第十章胚胎干细胞的培养

二、ES细胞体外诱导
• 在特定的培养条件和诱导剂共同作用下， ES
细胞可分化形成各种类型的细胞。
• EG细胞和ES细胞有类似的发育全能性，但用
于细胞诱导分化的成熟资料不多。
（3）3-4d，分别剖取子宫，冲出子宫内桑椹胚
和 早 期 胚 泡 进 一 步 分 离 培 养 ES 细 胞 。 8.510.5dpc时的胚胎生殖嵴可建立EG细胞系。
（三）ES和EG细胞的培养过程
1 ES细胞培养
基本培养液为含 15-20%FCS ， 0.1mmol/l ， β-巯基乙醇和 50IU/ml 青霉素，50ug/ml 链霉素 的MEM培养液。 接种桑椹胚和胚泡于预先铺有作为饲养 层无有丝分裂活性的单层 MEF细胞的35mm培 养皿中，培养2-3d然后按下列方法分离ICM细
方法二、常规培养：
桑椹胚或胚泡不需要透明带
1) 在铺有饲养层的 MEM 基本培养液中培养 3-4 天， ICM 细 胞团从贴壁胚泡内长出来。
2 ）吸出 ICM 细胞团， 0.25%(w/v) 胰蛋白酶和 0.2mmol/l 混合消化液在37℃消化5分钟。
3)部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的培养板培养4 天,可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团。 4)胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般45 天间隔用胰蛋白酶消化，克隆和纯化 ES 细胞，视 ES 细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。
3）EG细胞纯化和建系
（1）分裂增殖，4-6d后，解剖镜下胰酶消化， 转移继续培养。
（ 2 ）从复上面 2-3 次，可产生巢状干细胞群落。 （3）最后转移进一步扩增，此时可省LIF，SCF， bFCF等生长因子。
（4）EG细胞传代、冻存和复苏：常规胰蛋白酶 消化法传代，无饲养层细胞要加LIF。冻存与 复苏常规方法。
第十章 胚胎干细胞的培养
能在体外增殖又具有胚胎细胞全能性或 多能性的，并通过适当条件能被诱导分化为 各种类型分化细胞的实验模型。
20世纪70年代，胚胎性瘤细胞（EC细胞）是
畸胎瘤干细胞，具有恶性生长并显示类似于 胚胎细胞发育的全能或多能的性质。 80年代初，从小鼠早期胚胎的内细胞团或桑 椹胚分离建立了具有发育全能性的胚胎干细
胞，进一步培养。
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方法一，免疫手术法：
1 ）取出 10 只左右上述体外培养的胚泡，放在小培养皿 中，用酸性 Tyrode 液（ PH2.5 ）处理 1-2 分钟，去除透 明带。 2）胚泡移入Hanks液的小培养皿中洗涤一次。直接露于 经培养液 1:2000 稀释的兔抗 JCR 小鼠脾脏细胞抗血清 （抗H-2b）。 3）30 分钟后，再移到用培养液 1:6稀释的新鲜豚鼠血清 中,处理30min左右胚泡的滋养层细胞呈泡状，发生免 疫溶解，而ICM细胞不具有H-2b抗原，不发生细胞免 疫溶解，故完整无损。
2 EG细胞
EG细胞建系基本过程如下：
1）原始生殖细胞分离和原代培养
（1）收集8.5-10.5dpc胚胎，清洗，取生殖嵴组织。 （2）0.02%EDTA液孵育，37℃，15min。 （3）吹散，接种。
2）饲养层细胞：宜用8代以内的小鼠MEF细胞 或STO细胞系。
（1）用前经10ug/ml丝裂霉素C处理2-3h。 （2）接种
2 STO细胞
来自于SIM小鼠胚胎的硫代鸟嘌呤和乌本
苷有抗性的成纤维细胞系。
二、胚胎细胞的来源
采用超排途径
1 主要材料 动物：雌雄小鼠 激素：PMS、HCG
2 获取胚胎的过程
（1）雌鼠，5IU PMS，48h后 5IU HCG
（2）雌雄合笼，自然交配，次晨查阴道栓为交
配后0.5d（即0.5dpc）。
胞（ES细胞）。
近年,多能性胚胎生殖细胞系（EG细胞），被
称为“干细胞之母”。
一、ES细胞和EG细胞培养和建系的 基本技术
（一）饲养层细胞
不论ES细胞或EG细胞，原代或初代培养阶
段一般都须依赖于能分泌它们在体外存活增
殖所必需生长因子的饲养层细胞。保持活性 但不分裂增殖
1 MEF细胞
小鼠胚胎成纤维细胞