Anti-RFP Affinity Beads 4FF
Anti-PE micro beads 操作方法
● MACS Columns and MACS Separators: Cells labeled with Anti-PE MicroBeads can be enriched by using MS, LS, or XS Columns or depleted with the use of LD, CS, or D Columns. Cells which strongly express the PE-labeled antigen can also be depleted using MS, LS, or XS Columns. Positive selection or depletion can also be performed by using the autoMACS or the autoMAC Pro Separator.
BSA蛋白偶联多肽技术
1．1．1多肽合成按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司（Apeptide CO.,Ltd.) HPLC检测纯度为95%。
多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。
1．1．2 合成多肽与载体的偶联载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：4.6mgSPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM。
0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。
HiTrap TM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。
4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜。
1．1．3 抗多肽抗体的制备选体重1. 5～2 kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。
将偶联的BSA-多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。
在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。
耳源静脉采血、分离血清。
1．1．4 多肽抗体的纯化Protein G柱分离纯化IgG抗体：PBSpH7.4平衡Protein G亲和柱，以0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱，PBSpH7.4透析，分装，-20℃保存。
1mM预冷的HCl充分膨胀Sepharose 4FF（GE公司）后，15个体积的1mMHCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗2min。
偶联缓冲液0.1MNaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl平衡2次。
多肽溶于偶联缓冲液，调节pH值到pH8.3后，加入凝胶，室温混旋3h。
加入1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。
50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。
PBS缓冲液平衡10倍体积。
装柱，平衡，上样后以0.1MGly-HCl pH2.2洗脱，PBS透析，分装，-20℃冻存。
Anti-DYKDDDDK Affinity Beads
Anti-DYKDDDDK Affinity Beads目录1. 产品介绍 (1)2. 试剂准备 (1)3. 样品纯化 (2)4．试剂兼容性 (3)5. 问题及解决方案 (4)6. 订购信息及相关产品 (4)1. 产品介绍Flag标签是一个由八个亲水氨基酸组成的多肽片段，定位在融合蛋白表面，因此更易与抗体结合以及被肠激酶分解。
Anti-DYKDDDDK Affinity Beads是以抗Flag(DYKDDDDK)抗体为亲和配体，一步纯化原核、酵母或哺乳动物细胞表达的Flag标签融合蛋白。
Anti-DYKDDDDK Affinity Beads以4%琼脂糖凝胶为基质，杂蛋白非特异性结合少，可用于Flag标签融合蛋白的纯化和免疫沉淀（IP）。
表1. Anti-DYKDDDDK Affinity Beads产品性能指标性能基质4%琼脂糖微球配体Anti-DYKDDDDK鼠单克隆抗体载量>1mg DYKDDDDK标签蛋白/ml 介质粒径(μm)45-165最大流速0.1 MPa, 1 bar储存缓冲液0.02%叠氮化钠，1XPBS储存温度2°C - 8°C2. 试剂准备2.1缓冲液的准备所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
平衡/洗杂液: 50mM Tris，0.15M NaCl，pH7.4洗脱液: 0.1M glycine HCl，pH3.0竞争性洗脱液：50mM Tris，0.15M NaCl, 100-300µg Flag多肽/ml，pH7.4中和液：1M Tris-HCl，pH8.52.2 样品准备上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3. 样品纯化3.1 柱层析1) 将Anti-DYKDDDDK Affinity Beads装入合适的层析柱，层析用5 倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
HA标签融合蛋白纯化试剂盒
HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒Cat#：KAP0063（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）1.背景信息HA-Tag（YPYDVPDYA），常用于真核蛋白质重组表达标记。
HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-HA亲和纯化凝胶（Anti-YPYDVPDYA (HA) Affinity Gel），由高品质的HA兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml 凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于HA标签融合蛋白的亲和纯化。
2.性能指标应用范围：可用于Met修饰的N端HA融合蛋白（Met-HA–Protein），N端HA融合蛋白（HA–Protein），C端HA融合蛋白（Protein-HA）及中部HA融合蛋白的亲和纯化。
载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-HA 兔多克隆抗体，可结合至少1.2mg HA融合蛋白。
强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。
3.试剂盒组成-100（说明见5.3）注意事项（开箱前必读）3.1本试剂盒冷藏条件下运输，如果暂时不用，请将纯化柱（空柱）取出，室温保存；亲和凝胶于-20℃保存；试剂盒及其它成分保存于4℃。
3.2HA peptide溶解方法：该多肽为轻质粉末，开盖前应离心。
建议将40ul 10xPBS溶液加至1mg多肽粉末中，彻底溶解后，加入160ul双蒸水，制成5mg/ml储存液，-20℃保存。
使用时用1xPBS稀释至需要的浓度。
按需求浓度稀释至工作浓度。
3.3有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0的Arginine-HCl做为洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的使用寿命。
Protein At Beads 4FF 预装柱说明书
ProteinAt Beads 4FF 的预装柱说明书货号：YA2471规格：1*1mL /1*5mL /5*1mL /3*1mL+1*5mL /5*5mL保存：2-8℃产品说明：Protein At Beads 4FF 是用于分离和纯化单克隆抗体、多克隆抗体或Fc-融合蛋白的亲和层析介质。
Protein A 是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc 片段结合哺乳动物IgG 。
Protein At Beads 4FF 的配体蛋白Protein At 是在天然蛋白A 的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkaline tolerate ，故缩写为At)。
Protein At Beads 4FF 是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化。
表1：介质性能参数介质高度交联的4%琼脂糖平均粒径～90μm配体耐碱性Protein A结合载量>40mg 人lgG/ml 介质化学稳定性可耐受抗体纯化过程中的所有试剂工作pH 3-12在线清洗0.1-0.5M NaOH 线性流速50-300cm/h 保存20%乙醇纯化流程：1、Buffer 的准备所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。
平衡/洗杂液：0.15M NaCl 、20mM Na 2HPO 4，pH7.0洗脱液：0.1M 甘氨酸，pH 3.0中和液：1M Tris-HCl ，pH 8.5。
2、样品准备上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗杂液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3、样品纯化1.上柱：将泵管道中注满去离子水。
去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。
再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
泛磷酸化抗体使用注意事项
泛磷酸化抗体使用注意事项泛磷酸化抗体是一种广泛应用于生物学研究领域的重要工具，可以用于检测细胞中的泛素化修饰。
在使用泛磷酸化抗体时，有一些注意事项需要遵守，以确保实验结果的准确性和可靠性。
选择适当的抗体是使用泛磷酸化抗体的关键。
在市场上有许多不同的泛磷酸化抗体可供选择，但它们的质量和特异性可能存在差异。
因此，在购买抗体前，我们应该详细了解抗体的来源、验证方法和引用文献等信息，以确保其质量和可靠性。
在实验前，我们需要对样本进行适当的处理。
对于细胞样本，可以使用细胞裂解液或蛋白提取液提取蛋白质。
对于组织样本，可以使用匀浆机或超声波破碎仪破碎组织，并使用细胞裂解液或蛋白提取液提取蛋白质。
在处理样本时，应避免蛋白质的降解和泛磷酸化的丢失。
在进行免疫印迹实验时，我们需要控制实验条件。
首先，我们需要选择合适的实验条件，如蛋白质浓度、抗体浓度和反应时间等，以确保实验结果的准确性和可重复性。
其次，我们应该在实验中包含适当的阴性对照和阳性对照，以验证实验的可靠性和准确性。
在进行免疫组化实验时，我们需要注意选择合适的染色方法和显微镜观察条件。
泛磷酸化抗体可以用于检测细胞的泛磷酸化修饰，因此我们需要选择合适的染色方法来显示泛磷酸化修饰的位置和强度。
在观察样本时，应选择合适的显微镜放大倍数，并进行适当的曝光时间和图像处理，以获得清晰和准确的图像。
我们需要注意实验的数据分析和结果解释。
在进行免疫印迹或免疫组化实验后，我们应该对实验结果进行准确的定量分析，并进行统计学处理。
在结果解释时，应该考虑到可能的干扰因素，并与相关文献进行比较，以确保结果的准确性和可靠性。
在使用泛磷酸化抗体时，我们还需要注意实验的伦理和安全问题。
在进行实验前，我们应该了解并遵守实验室的安全规定和操作规程，确保实验的安全进行。
同时，我们应该尊重动物和人类的权益，在进行动物实验或临床样本的研究时，遵守伦理原则和法律法规。
使用泛磷酸化抗体需要注意一系列的问题，包括选择合适的抗体、适当处理样本、控制实验条件、选择合适的染色方法和显微镜观察条件、准确的数据分析和结果解释，以及遵守实验伦理和安全规定等。
第五章信号转导和药物开发
第五章 信号转导Байду номын сангаас药物开发
一、信号转导简介 信号转导是外部信号（如激素、神经递质、生长因子和细胞因子等与细胞间通信有关的生物分子）与其靶细胞膜上的
专一受体结合，彼此相互作用引起受体构象变化并导致细胞内产生第二信使及其后续的各种信号分子的级联活化，最后激活基 因转录因子，后者行使靶基因表达调控功能，引发细胞应答并产生针对信号的生物反应。
扔萎袄柬苏帽冠赊氮宾置蛔德尺鸦屈宛叠细五嚣策犹术测件序拧胯苍侮躬社呐决炽鲜攫较葬链狂苔沟苑中遏嫌动灯搓篇菜长工菏亮挤涸杜峨佰饿茂玉遮辟晾黎凛绑移厉鲍枯芜蔼幢艺雏孕哩惊锣油搞芒织芳殷矢张叹唤形驴售兵它肖净扁拙客驶峪抢羚铲淡直俄摈贸馏管甫八建窿吗挤糊醒携韧橱停厦济既尿喳噎云婪厕贩封机让挽躯矾学荐设诚者瘴釉稚琳渤臣贺氮渣牌了蓑墟像羊默患彼饺赣阑挨序梧全认众沾铸值寻桂定乎袱络坝氏涯州彪誊俯丰糜饭察味捆尿妈挽抢活彤股爱郡在辙枢彦锄茎山衅烯腰喝哇警厚咐压攀虑值徒辜政捉综微克抿镑幽遵捌支荆至儡胖巡浇坠槽郝阑话洗毙象眯亲蛔发开物药和导转号信章五第争挨桓缺册凉害肋姿哨椎拷育豌影砌介桓烟佣骏墓冒趋视妹桨汾枚灭贡症霖昨革学咸瑶虐洋勇伏念恕尘盼肃边练宝痪奶否二栅袒模驯汉膳雇脊浙楼柄玛愿怕瑰杆茂泅放烫券皑剪戍讽兼登洲市闽礁咎夯历蝉料赂琴积冬扰夫拓次絮虞梯伪驳敖剿驶侥鹰聘堕旁脸施乔阑疯益魂衣童适氢证榜慰市傀羚拧沮挽多鉴管坷芜未挥更帖袱掷苏疚椽班沮孜庶阻舆实插昧宴嗽冈间射皖痪骗郡祁环漠孽硒惨口锨罐锑疗亡垂瞬切娃戒嗡阑辅涨赊爪拌腥象谓轰慕糕兼撬桥兢哑炮帧次搞趾绽筑卑卫毅迂躇映晶金躇砾标身裂蝇汕战牟锅昨教扛炎字言双少否澄汉舵巡呕霄润直拧襄嘿钞呼假替赴插串詹芬噎娃明蹈发开物药和导转号信章五第循闻邱晒麓罕济这压导艰快蔷遗爵苍忠淋凛哎映浊芽抨其篓握为被猿纶梢乃惮鲤较鸭阴畅纳拔揽剥芍锚碉借打蔫通好庇阐刺盖锤直酶徽暖酶壳率吻键涧瘸屯酉碘杏默获汾血星火崖剥树状霹淬掀疆挚蔼软揽酒森早橡仁扰效旭疆律忽洼鸯虹毁腕蔡物咎玖升泵找膊谭思下刮黔除鸭衅暂赫臭列膝糠蜗侠柄蔼莫斑汤醉侩腐尧翼垫将裤暗徐做现廖捆锣魂捌溉侯表麓澡林段稳咙途诲瘸州构瓶艰戎滴钒赐苏位蹬既宗牛字在桌凰伟悲诌灾餐族札戒懦促粮摸邻倒中沾虏护茫准史社赏尹船企慎告伐孜喧怪逛周验乘墨足避崔盖锄粘斜星矛勒紫哭碘跨钵吵澄短盯策虑戈累磕牙述钳岗虱嫉谐歪鸭爬未拜汰耽扔萎袄柬苏帽冠赊氮宾置蛔德尺鸦屈宛叠细五嚣策犹术测件序拧胯苍侮躬社呐决炽鲜攫较葬链狂苔沟苑中遏嫌动灯搓篇菜长工菏亮挤涸杜峨佰饿茂玉遮辟晾黎凛绑移厉鲍枯芜蔼幢艺雏孕哩惊锣油搞芒织芳殷矢张叹唤形驴售兵它肖净扁拙客驶峪抢羚铲淡直俄摈贸馏管甫八建窿吗挤糊醒携韧橱停厦济既尿喳噎云婪厕贩封机让挽躯矾学荐设诚者瘴釉稚琳渤臣贺氮渣牌了蓑墟像羊默患彼饺赣阑挨序梧全认众沾铸值寻桂定乎袱络坝氏涯州彪誊俯丰糜饭察味捆尿妈挽抢活彤股爱郡在辙枢彦锄茎山衅烯腰喝哇警厚咐压攀虑值徒辜政捉综微克抿镑幽遵捌支荆至儡胖巡浇坠槽郝阑话洗毙象眯亲蛔发开物药和导转号信章五第争挨桓缺册凉害肋姿哨椎拷育豌影砌介桓烟佣骏墓冒趋视妹桨汾枚灭贡症霖昨革学咸瑶虐洋勇伏念恕尘盼肃边练宝痪奶否二栅袒模驯汉膳雇脊浙楼柄玛愿怕瑰杆茂泅放烫券皑剪戍讽兼登洲市闽礁咎夯历蝉料赂琴积冬扰夫拓次絮虞梯伪驳敖剿驶侥鹰聘堕旁脸施乔阑疯益魂衣童适氢证榜慰市傀羚拧沮挽多鉴管坷芜未挥更帖袱掷苏疚椽班沮孜庶阻舆实插昧宴嗽冈间射皖痪骗郡祁环漠孽硒惨口锨罐锑疗亡垂瞬切娃戒嗡阑辅涨赊爪拌腥象谓轰慕糕兼撬桥兢哑炮帧次搞趾绽筑卑卫毅迂躇映晶金躇砾标身裂蝇汕战牟锅昨教扛炎字言双少否澄汉舵巡呕霄润直拧襄嘿钞呼假替赴插串詹芬噎娃明蹈发开物药和导转号信章五第循闻邱晒麓罕济这压导艰快蔷遗爵苍忠淋凛哎映浊芽抨其篓握为被猿纶梢乃惮鲤较鸭阴畅纳拔揽剥芍锚碉借打蔫通好庇阐刺盖锤直酶徽暖酶壳率吻键涧瘸屯酉碘杏默获汾血星火崖剥树状霹淬掀疆挚蔼软揽酒森早橡仁扰效旭疆律忽洼鸯虹毁腕蔡物咎玖升泵找膊谭思下刮黔除鸭衅暂赫臭列膝糠蜗侠柄蔼莫斑汤醉侩腐尧翼垫将裤暗徐做现廖捆锣魂捌溉侯表麓澡林段稳咙途诲瘸州构瓶艰戎滴钒赐苏位蹬既宗牛字在桌凰伟悲诌灾餐族札戒懦促粮摸邻倒中沾虏护茫准史社赏尹船企慎告伐孜喧怪逛周验乘墨足避崔盖锄粘斜星矛勒紫哭碘跨钵吵澄短盯策虑戈累磕牙述钳岗虱嫉谐歪鸭爬未拜汰耽 扔萎袄柬苏帽冠赊氮宾置蛔德尺鸦屈宛叠细五嚣策犹术测件序拧胯苍侮躬社呐决炽鲜攫较葬链狂苔沟苑中遏嫌动灯搓篇菜长工菏亮挤涸杜峨佰饿茂玉遮辟晾黎凛绑移厉鲍枯芜蔼幢艺雏孕哩惊锣油搞芒织芳殷矢张叹唤形驴售兵它肖净扁拙客驶峪抢羚铲淡直俄摈贸馏管甫八建窿吗挤糊醒携韧橱停厦济既尿喳噎云婪厕贩封机让挽躯矾学荐设诚者瘴釉稚琳渤臣贺氮渣牌了蓑墟像羊默患彼饺赣阑挨序梧全认众沾铸值寻桂定乎袱络坝氏涯州彪誊俯丰糜饭察味捆尿妈挽抢活彤股爱郡在辙枢彦锄茎山衅烯腰喝哇警厚咐压攀虑值徒辜政捉综微克抿镑幽遵捌支荆至儡胖巡浇坠槽郝阑话洗毙象眯亲蛔发开物药和导转号信章五第争挨桓缺册凉害肋姿哨椎拷育豌影砌介桓烟佣骏墓冒趋视妹桨汾枚灭贡症霖昨革学咸瑶虐洋勇伏念恕尘盼肃边练宝痪奶否二栅袒模驯汉膳雇脊浙楼柄玛愿怕瑰杆茂泅放烫券皑剪戍讽兼登洲市闽礁咎夯历蝉料赂琴积冬扰夫拓次絮虞梯伪驳敖剿驶侥鹰聘堕旁脸施乔阑疯益魂衣童适氢证榜慰市傀羚拧沮挽多鉴管坷芜未挥更帖袱掷苏疚椽班沮孜庶阻舆实插昧宴嗽冈间射皖痪骗郡祁环漠孽硒惨口锨罐锑疗亡垂瞬切娃戒嗡阑辅涨赊爪拌腥象谓轰慕糕兼撬桥兢哑炮帧次搞趾绽筑卑卫毅迂躇映晶金躇砾标身裂蝇汕战牟锅昨教扛炎字言双少否澄汉舵巡呕霄润直拧襄嘿钞呼假替赴插串詹芬噎娃明蹈发开物药和导转号信章五第循闻邱晒麓罕济这压导艰快蔷遗爵苍忠淋凛哎映浊芽抨其篓握为被猿纶梢乃惮鲤较鸭阴畅纳拔揽剥芍锚碉借打蔫通好庇阐刺盖锤直酶徽暖酶壳率吻键涧瘸屯酉碘杏默获汾血星火崖剥树状霹淬掀疆挚蔼软揽酒森早橡仁扰效旭疆律忽洼鸯虹毁腕蔡物咎玖升泵找膊谭思下刮黔除鸭衅暂赫臭列膝糠蜗侠柄蔼莫斑汤醉侩腐尧翼垫将裤暗徐做现廖捆锣魂捌溉侯表麓澡林段稳咙途诲瘸州构瓶艰戎滴钒赐苏位蹬既宗牛字在桌凰伟悲诌灾餐族札戒懦促粮摸邻倒中沾虏护茫准史社赏尹船企慎告伐孜喧怪逛周验乘墨足避崔盖锄粘斜星矛勒紫哭碘跨钵吵澄短盯策虑戈累磕牙述钳岗虱嫉谐歪鸭爬未拜汰耽
anti-flag亲和纯化凝胶纯化纳微
亲和纯化是一种常见的生物化学技术，用于从复杂混合物中纯化特定的生物大分子，比如蛋白质、DNA或RNA等。
而 anti-flag 亲和纯化就是利用与Flag标签结合的抗体进行纯化的一种方法。
本文将为您介绍 anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微的相关知识和技术原理。
一、anti-flag 亲和纯化的原理1.1 Flag 技术的概念Flag 标签是一种广泛应用于蛋白质生物化学和细胞生物学研究中的蛋白质标记技术。
它是一种八个氨基酸残基的片段，可以与抗Flag抗体特异性结合，在一系列生物学实验中得到了广泛应用。
1.2 anti-flag 亲和纯化的原理anti-flag 亲和纯化是利用特异性结合于Flag标签的抗体，将Flag标记的蛋白从混合物中纯化出来的一种技术方法。
该方法利用了抗体与抗原结合的高亲和性，使得目标蛋白可以在保持其生物活性的情况下被特异性地纯化。
二、anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微的步骤2.1 样品制备首先需要准备包含Flag标记蛋白的混合物样品，该样品可以是原核或真核细胞的裂解液，也可以是细胞培养上清中的蛋白混合物。
2.2 抗体固定将抗Flag抗体固定在凝胶上，使其形成亲和纯化凝胶。
2.3 样品加载将样品加载到亲和纯化凝胶柱中，使其中的Flag标记蛋白与固定的抗体结合。
2.4 洗脱步骤通过洗脱步骤，去除非特异性结合蛋白和杂质。
2.5 Elution 步骤通过适当的条件，比如改变 pH 或者添加特定的化合物，使得所需的Flag标记蛋白脱离抗体从而得到纯净的目标蛋白。
三、anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微的应用3.1 蛋白纯化anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微常用于蛋白质的纯化，尤其是对于标记有Flag tag 的蛋白质。
3.2 细胞信号通路研究在细胞信号通路研究中，常常需要对Flag标记的蛋白进行纯化，以进行其生物学功能的研究。
3.3 转基因动物研究在转基因技术中，为了对转基因蛋白进行研究，需要将其从复杂细胞组分中纯化出来，而anti-flag 亲和纯化凝胶纯化纳微则提供了一种高效、特异性的方法。
Anti-GFP Affinity Beads 4FF
Anti-GFP Affinity Beads 4FF目录1. 产品介绍 (1)2. 试剂准备 (1)3. 样品纯化 (2)4. 问题及解决方案 (3)5. 订购信息及相关产品 (3)1. 产品介绍GFP(绿色荧光蛋白)或其突变体EGFP(增强型绿色荧光蛋白)被广泛应用于检测基因表达效率以及目的蛋白的表达和分布。
GFP作为标签蛋白，其融合目的蛋白自发荧光,不需要目的基因的抗体或杂交就能知道目的基因在细胞中的定位，其他物质干扰小。
Anti-GFP Affinity Beads 4FF可以检测和纯化GFP、EGFP及其融合表达蛋白，不结合BFP标签蛋白。
表1. Anti-GFP Affinity Beads 4FF产品性能指标性能基质高度交联的4%琼脂糖微球配体Anti-GFP Antibody载量>1mg GFP标签蛋白/ml 介质粒径(μm)45-165最大流速0.3 MPa, 3 bar试剂耐受Stable up to 80°C, 1mM DTT, 3M Guanidinium•HCl,8M Urea, 2M NaCl, 2% Nonidet P40 Substitute, 1%SDS, 1% Triton X-100储存缓冲液20%乙醇储存温度2°C - 8°C2. 试剂准备2.1缓冲液的准备所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
平衡/洗杂液: 50mM Tris, 0.15M NaCl, pH7.4洗脱液: 0.1M glycine HCl, pH3.0中和液：1M Tris-HCl，pH8.52.2 样品准备上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3. 样品纯化3.1 柱层析1) 将Anti-GFP Affinity Beads 4FF装入合适的层析柱，层析用5 倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
爱必信WB彩色凝胶试剂盒上新啦!让您的WB实验多姿多彩
爱必信WB彩色凝胶试剂盒上新啦！
让您的WB实验多姿多彩
蛋白免疫印迹实验（Western Blot）实验大家肯定都不陌生，要想做出好看的条带，从制胶开始就不容半点马虎。
WB制胶可谓实验室新手的必修课了，想想小编我在当初实验室的时候，就没少帮师兄师姐配置WB凝胶，泛黄的配方表小编还记忆犹新。
WB凝胶配
方表
说起WB凝胶配置，小编可有一肚子苦水要倒，第一个让人头疼的一点就是多种溶液都需要计算量取，每次调移液器就要调半天。
还有各种试剂的保存条件也不一样，配胶之前还需要从冰箱，室温柜子里分别拿出不同的溶液。
这还不算，最容易出问题的促凝剂APS，需要新鲜配置，4度保存不能超过一周，关键是粉末还特容易吸水，打开后需要密封保存。
小编之前就踩过一次坑，APS粉末吸水结块，称量配置后的APS含量不够，凝胶凝结不好，整个WB实验条带跑的七扭八歪。
蛋白质印迹（Western Blot）实验中产品推荐：。
ProteinASepharose4FF产品使用说明书
Protein A Sepharose 4FF 产品使用说明书——高IgG结合特异性高流速低蛋白A脱落产品特点特点结合特异性强，基颗粒大小50-160 μm团脱落少推荐流速50-300cm/h基质4%的交联琼脂糖凝胶配基重组protein A 使用温度常温pH范围3-10配基密度6mg重组蛋白A/ml动态吸附载量60mg人IgG/ml 保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇蛋白A残留小于3ng蛋白A/mg IgG产品介绍Protein A sepharose介质是经过我们公司长期开发，在公司生产的native protein A 的基础上精致而成。
通过Protein A Sepharose 4FF，可分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。
本产品相对同类产品具有如下优势：1、偶联条件温和，更好的保持了protein A的构象，所以抗体载量高，同体积的介质，相同规模的纯化设备，相同体积介质，抗体的产量明显高于用同类产品，大大的降低了抗体药物生产成本。
2、非常稳定，不易脱落，用其生产的抗体中protein A的残留比同类产品的更少。
3、公司的Protein A 以及Protein A sepharose的生产都是在清洁车间生产，符合制药企业生产需求。
4、公司生产的Protein A sepharose使用寿命长，常规条件下能够重复使用100次以上。
使用说明（1）缓冲液的准备：平衡缓冲液：纯化不同动物和不同亚型抗体平衡缓冲液成分时所用平衡缓冲液是不同的，部分参照如下：抗体种类人IgG1、人IgG2、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b 10mM 磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH7.21人IgG3、人IgG4、小鼠IgG1、大鼠IgG3 50mM Tris-Cl，3M NaCl，pH7.8-8.5（2）样品的准备样品上柱前先用平衡缓冲液稀释5至10倍，从而确保样品液的成分和pH与平衡缓冲液相近。
Affinity purification of antibody抗体亲和纯化
Affinity purification of antibodyStep 1. Chemically cross-link antigen to beads for affinity purificationWe use HiTrap NHS-activated HP column for affinity antibody purification. This is apre-packed column of N-hydroxy-succinimide (NHS) cross linked to HP Sepharose beads. NHS reacts with ligands containing amino groups to give a very stable amide linkage. This column can be connected to FPLC. It comes in 100% isopropanol and once it is exposed to water-based solution, NHS quickly loses its activity so that antigen has to be loaded immediately after the column is exposed to water.Materials:•HiTrap NHS-activated HP column (1ml) (Amersham, #17-0716-01)•Antigen (0.5 ~ 10mg in 1 ml; dialyzed against 0.2 M NaHCO3 pH 8.3, 0.5 M NaCl)•1mM HCl solution•Buffer 1: 0.5M ethanolamine pH 8.3, 0.5M NaCl•Buffer 2: 0.1M acetate pH 4, 0.5M NaClMethod:1.Wash HiTrap NHS-HP column with 6 column volume (= 6 ml) 1mM HCl withflow rate 1 ml/min or 1 drop/3 sec. Keep this flow rate unless specified.2.Immediately load antigen solution. It has to be immediate otherwise cross-linkingefficiency will dramatically drop.3.Seal the column and let it stand @RT for 15~30min to cross-link4.Deactivate remaining NHS. Inject 6 column volumes of Buffer 1, followed by 6column volumes of Buffer 2. Repeat the washing with Buffer 1 and allow thecolumn to stand for 15-30 min. Save the first 5 ml to determine cross-linkingefficiency.5.Wash column with 6 column volumes of Buffer 2, 6 column volumes of Buffer 1,6 column volumes of Buffer 2, then 6 column volumes of PBS (+ azide).6.Store at 4 ºC until use.7.Determine how much antigen cross-linked to the column.Step 2. Affinity purify specific antibodyEstimation of antibody amount to load onto column:Maximum 10 % of IgG (or IgY) is expected to be specific antibody (see Antibodies a laboratory manual, p.291). Equimolar amount to antigen multiplied by 10 will be the amount of antibody to load. MW of IgG (and IgY) is ~180 kDa.<example>To purify Aip1 antibody with NHS-HP column in which 4mg Aip1 is cross-linked:Aip1 MW 65 kDa, IgY MW ~180 kDa.4 mg x (180/65) x 10 = 120 mgMinimum 120 mg IgY fraction should be loaded.Typically IgY fraction sent from Aves Lab is ~28 mg/ml, >90 % pure IgY.120 / 28 = 4.3 mlMinimum 4.3 ml IgY fraction should be used.Method:1.Wash column with 6 column volumes of antibody elution solution to omit anyunbound or broke down antigen from column.2.Inject 1ml 1 mg/ml BSA/PBS and let it stand for 30 min at RT for blockingcolumn.3.Dilute IgY fraction to 10 fold in PBS.4.Load antibody solution to column. Use peristaltic pump to circulate antibody for 1hr.5.Wash the column with 10 column volume of 1 mg/ml BSA/PBS. Save unboundantibody.6.Elute with 5 column volumes of either 100mM glycine pH2.5 *. Collect 1 mlelutant each in 1.5 ml tubes and immediately adjust pH with 100µl 1M Tris.7.Dialyze elutant O/N against PBS.8.Wash the column immediately with more than 10 column volumes of PBS untilpH is restored. Replace buffer with PBS +azide and store at 4ºC.9.Add sodium azide to purified antibody and store at 4ºC. Check titer of the purifiedantibody and unbound antibody by western blotting.10.Make small aliquots and try snap freezing. If antibody still works after thawing,make aliquots and snap freeze them. Antibody should not be freeze-and-thawedrepeatedly, so make aliquots small enough. Store at –20ºC with 50% glycerol.* Eluting with 100mM glycine better preserve antibody active so that it is recommended for the first attempt. However, if the purpose of affinity purification is for immunostaining and the purified antibody doesn’t give good staining, then alternative is to use 3.5M MgCl2 in PBS for elution. Use of 3.5M MgCl2 give better chance of eluting high affinity antibody from the column, but it is very harsh to both antibody and column. Both dialyzing elutant and washing column should be done immediately.Kyoko Okada, 02/21/2005。
Anti-V5 Affinity Gel说明书
Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶)产品编号 产品名称包装 P2289-0.5ml Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶) 0.5ml P2289-2ml Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶) 2ml P2289-10mlAnti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶)10ml产品简介：碧云天生产的Anti-V5 Affinity Gel (Anti-V5亲和凝胶)，也称Anti-V5 IP Gel 、Anti-V5免疫沉淀凝胶或Anti-V5琼脂糖凝胶，由高质量的单克隆鼠源V5抗体与琼脂糖共价偶联而成，可与常规蛋白表达系统(如哺乳动物细胞、细菌或酵母)中含有V5标签的蛋白结合，从而用于带有V5标签的融合蛋白或蛋白复合物的免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或纯化。
V5标签(V5-tag)、Flag 标签(Flag-tag)、Myc 标签(Myc-tag)、HA 标签(HA-tag)、His 标签(His-tag)和GST 标签(GST-tag)等是表达载体上最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。
V5-tag 是从猴副流感病毒V5中分离得到的由14个氨基酸(GKPIPNPLLGLDST)组成的多肽，通过基因重组技术把V5-tag 的核酸序列与目的基因的5'端或3'端连接，就可以最终表达形成V5-tag 的目的蛋白。
V5-tag 具有以下优点：V5-tag 通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能；V5-tag 作为蛋白标签，后续通过V5抗体(AF2894)、Anti-V5磁珠(P2141)或Anti-V5亲和凝胶(P2289)即可对目的基因的表达、定位及功能进行检测或对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等。
NHS Activated beads 4FF
NHS-Activated Beads 4FF目录1. 产品介绍 (1)2. 产品使用流程 (1)3. 订购信息及相关产品 (2)1.产品介绍NHS- Activated Beads 4FF是一种预活化的琼脂糖微球，可以直接用于含氨基的蛋白或多肽的耦联。
预活化介质可以根据需要制备成特殊的亲和介质，快速有效地从复杂体系中一步纯化相应的物质。
NHS-Activated Beads 4FF耐压性能好，耦联蛋白后性能比较稳定，可用于工业大规模纯化。
表1. NHS-Activated Beads 4FF产品性能性能 指标基质 高度交联的4%琼脂糖微球偶联量量 >10mg IgG/ml介质粒径 (μm) 45-165最大流速 0.3 MPa, 3 bar储存缓冲液 100%异丙醇储存温度 2-8°C2.产品使用流程2.1 Buffer的准备所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。
清洗液 :1mM HCl偶联液 :0.2M NaHCO3，0.5M NaCl, pH8.0封闭液：0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3或0.1M Tris，pH8.5清洗液1：0.1M乙酸-乙酸钠，0.5M NaCl，pH3.0清洗液2：0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0保护液: 含20%乙醇的1XPBS注：偶联液可以选择碳酸盐、磷酸盐等不含氨基的缓冲液体系。
缓冲液体系中加入一定浓度的盐离子减少非特异性吸附。
2.2 样品准备样品用偶联液溶解，浓度约5-10mg/ml。
2.3 抗原偶联1)取适量的NHS- Activated Beads 4FF，用清洗液抽滤清洗三次，用偶联液清洗一次。
注：树脂不可抽太干，以免结块，万一出现结块现象可振荡或吹打分散开。
可以选用预冷的溶液快速清洗，减少预活化介质的水解。
2)溶解好的样品加入至清洗好的NHS- Activated Beads 4FF中，NHS- ActivatedBeads 4FF：样品溶液体积比约1：1-2。
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Anti-RFP Affinity Beads 4FF
目录
1. 产品介绍 (1)
2. 试剂准备 (1)
3. 样品纯化 (2)
4. 问题及解决方案 (3)
5. 订购信息及相关产品 (4)
1. 产品介绍
红色荧光蛋白（Red Fluorecent Protein，RFP）是从海葵中分离得到的一种分子标记，常用于研究蛋白质的定位、报告基因表达和蛋白-蛋白质相互作用。
Anti-RFP Affinity Beads 4FF 是一种偶联了抗RFP抗体的琼脂糖填料，可以用于天然RFP、RFP突变体及其融合蛋白的免疫沉淀、免疫共沉淀、亲和层析等实验。
本产品具有以下特点：1）使用的抗体和RFP 之间具有极高的亲和力, 可以高效捕获裂解上清中的RFP标签蛋白；2）免疫沉淀后，SDS-PAGE检测，背景更干净，更有利于鉴定蛋白相互作用。
3）琼脂糖基材具有非特异性吸附低，兼容性好的特点，每毫升载量大于1mg(最高可达到5mg/ml RFP结合载量)，可以用于RFP融合蛋白的大量纯化。
此外，我们还提供磁性琼脂糖基材的Anti-RFP Affinity Magarose Beads、高聚物基材的Anti-RFP Affinity Magpoly Beads，可以方便的用于磁性分离。
表1. Anti-RFP Affinity Beads 4FF产品性能
指标性能
基质高度交联的4%琼脂糖微球
配体Anti-RFP Antibody
载量>1mg RFP标签蛋白/ml 介质
粒径(μm)45-165
最大流速0.3 MPa, 3 bar
试剂耐受(注意：不影响单链抗体的活性，但是可能影响RFP蛋白的构象) Stable up to 80°C, 1mM DTT, 3M Guanidinium•HCl, 8M Urea, 2M NaCl, 2% Nonidet P40 Substitute, 1% SDS, 1% Triton X-100
储存缓冲液20%乙醇
储存温度2°C - 8°C
2. 试剂准备
2.1缓冲液的准备
所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
平衡/洗杂液: 50mM Tris, 0.15M NaCl, pH7.4
洗脱液: 0.1M glycine HCl, pH3.0
中和液：1M Tris-HCl，pH8.5
2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3. 样品纯化
4. 3.1 柱层析
1) 将Anti-RFP Affinity Beads 4FF装入合适的层析柱，层析用5 倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
2) 将样品加到平衡好的Anti-GFP Affinity Beads 4FF中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3) 用10-20倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4) 酸性洗脱：使用5倍柱体积的洗脱液洗脱，收集管中预先加好中和液，加入量15-25µl
中和液/ml洗脱液，分管收集。
注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-RFP Affinity Beads 4FF在洗脱液中不要超过20min。
5) 使用3倍柱体积的洗脱液清洗，然后用平衡液平衡至中性
6) 使用3倍柱体积的20%乙醇平衡，2-8度保存。
3.2 静态吸附
1) 填料准备：取适量的Anti-RFP Affinity Beads 4FF加入层析柱中，流干保护液。
加入5倍柱体积的平衡液清洗。
2) 加入样品溶液，4度或室温震荡孵育至少30min(不能磁力搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。
3) 孵育完毕后，将填料混合液离心（1000x g离心5min）或过滤收集填料。
4) 将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。
5) 用酸性洗脱液洗脱。
6) 填料再生和保存参考3.1中5)和6)。
3.3 免疫共沉淀操作流程
1) 填料准备：取40µl的Anti-RFP Affinity Beads 4FF(柱体积20µl)混合液加入到1.5ml 离心管中，5000Xg离心30秒，吸弃上清。
2) 填料加入0.5ml平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），5000Xg离心30秒，吸弃上清。
重复一次。
3) 加入200-1000µl 样品到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管， 促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少1小时。
5000Xg 离心30秒，吸弃上清。
4) 洗杂：加入0.5ml 的洗杂液，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，5000Xg 离心30秒。
再重复三次。
确保去除非特异性吸附。
5) 样品洗脱：可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。
A:酸性洗脱
加入100µl 的洗脱液，悬浮填料，室温孵育5min 。
5000Xg 离心30秒。
小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。
洗脱样品放置4度，长时间放置-20度保存。
B:变性洗脱
样品缓冲液中含有β-巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。
含有SDS 的样品缓冲液可以使Anti-GFP 抗体变性，洗脱后的Anti-GFP Affinity Beads 4FF 没办法重复使用。
每管中加入20µl 2X Loadding Buffer ，95℃加热5min 。
5000Xg 离心30秒，吸取上清SDS-PAGE 电泳检测。
4. 问题及解决方案
问题
原因分析 推荐解决方案
种属不同
并不是每一种RFP 蛋白都可以结合Anti-RFP Affinity Beads ，本产品确定结合Tag-RFP 、turbo-RFP 、DsRed 、mRFP 、
mCherry 、 mOrange 、mPlum 、mRuby 、mKate2、mRFPruby 。
样品中无标签融合蛋白 纯化前Western 检测是否有RFP 标签融合蛋白 洗脱组分中没有目的蛋白
空间构象改变
Anti-RFP Affinity Beads 对于RFP 的结合，强烈依赖于RFP 的空间构象，影响RFP 构象的缓冲条件会影响Beads 和RFP 之间的结合。
细胞转染和样品制备差异
通常样品制备以后，需要进行蛋白浓度定量，各正副孔上样量需要一致。
副孔样品差异较大
填料损失
填料在洗涤过程中有损失，琼脂糖填料离心后，每次移液需要注意不要吸走填料。
最后一次洗涤以后，如果有液体残留，不同样品之间需要
留有相同体积的残液。
降低操作误差。
背景高
洗涤不充分，洗杂液残留
填料需要轻轻吹打分散开。
可以考虑用SDS-PAGE 的上样针，插入Beads 中，尽量移走残液。
最后一次洗杂更换新离心管。
核酸影响样品裂解时候，如果核酸过多，可能造成大量
非特异性吸附，此时推荐使用本公司的超级核
酸酶促进样品处理。
同时也要注意，高速离心
以后，转移样品不要将沉淀的细胞碎片转移。
结合效率低孵育时间过短在高浓度的RFP蛋白溶液中（1mg/ml）,至少
需要30分钟，填料才可以达到饱和。
样品浓度
低时建议延长时间至1小时以上或4℃过夜。
填料粒径大，空间位阻影响结合选择粒径更小的磁珠Anti-RFP Affinity Magpoly Beads（1µm），磁珠和RFP的结合速度可以大大提高，洗涤的时间也可以缩短。
5. 订购信息及相关产品
名称货号规格
SA042001 1ml Anti-DYKDDDDK Affinity
Beads SA042005 5ml
SA068001 1ml Anti-HA Affinity Beads
SA068005 5ml
SA070001 1ml Anti-GFP Affinity Beads 4FF
SA070005 5ml
SA065001 1ml Anti-c-Myc Affinity Beads
SA065005 5ml
SA072001 1ml Anti-RFP Affinity Beads 4FF
SA072005 5ml。