第十章胚胎干细胞的培养
胚胎干细胞的培养
胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。
全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。
胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。
胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。
由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。
例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。
从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。
由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。
目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。
一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。
胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。
目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。
有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。
胚胎干细胞的培养和调控
胚胎干细胞的培养和调控胚胎干细胞是一种具有极高生物学价值的细胞。
它的特点是可以无限制地自我复制，并能够分化成人体内的各种细胞类型，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。
这使得胚胎干细胞成为了治疗许多疾病的有力工具，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、白血病等。
为了能够将胚胎干细胞应用于实际医疗中，必须先要掌握胚胎干细胞的培养和调控方法。
第一部分培养胚胎干细胞胚胎干细胞的培养需要一定的条件，其中最重要的是营养基质和生长因子。
营养基质是指提供细胞培养所需营养物质的培养基，生长因子则是刺激细胞增殖、分化和细胞功能发挥的非细胞因子分子。
经过多年的研究，科学家们已经掌握了许多优化的胚胎干细胞培养方法，不断改进和创新。
胚胎干细胞的培养主要分为两种方式：一种是使用人类免疫缺陷病毒（HIV）携带的重编程因子，使成人普通细胞重新向胚胎干细胞转化，这种方法的优点在于可以避免使用和浪费胚胎，并且可以根据患者自身的细胞进行个性化治疗；另一种是从人类胚胎中提取胚胎干细胞，这种方法的优点在于可以获得自体造血干细胞以及每一个器官的种子细胞，但在实际应用中受到较多的道德和法律争议。
无论哪种方式，胚胎干细胞的培养本质相同，主要包括以下几个步骤：1. 种植选取营养基质，并将干细胞种植在营养基质中。
营养基质需要包含必需氨基酸、维生素和其他生命所需营养元素。
2. 培养维持培养基的稳定状态，将培养器置于恒温室内，控制培养环境的温度、湿度和CO2浓度等。
3. 复制控制胚胎干细胞的倍数，使其以匀速增长的状态进行培养。
此过程中，应将胚胎干细胞分离至新的培养基中，以保证细胞的数量和干细胞的稳定性。
4. 检测定期检测胚胎干细胞的状态，包括细胞分裂速率、分化程度和遗传特征等，以确保其基态的维持和无突变状态的可能。
第二部分调控胚胎干细胞胚胎干细胞的应用广泛，不仅包含了生物学研究的范畴，还拥有丰富的临床应用前景。
在这个方向上，胚胎干细胞的调控成为了必不可少的一环。
胚胎干细胞的培养与应用
胚胎干细胞的培养与应用随着科学技术的不断进步，胚胎干细胞已经成为了当今医学研究的热门话题。
那么，什么是胚胎干细胞呢？胚胎干细胞是从受精卵发育而来的一类全能分化干细胞，具有极高的发展潜能和可塑性，能够不断分化为各种不同类型的细胞。
在医学上，胚胎干细胞被广泛应用于组织修复、疾病治疗等方面。
一、胚胎干细胞的培养1. 胚胎干细胞的提取胚胎干细胞的来源主要是人类受精卵和早期胚胎组织。
实际上，胚胎干细胞的提取违反了一些伦理原则，因为需要拆卸一个活生生的胚胎。
因此，在国际上，提取胚胎干细胞的过程和规范都有非常严格的要求。
2. 胚胎干细胞的培养和分化提取到的胚胎干细胞需要进行培养，以维持其生长和发育。
目前，利用培养基、小鼠胚胎等条件进行体外培养的方法比较常见。
培养基中含有不同浓度的各种细胞因子，可以促进胚胎干细胞不断分化为不同类型的细胞。
目前，科学家们已经成功培育出一些实验用的胚胎干细胞系，并利用这些细胞系进行了一些基础研究和实验。
二、胚胎干细胞的应用1. 组织修复胚胎干细胞具有不同类型的分化潜能，能够分化为各种类型的细胞，如心肌细胞、神经细胞、肝细胞等。
这些细胞可以重新修复和再生人体各种组织和器官，包括心脏、脑部、肝脏等。
因此，利用胚胎干细胞实现组织修复已成为医学领域的重要研究方向。
2. 疾病治疗利用胚胎干细胞进行疾病治疗是另一个重要的应用领域。
某些细胞如神经细胞等无法自我修复，其损伤导致的疾病无法治愈。
此时，胚胎干细胞通过分化成相应类型的细胞，能够重新修复并替代受损细胞，从而实现治疗。
例如，利用胚胎干细胞治疗糖尿病、帕金森病等疾病的研究已经有了一些初步进展。
三、胚胎干细胞研究面临的挑战和展望1. 伦理问题胚胎的提取和胚胎干细胞的研究一直是一个伦理和道德问题争议的焦点。
因此，正确认识和解决这些问题，将有助于推动胚胎干细胞研究的发展。
2. 法律法规目前，国际上对胚胎干细胞培育和应用的法律法规比较不一致，这也给胚胎干细胞研究和应用带来了一定的不确定性和局限性。
胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养.胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES 细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
胚胎干细胞的培养体系综述
胚胎干细胞的培养体系综述摘要：综述胚胎干细胞培养基、有饲养层培养体系和无饲养层培养体系的主要成分，以及无血清胚胎干细胞培养基。
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞。
）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。
而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。
关键词：胚胎干细胞培养体系培养基1、培养基的主要组成ES细胞培养液的组成是在基础培养基上添加血清、IIF、巯基乙醇，L一谷氨酰胺等成分，并使用饲养层细胞或条件培养基(CM)。
常用的基础培养基为含高糖(4500mg／L)和谷氨酰胺的DMEM。
由于ES细胞来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，维持其生长代谢所需的营养要充足。
高糖的DMEM可以提高ES细胞的增殖速度，同时又能提供饲养层细胞生长所需的能量。
ES细胞对谷氨酰胺要求较高，它是细胞合成蛋白质与核酸所必需的，由于谷氨酰胺在溶液中易分解，所以使用前须重新加入。
』3一巯基乙醇除了对胚胎细胞的分裂增殖有促进作用外，还可还原血清中的含硫化合物，防止过氧化物对ES细胞的损害。
添加的血清为胎牛血清(FCS)和小牛血清。
血清含有丰富的营养成分，在促进ES细胞增殖方面起到很好的作用，并对ES 细胞的贴壁生长、集落形态有重大影响。
此外它可能含有一些未知的促ES细胞分化的因子，也可能含有微量的血红蛋白和内毒素，会干扰ES细胞的生长。
但高浓度的血清并不利于ES 细胞生长。
不同批次的血清对促进ES细胞生长具有不同的效果。
每个ES细胞系依赖于建系时所用的血清批次，若更换血清，则应以该细胞系为供试细胞，在含有待测血清的培养基上进行传代培(8～10代)和克隆测试，测试合格的血清只适用于该细胞系，若用于其它ES细胞系,则仍可能出现不同的效果。
胚胎干细胞培养与应用
第四步：合子形成。雌雄原核融合形成合子(受精卵)。
第29页，此课件共56页哦
小飞守角制作
4．动物排出卵子的成熟程度不同，有的可能是 次级卵母细胞，如猪、羊等；有的可能是初级卵 母细胞，如马、犬等，但它们都要在输卵管内进 一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具 有与精子受精的能力。
分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。
第11页，此课件共56页哦
小飞守角制作
3、来源：早期胚胎囊胚的内细胞团
第12页，此课件共56页哦
小飞守角制作
内细胞团：
内细胞团（未分化的细胞）具有很强的分化能力，可 以进一步分裂、分化，形成组织和器官，再逐步发育成个 体。
这些细胞被认为具有全能性，称为胚胎干细胞。
答案 培养液成分
盐类：无机盐和有机盐 营养物质：氨基酸、核苷酸 调节物质：维生素、激素 特有物质：动物血清
第32页，此课件共56页哦
小飞守角制作
三、胚胎移植
1、胚胎移植成功与否的两个重要条件 （1）同种动物之间进行胚胎移植易于成功。这里的“同种”是指“
同物种”。 （2）供、受体生理状态要相同，为此必须做到：
第三，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排 斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。 第四，供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联 系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程 中不受任何影响。
5．胚胎早期培养过程中有两次用到了显微镜进行检 查：
①在进行卵母细胞成熟培养前，要抽取卵母细胞第30页，此课件共56页哦
小飞守角制作
（1）受精的标志和受精完成的标志分别是什么？
受精的标志是卵黄膜和透明带的间隙出现两个极体； 受精完成标志是雌雄原核融合为合子。
胚胎干细胞的培养原理和方法
胚胎干细胞的培养原理和方法胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）的培养是一个复杂且精细的过程，涉及到多个步骤和原则。
以下是胚胎干细胞培养的基本原理和方法：一、培养原理1.多能性维持：胚胎干细胞具有高度的多能性，即它们有能力分化成体内任何类型的细胞。
培养过程中的一个关键点是维持这种多能性，防止细胞分化。
2.培养环境： ESCs需要特定的培养环境，包括合适的温度、pH值、湿度和气体组成（如CO₂水平）。
3.营养和生长因子：培养基需要包含必要的营养物质和生长因子，以支持细胞的生长和多能性维持。
这些生长因子通常包括利钠、胰岛素以及特定的细胞因子。
二、培养方法1.获取胚胎干细胞：通常从早期胚胎（如囊胚）的内细胞团中分离得到。
2.培养基准备：培养基通常包含高葡萄糖DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium）、胎牛血清（FBS）或者定义的血清替代物、L谷氨酸、非必需氨基酸、抗生素等。
3.生长因子添加：例如添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来维持多能性。
4.共培养系统：有时使用“给养层”（Feeder Layer）的方法，即在胚胎干细胞下方培养一层辐射灭活的成纤维细胞，以提供必要的支持和营养。
5.无给养层培养：也可使用定义清晰的培养基，不依赖给养层，减少异种蛋白的污染。
6.培养条件控制：保持恒温（通常为37°C）和特定的CO₂水平（通常为5%）。
7.细胞传代：由于ESC会不断增长，需要定期进行传代，避免过度生长和分化。
8.观察和评估：定期检查细胞形态和生长情况，评估是否保持了未分化状态。
三、注意事项1.避免分化：细胞培养过程中要特别注意防止胚胎干细胞的非计划性分化。
2.遗传稳定性：长期培养可能会导致遗传改变，因此要定期检查细胞的染色体和遗传稳定性。
3.伦理问题：胚胎干细胞的研究和应用常伴随着伦理争议，特别是关于胚胎的使用。
这些方法和原则是胚胎干细胞培养的基本框架，但实际操作中可能会根据研究目的和具体条件有所调整。
胚胎干细胞的培养及其影响因素
胚胎干细胞的培养及其影响因素前言胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。
1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。
由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。
体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。
胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。
本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。
研究内容与方法1. 材料1.1 实验动物昆明白小鼠。
1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C（Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素。
[2]2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5]2.1 胚胎的获取昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。
次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。
胚胎干细胞培养操作规程
胚胎干细胞培养操作规程胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有无限的增殖能力和多能性分化潜能，对于组织再生和疾病治疗具有重要的应用价值。
为了进行胚胎干细胞的培养和扩增，下面给出一份胚胎干细胞培养操作规程。
1. 实验前准备：a. 清洗培养器具：用无菌水洗净培养皿、玻璃器皿和刷子。
b. 预热培养液：根据实验需要预热胚胎干细胞培养基和所需的其他培养液，以确保适宜的温度。
2. 细胞除菌：a. 必要时，用无菌棉签将细胞悬液接种到新的培养皿中。
b. 将枪头含有70％乙醇的吸管对准培养皿，喷洒乙醇并晾干。
c. 将培养皿放置在超净工作台内，进行进一步的消毒和清洁操作。
3. 细胞接种：a. 取出细胞悬液，并与培养基按照比例混合。
b. 将胚胎干细胞悬液均匀地接种到预先涂覆有明胶或者植物凝胶的培养皿上。
c. 确保培养皿中的细胞接种均匀且不过于密集，以便细胞能够自由生长。
4. 细胞培养：a. 将被接种的培养皿置于培养箱中，在37℃和5% CO2的条件下培养。
b. 每天检查和观察细胞的状态和生长情况，观察细胞的形态和数量。
c. 根据需要，定期更换新鲜的培养基。
5. 细胞分离：a. 当细胞达到足够密度时，可使用胰蛋白酶等酶来进行细胞的分离。
b. 向培养皿中加入足够的酶液，并将其均匀地涂抹在细胞上。
c. 在温度适宜的条件下，观察细胞的分离情况，并在适当的时间停止酶的作用。
6. 细胞传代：a. 轻轻将细胞悬液转移到新的培养皿中，避免细胞团的形成。
b. 加入新的培养基，使细胞能够继续生长和分化。
c. 定期观察和记录细胞的生长情况，监测细胞的纯度和分化状态。
7. 储存和保存：a. 使用液氮分装装置将细胞悬液分装到液氮管中。
b. 储存液氮管在液氮罐中，确保细胞的存活和完整性。
c. 定期检查和更新细胞的库存记录，确保细胞的有效使用和管理。
通过以上的操作规程，可以进行有效的胚胎干细胞的培养和扩增工作，为进一步的研究和应用奠定基础。
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程主要分为以下几个步骤：
1. 胚胎获取：从受精卵或早期胚胎中获取胚胎干细胞。
这一过程通常在体外受精（IVF）过程中进行，通过收集多余的受精卵或选择性将早期胚胎分离出来。
2. 胚胎培养：将获取的胚胎放置在含有营养物质和适当环境条件的培养皿中，以促进其细胞分裂和生长。
培养基通常包括必需的营养物质、生长因子和激素等。
通过优化培养条件，可以促进胚胎细胞的增殖。
3. 胚胎分离：在细胞分裂的早期阶段，胚胎细胞开始形成不同的细胞群，包括内胚层、外胚层和滋养层。
通过机械或酶法等方法，将这些不同细胞群分离开来。
其中，内胚层细胞具有胚胎干细胞的潜能。
4. 胚胎干细胞扩增：将分离得到的内胚层细胞培养在含有适当营养物质和生长因子的培养基中，促进其进一步增殖。
这个过程可以通过细胞培养技术，如经典的细胞培养方法或新兴的三维培养技术（如胶体微珠培养）来实现。
5. 胚胎干细胞鉴定：通过特定标记和检测方法，确认扩增的细胞群中是否存在胚胎干细胞。
常用的鉴定标志包括OCT4、SOX2和NANOG等胚胎干细胞特异性标记物。
6. 胚胎干细胞应用：胚胎干细胞可用于医学研究，如疾病机制研究、药物筛选和组织工程等领域。
此外，它们还
可以用于再生医学的临床应用，如组织修复和再生等。
需要注意的是，胚胎干细胞的研究和应用涉及伦理和法律等多个方面的问题，在进行相关研究和应用时应遵守相关规定和伦理原则。
人胚胎干细胞培养手册
操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。
冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。
培养条件：温度：37±0.5℃CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100%主要技术：1．细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。
此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。
当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。
工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。
2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。
3．细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。
操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。
所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。
培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2µm的滤膜过滤。
当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。
如有可能，尽量使用相同的试剂。
使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。
生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。
MEF培养液：hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2µm的滤膜过滤,4℃保存。
明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2µm 的滤膜过滤。
明胶包被：接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。
胚胎干细胞培养方法及应用进展
胚胎干细胞培养方法及应用进展20世纪80年代初期,两组科学家几乎同时分别直接从鼠囊胚中分离出胚胎干细胞细胞，从而拉开了胚胎干细胞研究领域的序幕。
1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。
而在近几年，胚胎干细胞的研究也越来越热门，发表在顶级杂志上的研究成果也在逐年增加。
尤其值得一提的是，中国在胚胎干细胞研究领域也取得了不俗的成果。
胚胎干细胞的概念及特性胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是由着床前囊胚期内细胞团(inner cell mass,ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞(primordial gerrn cells,PGCs)建立的、可在体外未分化状态下长期增殖传代的、具有稳定的二倍体核型、具有自我更新和多向分化增殖潜能的全能干细胞,表面特异抗原标记的、可分化为三个胚层来源的各种组织和细胞类型(包括生殖腺和生殖细胞)的永久细胞系。
ESC由Evans和Kaufman 1981年首次从延迟植入小鼠囊胚中分离出来,当时取其名字首字母而称之为EKC,以后均改称为ESC。
ES 细胞主要有以下三个特点：（1）细胞具有胚胎发育的全能性 , 在特定条件下能够向3个胚层的组织和细胞分化, 因此 ,ES细胞是研究哺乳动物胚胎发育、分化与遗传的理想模型,并从根本上揭示生物发育构成中的决定基因;（2）ES细胞具有种系传递的功能,与受者囊胚混合后可形成嵌合体或嵌合动物,结合基因工程技术,可以克隆出大量优质转基因生物;(3)利用ES细胞可进行各种遗传学操作,在基因重组、诱导基因突变、转基因动物等方面的研究具有重要意义。
胚胎干细胞的培养方法自Evans等1981年首先建立了小鼠ES细胞系后，在此之后近20年内，人们相继自早期胚胎建立了猪、牛、兔、绵羊、山羊、水貂、仓鼠、灵长类动物(恒河猴、狨)和人类ES细胞系。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2 STO细胞
来自于SIM小鼠胚胎的硫代鸟嘌呤和乌本
苷有抗性的成纤维细胞系。
二、胚胎细胞的来源
采用超排途径
1 主要材料 动物：雌雄小鼠 激素：PMS、HCG
2 获取胚胎的过程
（1）雌鼠，5IU PMS，48h后 5IU HCG
（2）雌雄合笼，自然交配，次晨查阴道栓为交
配后0.5d（即0.5dpc）。
二、ES细胞体外诱导
• 在特定的培养条件和诱导剂共同作用下， ES
细胞可分化形成各种类型的细胞。
• EG细胞和ES细胞有类似的发育全能性，但用
于细胞诱导分化的成熟资料不多。
Hale Waihona Puke 胞，进一步培养。方法一，免疫手术法：
1 ）取出 10 只左右上述体外培养的胚泡，放在小培养皿 中，用酸性 Tyrode 液（ PH2.5 ）处理 1-2 分钟，去除透 明带。 2）胚泡移入Hanks液的小培养皿中洗涤一次。直接露于 经培养液 1:2000 稀释的兔抗 JCR 小鼠脾脏细胞抗血清 （抗H-2b）。 3）30 分钟后，再移到用培养液 1:6稀释的新鲜豚鼠血清 中,处理30min左右胚泡的滋养层细胞呈泡状，发生免 疫溶解，而ICM细胞不具有H-2b抗原，不发生细胞免 疫溶解，故完整无损。
3）EG细胞纯化和建系
（1）分裂增殖，4-6d后，解剖镜下胰酶消化， 转移继续培养。
（ 2 ）从复上面 2-3 次，可产生巢状干细胞群落。 （3）最后转移进一步扩增，此时可省LIF，SCF， bFCF等生长因子。
（4）EG细胞传代、冻存和复苏：常规胰蛋白酶 消化法传代，无饲养层细胞要加LIF。冻存与 复苏常规方法。
（3）3-4d，分别剖取子宫，冲出子宫内桑椹胚
和 早 期 胚 泡 进 一 步 分 离 培 养 ES 细 胞 。 8.510.5dpc时的胚胎生殖嵴可建立EG细胞系。
（三）ES和EG细胞的培养过程
1 ES细胞培养
基本培养液为含 15-20%FCS ， 0.1mmol/l ， β-巯基乙醇和 50IU/ml 青霉素，50ug/ml 链霉素 的MEM培养液。 接种桑椹胚和胚泡于预先铺有作为饲养 层无有丝分裂活性的单层 MEF细胞的35mm培 养皿中，培养2-3d然后按下列方法分离ICM细
胞（ES细胞）。
近年,多能性胚胎生殖细胞系（EG细胞），被
称为“干细胞之母”。
一、ES细胞和EG细胞培养和建系的 基本技术
（一）饲养层细胞
不论ES细胞或EG细胞，原代或初代培养阶
段一般都须依赖于能分泌它们在体外存活增
殖所必需生长因子的饲养层细胞。保持活性 但不分裂增殖
1 MEF细胞
小鼠胚胎成纤维细胞
2 EG细胞
EG细胞建系基本过程如下：
1）原始生殖细胞分离和原代培养
（1）收集8.5-10.5dpc胚胎，清洗，取生殖嵴组织。 （2）0.02%EDTA液孵育，37℃，15min。 （3）吹散，接种。
2）饲养层细胞：宜用8代以内的小鼠MEF细胞 或STO细胞系。
（1）用前经10ug/ml丝裂霉素C处理2-3h。 （2）接种
第十章 胚胎干细胞的培养
能在体外增殖又具有胚胎细胞全能性或 多能性的，并通过适当条件能被诱导分化为 各种类型分化细胞的实验模型。
20世纪70年代，胚胎性瘤细胞（EC细胞）是
畸胎瘤干细胞，具有恶性生长并显示类似于 胚胎细胞发育的全能或多能的性质。 80年代初，从小鼠早期胚胎的内细胞团或桑 椹胚分离建立了具有发育全能性的胚胎干细
方法二、常规培养：
桑椹胚或胚泡不需要透明带
1) 在铺有饲养层的 MEM 基本培养液中培养 3-4 天， ICM 细 胞团从贴壁胚泡内长出来。
2 ）吸出 ICM 细胞团， 0.25%(w/v) 胰蛋白酶和 0.2mmol/l 混合消化液在37℃消化5分钟。
3)部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的培养板培养4 天,可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团。 4)胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般45 天间隔用胰蛋白酶消化，克隆和纯化 ES 细胞，视 ES 细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。