到了进一步的发展和完善 . 获 1993 年 诺贝尔化学奖
1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗 棉铃虫的转基因抗虫棉
一、限制性核酸内切酶 ——“分子手术刀”
• • •
3、特点:（专一性）
•识别特定核苷酸列, 特定位点切割
断裂：磷酸二酯键
限制酶的识别特点
• 以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列 •
• 如：GAA TTC • CTT AAG
CCC GGG GGG CCC
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
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1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术 1977年科学家又发明了DNA序列分析方法
• 4) DNA体外重组的实现 1972 年伯格 (P.Berg) 首先在体外进行 了 DNA 改造的研究 , 成功地构建了第 一个人工体外重组DNA分子.
5)重组DNA表达实验的成功
1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录 出相应的 mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成 功表达,至此表明基因工程正式问世. 1973年科学家才将质粒作为基因的载体使用 这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验 1973年科恩第一个建成“基因工程菌”，并创 立基因工程模式 1973年称这“基因工程元年”， 科恩被称为基因工程发展史上的创始人 科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的 专利技术
用途
DNA复制
基因重租
工具2： DNA连接酶
1、作用: ：把DNA片段拼接成新的DNA，
2、作用原理：催化磷酸二酯键形成 3、类型
coli DNA 连接酶 ①E· ②T4DNA 连接酶 来源：大肠杆菌 作用特点：只连接黏性末端
来源：T4噬菌体
作用特点：连接黏性末端和平末端
4、 DNA连接酶与DNA聚合酶比较
再见
技术发明命使基因工程的实施成为可能
1)基因转移载体的发现
1967 年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能 力,为基因转移找到一种运载工具.
2)工具酶的发现
1970 年阿尔伯 (W.Arber) 、内森斯 (D,Nathans) 、史密 斯(H.C.Smith)细菌中发现了第一个限制酶
3)DNA合成和测序技术的发明
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 T4DNA连接酶 T4噬菌体
寻根问底 (P6)
• DNA连接酶与DNA聚合酶 是一回事吗?为什么? 4、 DNA连接酶与DNA聚合酶比较
DNA聚合酶 DNA连接酶 将单个核苷酸连接到 在两个DNA片段之 已有的核酸片段上， 间形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键
作用 对象
思考与探究 P7
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工 程载体吗？为什么？
不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定 条件,且都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
反馈练习：
• 1、在基因工程中，切割运载体和 含有目的基因的DNA片段，需使 用（ ） A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
限制酶在原核生物中的作用
原核生物易受自然界外源DNA的入侵， 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善 的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限 制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源 DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割 掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原 核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效， 从而达到保护自身的目的。
• 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
SmaⅠ
平末端
平末端
一、限制性核酸内切酶 ——“分子手术刀”
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•
④作用： 切割DNA
⑤结果： 产生黏性未端和平末端
工具1：限制性核酸内切酶
1、简称： 限制酶 2、分布：主要在原核生物中