重组门冬酰胺酶 设计性实验
重组l-门冬酰胺酶的提取纯化工艺
重组l-门冬酰胺酶的提取纯化工艺介绍如下:
L-门冬酰胺酶是一种能够将L-门冬氨酸催化转化为（S）-去羧肟丙氨酸的酶，具有极大的应用潜力。
本文将介绍一种可行的重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺。
1.酶表达及收获：利用基因重组技术，将L-门冬酰胺酶基因克隆进入大肠杆菌中表达。
将表达产物通过超声波破碎将细胞内的酶抽出并离心，上清液即是未纯化的粗酶液。
2.酶列层析：未纯化的粗酶液在硫酸铵饱和度为70%的情况下进行酶柱层析，选用阳
离子交换层析分离酶的分子量和荷电性质，如Q-Sepharose FF层析柱。
将符合条件的酶进行批量收集，去除未得到的酶和杂质。
3.碘盐化学修饰：经过第一次纯化后，酶的纯度和活性仍然不够高，需要进行进一步
的纯化。
碘盐处理可以提高酶的稳定性和特异性，有助于去除表型或变形的酶。
将适量的KI添加到酶液中，在适当pH和温度下干燥，直至酶不再吸收碘化物。
4.透析纯化：将经碘盐处理的酶溶解在透析缓冲液中，在温和的离子强度和pH条件
下进行亲和层析，可以去除KI和其它大分子的杂质，提高酶液的纯度。
该阶段的纯化大量使用隔膜，有选择性地对酶进行分离和缓冲溶液交换。
5.尿素剪切：通过尿素等离子体进行酶剪切工艺，可以去除酶的表面氨基酸，去除肽
链信号，提高酶的纯度和催化活性。
酶剪切后，可以进一步通过透析等工艺进行纯化。
以上是一种可行的重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺流程，这个工艺流程可以根据酶的性质和制备目的进行改变和改进，以做到最佳的提取效果。
浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究
浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究1. 引言1.1 研究背景L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）是一种能够降解天冬酰胺和L-谷氨酸的酶，通常被广泛应用于治疗白血病和其他恶性肿瘤。
传统来源的L-天冬酰胺酶存在一些问题，如来源不稳定、纯度低、免疫原性强等。
研究者们开始探索通过基因工程技术构建高效表达的重组L-天冬酰胺酶，以应对传统L-天冬酰胺酶存在的问题。
L-天冬酰胺酶的重组表达载体设计和构建是实现高效表达的关键步骤。
通过选择合适的载体和宿主菌株，搭配适当的启动子和调控元件，可以实现L-天冬酰胺酶基因的高效表达。
还需要考虑到蛋白质的折叠、稳定性和可溶性等因素，以确保重组L-天冬酰胺酶的功能完整性和活性。
本研究旨在探讨L-天冬酰胺酶的重组表达载体设计与构建，以及其在纯化、表达及酶活性检测方面的应用。
通过对L-天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究，可以为进一步提高L-天冬酰胺酶的表达水平和活性，以及扩大其应用范围提供重要参考和理论基础。
1.2 研究目的研究目的：通过对L-天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究，旨在深入了解该酶在生物体内的功能和作用机制，探讨其在生物医学和工业领域的潜在应用价值。
具体目的包括：1. 研究L-天冬酰胺酶在代谢过程中的作用，揭示其在生物体内的生物学功能及代谢途径；2. 探讨L-天冬酰胺酶的结构特点，从分子水平揭示其催化机制和底物选择性；3. 设计和构建适用于L-天冬酰胺酶的重组表达载体，实现对该酶的高效表达和纯化；4. 实验验证重组L-天冬酰胺酶的表达效果，研究其酶活性及功能；5. 探讨L-天冬酰胺酶与其重组表达载体研究的意义，为未来相关研究提供理论基础和实验指导。
通过本研究，期望能够全面了解L-天冬酰胺酶及其重组表达载体的特性和应用前景，为进一步的研究和开发提供重要参考。
2. 正文2.1 L-天冬酰胺酶的重要性L-天冬酰胺酶是一种重要的酶类，广泛存在于生物体内，在氮代谢中发挥着关键作用。
门冬酰胺酶的制备与分析
门冬酰胺酶的制备与分析重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏⽩华⼭1 原理本实验主要是利⽤基因⼯程⼿段构建L-天冬酰胺酶基因⼯程菌。
L-天冬酰胺酶的⽣理作⽤主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对⾮霍奇⾦淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作⽤，⽬前适⽤于治疗⿊⾊素瘤、⾮何杰⾦病淋巴瘤等，也可以⽤于治疗急性单核细胞性⽩⾎病、慢性淋巴细胞性⽩⾎病等。
⽬前，我国虽已投⼊⽣产L-天冬酰胺酶，但是较国外⽣产成本⾼、菌种产酶活性低，提取纯化⼯艺落后。
针对这些问题，本实验对⼤肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进⾏了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化⼯艺，分析其鉴定⽅法与性质。
本实验主要进⾏了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋⽩的诱导表达条件分析；酶蛋⽩分离纯化⼿段的⽐较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离⼦交换层析以及亲和层析；重组蛋⽩酶活⼒监控与本底蛋⽩活⼒测定等等。
2 实验材料实验仪器见表1.1。
型号和⽣产⼚家根据实验室现有条件核定。
表1.1 实验仪器或装置仪器名称型号⽣产⼚家超净⼯作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离⼼机恒温摇床涡轮振荡器⾼压灭菌锅蛋⽩电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计⾼效液相⾊谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机实验试剂和材料见表1.2。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。
表1.2 试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli 野⽣型菌株CPU21009 实验室储存pMD18-T 50ng/µl 宝⽣物⼯程有限公司pET-22b 50ng/µl 宝⽣物⼯程有限公司Nde Ⅰ10U/µl 宝⽣物⼯程有限公司Xho Ⅰ10U/µl 宝⽣物⼯程有限公司T4 DNA Ligase 350U/µl 宝⽣物⼯程有限公司DNA纯化试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离⼼柱型天根⽣化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L 实验室储存PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯Taq 酶 Mix 分析纯(NH4)2S2O8分析纯C 2H6OS 分析纯CH4O 分析纯冰⼄酸分析纯C 2H6O 分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS 分析纯Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋⽩胨分析纯⽢氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖⾷品级TEMED 优级纯溴酚蓝分析纯IPTG 优级纯丙三醇分析纯3 实验思路与步骤本实验设计从⼤肠杆菌野⽣型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增⽬的基因ansB，随后对PCR产物进⾏纯化。
ENKTL门冬酰胺合成酶的表达及以门冬酰胺酶为基础化疗方案的疗效分析的开题报告
ENKTL门冬酰胺合成酶的表达及以门冬酰胺酶为基础化疗方案的疗效分析的开题报告
1. 研究背景和意义
恶性淋巴瘤是一种常见的血液肿瘤，其中鼻咽癌是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤亚型。
ENKTL是常见的鼻咽癌亚型之一，常伴有循环系统、消化系统等器官的转移，严重影响生存率。
当前的治疗方案多样化，但是尚缺少有效的靶向治疗药物。
门冬酰胺基是鼻咽癌细胞中的重要生化代谢途径。
门冬酰胺酶能够将门冬酰胺酶底物转化为门冬酰胺，起到抑制细胞凋亡的作用。
因此，ENKTL的治疗中可能存在着门冬酰胺酶过度表达的现象，导致治疗效果不佳。
ENKTL门冬酰胺合成酶的表达及涉及其调节可能为鼻咽癌的诊断和治疗提供新思路。
2. 研究内容
本研究计划通过收集和筛选ENKTL患者的鼻咽癌组织和正常对照组织进行实验室实验，探讨ENKTL中门冬酰胺合成酶的表达水平及其对治疗效果的影响。
具体研究内容如下：
（1）收集ENKTL患者的鼻咽癌组织和正常对照组织，采用免疫组化和实时荧光定量PCR比较门冬酰胺合成酶的表达水平，并分析其与临床病理特征的关系。
（2）建立ENKTL细胞的稳定转染系统，通过siRNA及/或CRISPR-Cas9技术抑制门冬酰胺合成酶的表达，并检测细胞增殖、转移和凋亡的变化。
（3）通过门冬酰胺酶的体外检测和体内试验评估其作为鼻咽癌的治疗靶点的可行性和效果。
3. 研究意义
本研究可探讨ENKTL中门冬酰胺合成酶的表达和调控机制，为鼻咽癌的诊断和治疗提供新思路，拓展ENKTL的治疗选项，促进临床治疗水平的提高。
同时，该项目还可为其他淋巴瘤亚型的研究提供参考模板。
2011设计实验
综述近年来有关大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶的结构与功能、纯化工艺以及酶的修饰的研究进展。
L2-天冬酰胺酶具有抗肿瘤活性,目前临床上已将其用于儿童急性淋巴细胞白血病的治疗,是治疗此类白血病的重要的药物。
……L2天冬酰胺酶( L2asparaginase , L2ASP ,EC13151111) ,又名L-门冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶,商品名为左旋门冬酰胺酶。
L-ASP 单独使用时,对ALL 的有效率为60 % ,与长春碱(vincristine)及皮质甾类药物(corticosteroids) 联合使用时,对ALL的有效率高达95 % 。
另外,L-ASP 对单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病也有一定的疗效,对胰腺癌细胞的增多还有一定的抑制作用,是临床治疗白血病的重要药物。
L-ASP 抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人体L-ASP 抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人体内L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的浓度,这两种氨基酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。
肿瘤细胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L-天冬酰胺,需要摄取外源L2天冬酰胺才能存活。
当外源L-天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此L-ASP 能有效抑制肿瘤细胞的增殖。
有研究表明, L-ASP 能够选择性抑制体内Ra-pamycin2靶标信号传导(Rapamycin-targeted sig-naling pathway) ,从而抑制肿瘤的增值。
另有文献报道,L-ASP 在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53 蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡。
目前,国内临床上应用的L-ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产E.coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。
为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等[5 ]率先进行了E.coli天冬酰胺酶ansB基因的兊隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。
门冬酰胺酶对白血病患儿静脉血栓形成的研究进展
门冬酰胺酶对白血病患儿静脉血栓形成的研究进展门冬酰胺酶在联合化疗中的应用使儿童急性淋巴细胞性白血病成为可治愈的恶性肿瘤。
但ASP导致血栓形成可影响患者化疗进程，降低化疗缓解率。
静脉血栓形成的发病率在1%～36%，主要取决于患者年龄、治疗方案、血栓筛检方法的不同。
血栓形成的部位主要在上肢静脉，尤其是中心静脉导管。
ASP导致血栓形成的机制是通过降低AT-Ⅲ水平，及激活血小板和内皮细胞。
年龄、中心静脉导管、激素及遗传因素均是影响血栓发生的高危因素。
预防性使用AT-Ⅲ或LWMH可降低静脉血栓形成的风险。
新型口服抗凝药物，是凝血酶或Xa因子直接抑制剂，其抗凝效果不依赖AT-Ⅲ水平，由此推测，新型抗凝剂比传统抗凝剂在预防门冬酰胺酶相关性血栓形成更为有效和更便于临床应用。
Abstract：Application of asparaginase in combination chemotherapy makes childhood acute lymphoblastic leukemia a curable malignant tumor.However，ASP caused thrombosis can affect the chemotherapy process and reduce the remission rate of chemotherapy.The incidence of venous thrombosis varies from 1%～36%，depending on the age of patients，treatment options，and screening methods for thrombosis.The site of thrombosis is mainly in the veins of the upper extremities，especially the central venous catheters.The mechanism by which ASP causes thrombosis is by lowering AT-III levels and activating platelets and endothelial cells. Age，central venous catheter，hormones and genetic factors are all high risk factors for thrombosis.Prophylactic use of AT-III or LWMH reduces the risk of venous thrombosis.The new anticoagulant is a direct inhibitor of thrombin or Xa factor.Its anticoagulant effect does not depend on the level of AT- III.Thus，it is speculated that the new anticoagulant is more effective and more convenient for clinical application than the traditional anticoagulant in preventing the formation of asparaginase related thrombus.Key words：Asparaginase；Venous thrombosis；Acute lymphoblastic leukemia左旋門冬酰胺酶（L-ASP）在联合系统化疗中的应用，使儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）成为可治愈的恶性肿瘤性疾病[1]。
03注射用门冬酰胺酶(3)
实验方法：双向电泳法是等电聚焦和SDS-PAGE的组合，即先
进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE
（按照蛋白质分子量大小分离），经染色得到的电泳图是个二
维分布的蛋白质图。
杂蛋白的蛋白质组学研究
常州千红 北京双鹭
等电聚焦电泳凝胶图
结果：以上三种电泳方法结果均提示常州千红杂蛋白种类较少，北京双鹭药业生
64.39 425.2221
%
28.84 824.4131 31.33 744.4053
61.74 1587.0054
62.16 1452.2441
0.84 122.0795 30.19 715.0424 25.49 813.6521 26.73 680.8302
35.81 962.2356 31.96 1113.2075 35.33 36.59 962.4792 622.3429 34.87 840.6744
基本信息
• 处方及工艺
生产企业 常州千红 原辅料名称 甘露醇 甘露醇 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 处方 辅料 辅料 辅料 辅料 加入的目的 赋形剂 赋形剂 pH值缓冲剂 pH值缓冲剂
北京双鹭
常州千红 关键工艺
原料药生产工艺路线
菌种发酵收集 破碎粗提
DEAE层析 疏水层析 精制浓缩 超滤冻干
制剂生产工艺（两个厂家基本一致）
26.95 566.3262
35.95 783.5020
64.20 597.0862 25.07 622.8218 29.18 547.2847 29.70 507.2858
23.49 648.3783
0 2.00 20140822-001 100
L-门冬酰胺酶(Asp)新纯化工艺项目总结
L-门冬酰胺酶（Asp）新纯化工艺项目总结1项目背景L-门冬酰胺酶(L-asparaginase: Asp)是一种酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，它能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨，是一种重要的抗肿瘤药物，临床适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）的诱导缓解期疗效最好。
目前生产门冬酰胺酶的工艺很多，纯化工艺更是千差万别。
以往的研究一般仅局限于实验室制备或小批量生产，经过复杂的纯化步骤获得纯度及活性符合要求的产品，但收率低，成本高，特别是操作成本占整个纯化成本的很大部分。
如果不考虑产品成本，仅为获得符合要求的产品，上述数种工艺尚还可行，但是从获取生产利润的角度这些工艺就不可行，而且在所有这些工艺中，生产过程的复杂性成为规模化生产的制约因素，如何开发即简洁又具有实际操作性的新生产工艺，实现Asp生产的规模化，获得高纯度、高活性、高收率的目标产品成为我们所要研究的课题。
公司自生产Asp以来，一直采用初期研发阶段的生产工艺，步骤复杂、操作成本高、生产能力受限。
基于此我们从探索方便、简洁、高效的生产工艺入手，主要在纯化过程及精制过程两方面对现有工艺进行改进。
2新工艺介绍新工艺分以下几步：（1）丙酮粉制作：将丙酮、离心后的湿菌体按2：1（v/w）比例混合，搅拌20～30min，离心，过筛，自然晾干得丙酮干粉（2）抽提：将丙酮干粉与抽提buffer按1：20（w/v）比例混合，37℃，搅拌1～1.5hr，得抽提液（3）纯化：抽提液加适量1M MnCl2溶液(1.5ml/g powder)，沉淀菌体碎片及核酸，离心取上清；以1M Tris buffer调上清pH值至8.0，沉淀析出，离心取上清；加入0.5倍体积的乙醇，搅匀静置过夜，沉淀杂蛋白，离心得上清；再加入0.5～0.75倍体积的乙醇，静置沉淀6～8 hr，离心得沉淀。
中国药科大学生物制药工艺实验指导参考模板
第二部分生物药物制备实验第一节氨基酸及其衍生物类药物实验二十二固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸注：此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸，丙氨酸（国家攻关课题）的成果【实验目的】1．学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。
2．了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。
3．掌握固定化细胞的技术。
【实验原理】固定化细胞（Immobilized cell）技术，就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞，定位于限定的空间领域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。
固定化细胞的制备方法主要有以下几种：吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法；交联可以是细胞通过离子相互作用或共价连接到一个表面，也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接；吸附法是细胞通过静电相互作用（范德华力、离子键和氢键）吸附到支持物表面，此法简单价廉，但经常发现有细胞泄露；絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法；包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术，它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中，减少了细胞泄露，因此具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。
L-天冬氨酸（L-Aspartic acid）是天然存在的重要氨基酸，在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用。
L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用，是钾、镁的有效补充剂，适用于各种心脏病。
在食品方面，L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味，L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯（其甜度为蔗糖的150倍），是一种新型甜味剂。
在化工方面，L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料，其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。
工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。
随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展，人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。
重组门冬酰胺酶 设计性实验
目的
原理
方法
应用
原理
• • 1、提取 • 2、纯化 • • ①. 蔗糖溶液提取法： 离子交换层析： • • ②. 冷丙酮干燥破壁 • 亲和层析 • 法： • ③. 反复冻融法： • ④. 超声破壁法： 3．L-ASP的修饰：
聚乙二醇(PEG)修 饰的L-ASP： 单甲氧基聚乙二醇 (mPEG2)修饰的LASP：
目的原理ຫໍສະໝຸດ 方法应用• •
• •
• •
3．L-ASP的修饰： L-ASP来源于大肠杆菌，有较强的免疫原性，易在人体中产生针对L-ASP 的抗体，引发临床上常见的进行性免疫反应和全身性过敏反应等副作用。 另外，L-ASP制剂的抗肿瘤活性与其在体内的半衰期有关，天然的L-ASP 在体内易被蛋白酶水解，半衰期短，治疗效果差[10]。 3.1. 聚乙二醇(PEG)修饰的L-ASP： 利用PEG与L-ASP连接，从而改变这个酶的理化特性和生物学特性，进而 减少它的过敏反应。Soares[11]等利用中等分子量的PEG对大肠杆菌的L天冬酞胺酶进行修饰。研究结果表明，PEG-酶在PH3 .5 至pH 12.5的广 泛范围内保持稳定，而且在酸性介质中的稳定性大大增加，在pH3.5时维 持稳定1h。 PEG-酶在生理溶液中，65°1 h后，仍有32%的活性。体外 试验中，PEG-酶在人血清中，在40 mm内保持活性不变。同时冻干法处 理PEG-酶，不影响酶的催化活性。因此PEG对L-天冬酞胺酶的修饰，改 善了酶的理化特性和生物学特性，从而导致L-天冬酰胺酶的治疗特性的显 著改善。 3.2. 单甲氧基聚乙二醇(mPEG2)修饰的L-ASP： 国内的史凌洋[12]等使用活化的mPEG2对大肠杆菌的L-ASP进行修饰， 修饰过程中加人底物L-天冬酰胺保护酶的活性中心。得到的mPEG2-酶的 抗体结合能力消失，保留酶比活力32.8% ，酶的常温稳定性和热稳定性 均有显著提高。
重组门冬酰胺酶制备表达纯化
重组质粒PKK233-ansB 的构建
• PcR 扩增后的DNA片段及质粒pKK 233 -2 同 时分别用限制酶Ncol 和Hindl 消化并用琼脂搪 凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的 DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶 电泳回收后转化HB 1 01 、71 / 15 、ATCc 9637 、JM107 、cPU 210009 ，筛选获得相 应的阳性转化子。
• L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析） 取适量样品加入1%NH4HCO3溶解至1.0 mg/ml，按 1∶30(W/W)加入胰蛋白酶，37±0.5℃保温16 h，50%冰醋酸 终止反应备用。色谱条件 流动相：A为0.1%TFA 水，B为 0.1%TFA，乙腈∶水(80∶20)。梯度：0～60 min，B：0～ 30%；60～120 min，B：30%～38%；120～175，B：38%～ 80%。流速：0.2 ml/min；上样量：自动进样50 μl；检测波长： 210 nm。 • 酶活力的测定 取0．04mol/L L-天门冬酰胺1 ml , 0 . 1 mol/ L pH8.4硼酸一硼 酸钠缓冲液lml，取酶液0 .2ml于试管中，于37C水浴保温10min， 加15﹪三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心，取上清液 1ml,奈氏试剂2 ml和蒸馏水7 ml，放置15 min后于500nm波长比 色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L一天门冬酰胺水 解释放1umol氨所需的酶量定义为一个酶活力单位U。 • 1.3.7酶分子量测定 SDS-PAGE
酶类药物 --重组门冬酰胺酶Ⅱ表
达和制备
酶的分类
单纯蛋白质（多种氨基酸组成） 酶 结合蛋白质 酶蛋白（蛋白部分） 金属：如Cu2 ＋、Mn2＋ 金属有机物：如铁朴啉 辅酶或辅基 （非蛋白部分） 不含金属的有机物 如：烟酰胺、VB2等的衍生物 胞外酶 酶 胞内酶 游离酶 结合酶
门冬酰胺酶
【成份】本品主要成份为门冬酰胺酶，来源于大肠杆菌中提取制备的具有酰胺基水解作用的酶。
辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
【性状】本品为白色冻干块状物或粉末。
【适应症】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【规格】（1）5000单位（2）10000单位【用法用量】根据不同病种，不同的治疗方案，本品的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位／m2，或1000单位／m2，最高可达2000单位／m2；以10～20日为一疗程。
【不良反应】成人较儿童多见。
1、较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至死亡。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。
过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGPT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。
其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
实验一 重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建
实验一重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建【实验目的】1. 了解构建重组质粒的原理2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切、连接等基本技术方法【实验原理】门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。
L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。
肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。
而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。
人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。
故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。
目前临床上使用的L-ASP 泛指来源于大肠杆菌的E.coli L-ASP II。
目前，临床上使用的门冬酰胺酶主要来自于大肠杆菌。
从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pKA/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。
随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。
L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. coli L-ASP开辟了新的道路。
聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
纯化l-门冬酰胺酶的方法
纯化l-门冬酰胺酶的方法L-门冬酰胺酶是一种重要的酶类，在药物合成、特殊化学品的生产中有着广泛的应用。
为了获得高纯度的L-门冬酰胺酶，需要进行有效的纯化和富集操作。
以下是一种基于悬浮液分级离心技术的L-门冬酰胺酶纯化方法，具体步骤如下：1. 制备细胞悬浮液在培养中积累的L-门冬酰胺酶的菌体经过收获、离心、冻干、机械破碎等处理后，制备得到含有L-门冬酰胺酶的细胞悬浮液。
2. 预处理悬浮液将制备好的悬浮液进行预处理，去除杂质和胶体成分，以便后续的分级离心操作。
本实验中，使用超声波破碎仪进行预处理，操作条件为：频率为20KHz，功率为100W，处理时间为15min。
3. 分级离心操作将预处理好的悬浮液经过分级离心操作，以得到L-门冬酰胺酶的纯化物。
本实验中，使用的是高速离心机，操作条件为：预离心速度为3000r/min，离心时间为20min；第一次分级离心时转速为10000r/min，制备好的上清液作为下一个离心泵进的样品；第二次分级离心时转速为15000r/min，得到的上清液即为L-门冬酰胺酶的纯化物。
4. 对纯化物进行分子筛分析采用SDS-PAGE对得到的纯化物进行分子筛分析，确定得到的L-门冬酰胺酶的纯度和分子量。
在本实验中，采用了贪婪蓝染色法对蛋白质进行染色，并进行标准电泳分析。
5. 对纯化物进行酶活测定采用酶活测定法对得到的L-门冬酰胺酶的酶活力进行检测，以确定纯化效果和L-门冬酰胺酶的活性。
采用乙酰化胆碱酯酶偶联酶颜色法进行测定，具体条件为：反应液体积为2mL，反应温度为25℃，反应时间为5min。
经过以上步骤的纯化方法可以获得高纯度、高纯性的L-门冬酰胺酶纯化物，为其在工业生产中的应用提供了保障。
实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析
实验三十重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析注：此实验来自项目重组E.coli L-门冬酰胺酶制备研究（科技部）的成果【目的要求】1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。
2．掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，EC3.5.1.1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。
L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。
由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。
因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。
用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。
大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。
只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。
美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。
我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。
国内目前用药全靠进口。
1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。
表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。
门冬酰胺片的实验报告
1. 学习门冬酰胺片的制备方法。
2. 了解门冬酰胺片的理化性质。
3. 掌握实验操作技能，提高实验水平。
二、实验原理门冬酰胺是一种天然存在于植物、动物和微生物中的氨基酸，具有良好的生物活性。
门冬酰胺片是一种药用辅料，主要用于制备片剂。
本实验采用化学合成法制备门冬酰胺片，通过对合成产物的物理、化学性质进行分析，探讨其应用前景。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 门冬酰胺：分析纯- 碳酸氢钠：分析纯- 乙醇：分析纯- 氯化钠：分析纯- 水为去离子水2. 实验仪器：- 电子天平- 烧杯- 滴定管- 烧瓶- 恒温水浴锅- 真空干燥箱- 显微镜- 紫外可见分光光度计1. 制备门冬酰胺片（1）称取适量门冬酰胺，加入适量去离子水溶解；（2）将溶液转移至烧杯中，加入适量的碳酸氢钠，调节pH值至8.0；（3）将烧杯置于恒温水浴锅中，加热至80℃，保持30分钟；（4）停止加热，待溶液冷却至室温；（5）将溶液转移至烧瓶中，加入适量的氯化钠，搅拌溶解；（6）将烧瓶置于真空干燥箱中，真空干燥至恒重；（7）取出干燥后的固体，进行粉碎、过筛，得到门冬酰胺片。
2. 性质研究（1）外观观察：观察门冬酰胺片的外观，记录其颜色、形状、大小等。
（2）熔点测定：使用熔点测定仪测定门冬酰胺片的熔点。
（3）溶解度测定：将门冬酰胺片加入一定量的去离子水中，搅拌溶解，记录其溶解度。
（4）含量测定：使用紫外可见分光光度计测定门冬酰胺片中的门冬酰胺含量。
五、实验结果与分析1. 外观观察：门冬酰胺片为白色粉末，呈片状，无杂质。
2. 熔点测定：门冬酰胺片的熔点为246.5℃。
3. 溶解度测定：门冬酰胺片在25℃时的溶解度为10g/100ml。
4. 含量测定：门冬酰胺片中的门冬酰胺含量为98.5%。
六、实验结论本实验成功制备了门冬酰胺片，其外观、熔点、溶解度和含量均符合要求。
门冬酰胺片具有良好的物理、化学性质，具有广泛的应用前景。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意保持操作环境的清洁，防止污染。
重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备
重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备摘要：L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。
采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶Ⅱ。
关键字：L-门冬酰胺酶Ⅱ;制备；分离;纯化；稳定剂1.L-天冬酰胺酶治疗ALL的作用机制L-天冬酰胺酶(E.C，3.5.1.1)是酰胺基水解酶，是1个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的酶类药物。
L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的ALL病人中，其肿瘤细胞依赖外源性的L-天冬酰胺才能生存，而正常细胞自身能合成L-天冬酰胺。
L-天冬酰胺酶抗白血病的作用机制是它能够快速消耗血循环中的L-天冬酰胺，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞，此即L天冬酰胺酶的选择性细胞毒作用。
[1]2.L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺2.1酶的几种提取方法L-天冬酰胺酶最初是从豚鼠的血清中提取的，含量很低，后来开发发酵法生产，采用大肠杆菌;欧文菌以及粘质赛氏杆菌( serraliamarcescem)等产生菌制备。
大肠杆菌产生的L-天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶I和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶I没有抗癌活性，存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中。
大肠杆菌来源的天冬酰胺酶的提取方法常用有冷丙酮干燥破壁、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法等.2.1.1蔗糖溶液提取法向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40%，溶菌酶200mg/L，EoTA10mmol/L，pH7·5)，在30C振荡2小时，8000r/min离心30分钟，收集上清酶液。
2.1.2冷丙酮干燥破壁法将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15分钟，5000r/min离心20分钟收集沉淀，于室温风干、研碎。
向菌体干粉中加入10倍体积0.0lmol/L，pH8.0硼酸缓冲液.于室温下搅拌30分钟，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。
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• 3.1. 聚乙二醇(PEG)修饰的L-ASP：
• 利用PEG与L-ASP连接，从而改变这个酶的理化特性和生物学特性，进而 减少它的过敏反应。Soares[11]等利用中等分子量的PEG对大肠杆菌的L天冬酞胺酶进行修饰。研究结果表明，PEG-酶在PH3 .5 至pH 12.5的广 泛范围内保持稳定，而且在酸性介质中的稳定性大大增加，在pH3.5时维 持稳定1h。 PEG-酶在生理溶液中，65°1 h后，仍有32%的活性。体外 试验中，PEG-酶在人血清中，在40 mm内保持活性不变。同时冻干法处 理PEG-酶，不影响酶的催化活性。因此PEG对L-天冬酞胺酶的修饰，改 善了酶的理化特性和生物学特性，从而导致L-天冬酰胺酶的治疗特性的显 著改善。
目的
原理
方法
应用
• 选择法1较为合适，提取收率最高。无抗癌活性的天门冬酰胺酶I存在于细胞质
中，而有抗癌活性的天门冬酰胺酶II则分泌到细胞周质中。用蔗糖溶液抽提细胞，主要 是提取位于细胞周质中酶。提取结束时，多数细胞并未发
• 生破裂，因此，提取液粘稠度不大，可以用8000r/min离心除去细胞。酶回收率与提取 时间关系见下表：
[11]. SoaresAL,Guimaraes G M, Polakiewicz B,et al. Effect of polyethylene
glycol at tachment on physicochemical and biological stability of E.coli L – asparaginase [J]. l ot J pharmaceutics.2 002,237:163一170. [12]. 史凌洋、魏东芝，用活化的单甲氧基聚乙二醇修饰L-天冬酰胺酶[J]. 华东理 工大学学报，2001,27(12);601-604
目的
原理
方法
应用
三，实验方法
工程菌的制备和培养 酶得提取和纯化
L-ASP的活力测定
SDS-PAGE相对分子量测定
目的
原理
方法
应用
L-ASP药用价值
L-天冬酰胺酶(L-ASP)是一个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白 血病(ALL)治疗的酶类药物。白血病细胞与正常细胞的代谢不 同，前者必须摄取细胞外的门冬酞胺作为合成自体繁殖所需 的蛋白质原料。
重组门冬酰胺酶Ⅱ
• 表达 • 提纯 • 制备 • 测定
2011.12.9
实验目的 实验原理 实验方法
实验结果分析与讨论
重组门冬酰胺酶Ⅱ应用
原理
材料
方法
应用
掌握
大肠杆菌发酵 培养及重组蛋 白的表达方法
掌握
重组门冬酰胺 酶Ⅱ的制备和 提纯
酶活力和蛋白 含量测定
纯度分析，计 算收率
目的
原理
方法
应用
了解
作用另外机，理L-A在S于P 它对能单够细降胞低白体血内病L、-天淋冬巴酰肉胺瘤、、L白-谷血氨病酰性胺网及状甘内氨皮酸组的织浓增度多。症
这三以种及氨慢基性酸髓是细合胞成白嘌血呤病和也嘧有啶一环定的的重疗要效组，成对部胰分腺，癌癌细细胞胞的对增这多些还氨有基一酸定的的 消耗抑率制大作于用其，本是身临的床合治成疗能白力血，病因的此重需要要药通物过[2血]。液循环获得外援的氨基酸， 当白L-血天病冬患酰者胺接酶受与门其冬它酸抗胺癌酶药后物，无体交液叉中耐（药白性血，病也细可胞联外合）使的用门。冬白酞血胺病被患分者对 解，其白它血抗病癌细药胞物得有不耐到药门作冬用酞或胺复，发因时而，不用能本继品续也繁能殖诱或导存缓活解[1。]。
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Vol.23.No.6 [10冬酰胺酶的聚乙二醇化 学修饰及修饰后酶的稳定性研究. Chinese Joumal 0f Biochemical Phannaceutics 2004年第25卷第3期
重组门冬酰胺 酶Ⅱ的应用
原理
1.Ansb的高效表达： 用一对与大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因（AnsB）两侧序列 互补的寡核苷酸E1、E2, 作引物, 以大肠杆菌野生株CPU 210009的染色体为模板, 通过PCR扩增得到约1.2kb的DNA 片段, 将此片段插入Pkk233-2的tac启动子下游, 转化不同的 大肠杆菌宿主菌株, 结果表明以CPU 210009为宿主菌时, 转化子的酶表达量最高, 重组L-天门冬酰胺酶占菌体总蛋白 48.3%, 发酵液酶活力达400IU/ml,比活为48IU/mg蛋白。 SDS-PAGE 显示纯化后的重组L-天门冬酰胺酶分子量与天 然酶相同, 均为140KD.
方法
应用
大肠杆菌L-天门冬酰胺酶的提取，纯化和修饰
• 1、提取 • ①. 蔗糖溶液提取法： • 向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖40％，溶菌酶
200mg/L，EDTA10mmol/L，pH7.5），在30°振荡2小时， 8000r/min离心30分钟, 收集上清酶液。 • ②. 冷丙酮干燥破壁法： • 将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15min， 5000r/min离心20min，收集沉淀，于室温下风干，研碎。向菌体干粉 中入10倍体积0.01mol/L,pH8.0的硼酸缓冲液，于室温下搅拌30min， 加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。 • ③. 反复冻融法： • 将菌体在-30°和室温两种温度反复冻融9次，用30mmol/L磷酸缓 冲液（pH7.5）浸提30min，8000r/min离心回收上清酶液 • ④. 超声破壁法： • 1克湿菌体悬浮液在40毫升10mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液中，超声 处理（输出300W，超声10秒，间隔30秒）10min。处理过程用冰浴 降温。用氯化锰沉淀核酸，4000r/min离心20min回收上清液。
Chinese Journal of Pharmaceuticals 2000,31(2)
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蔗糖溶液提取时间与酶回收率的关系
回收率(％) 100
90
80
70
60
50
40
60
80
100
120 时间(min)
目的
原理
方法
应用
• 2、纯化
• 1. 离子交换层析：①将CM - 52 凝胶装柱，酶液(用上述的蔗糖溶液提 取液)以300ml/h上柱，穿出液测活以确保上样完全； ②以pH7.0 磷酸 盐缓冲液洗涤凝胶,去除杂质，保持流速300ml/h； ③洗至柱床体积 4～5 倍时，用紫外检测仪观察杂峰出现； ④杂峰出现后，收集并取 样测活力，更换pH9.0 硼酸盐缓冲液洗脱； ⑤洗脱峰出现后收集酶液， 记录体积并测活力，重复三次实验，收率见下表：
目的
原理
方法
应用
原理
• 1、提取
• 2、纯化
• 3．L-ASP的修饰：
•
①. 蔗糖溶液提取法：•
离子交换层析：•
聚乙二醇(PEG)修 饰的L-ASP：
• ②. 冷丙酮干燥破壁 • 亲和层析 法：
• 单甲氧基聚乙二醇 (mPEG2)修饰的LASP：
• ③. 反复冻融法：
• ④. 超声破壁法：
目的
原理
目的
原理
方法
应用
• 3．L-ASP的修饰：
• L-ASP来源于大肠杆菌，有较强的免疫原性，易在人体中产生针对L-ASP 的抗体，引发临床上常见的进行性免疫反应和全身性过敏反应等副作用。 另外，L-ASP制剂的抗肿瘤活性与其在体内的半衰期有关，天然的L-ASP 在体内易被蛋白酶水解，半衰期短，治疗效果差[10]。
目的
原理
方法
应用
• 2. 亲和层析：①亲和介质装柱，以pH7.5磷酸盐缓冲液平衡柱子； ②将离子交换层析洗脱下来的酶液上样吸附, 流速不宜过快，以 免吸附不牢被洗脱下来；③上样完毕，测穿出液活力，确保吸附 完全，用pH7.5磷酸盐缓冲液洗涤杂蛋白；④杂蛋白峰出现后， 检测其活力，确保产物无流失；⑤以pH9.0甘氨酸缓冲液洗脱， 收集并记录体积，取样测活，重复三次实验，收率见下表：
应用
原理
3.SDS-PAGE测定相对分子量
目的
原理
方法
应用
原理
4.ASP的活力测定（选择方式） 原理：L-ASP能专一性的催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和 氨。 取1毫升0.04M的L-天冬酰胺，1毫升0.1M pH8.4的硼酸-硼酸钠缓 冲液，0.2毫升细胞悬浮液或酶液，与37°水浴保温10min，加 0.5毫升15％三氯乙酸终止反应并沉淀细胞；取经4000r/min离心 后的上清液1毫升，加奈氏试剂2毫升和蒸馏水7毫升，放置15min 后于500nm波长比色测定生成的氨。