第三章-分子杂交与印迹技术

• 固-液相杂交
印迹杂交
原位杂交
•液相杂交
按照杂交分子特性分
•DNA-DNA杂交
•DNA-RNA杂交
•蛋白质杂交
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一、Southern印迹杂交
此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。
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限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
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2.随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合， 作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。
另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互 补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷 酸掺入到新合成的DNA分子中
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第三章 分子杂交与印迹技术
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第一节 核酸分子杂交的基本原理
一、变性与复性
（一）变性 1、定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键
断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成 为单链。
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2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
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五、原位杂交
1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中 的核酸进行杂交，称原位杂交。
根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂 交；
根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、 RNA/RNA 杂交；
根据杂交物分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交。
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
相同，最好不用。
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（三）标记物 1.想标记物应具备的特性： • 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
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2. 标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
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（2）常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
融解温度： 定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时 的温度。
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（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复 性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
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四、应 用 1.检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 2.用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝
数及表达丰度。
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第二节 核酸分子杂交的方法
按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
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（四）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代
谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合 成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中
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体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应， 标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染 色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白 质。
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四、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
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（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
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（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程
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1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
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5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序
的总长度 （2）复性速率与反应体系中核酸复杂性成反比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对
杂交率取决于DNA的相对复杂性
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6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针
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三、影响杂交的因素
1、探针分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
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2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
（一）探针的种类
• 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针
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（二） 探针的制备方法
制备方法： (1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
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合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（50-300 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列
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2、Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝 胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
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Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern
印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
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三、 Western印迹杂交
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA
片段的膜
杂交、显影
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Southern 印迹杂交的技术流程
（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
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（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
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（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。
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（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤 膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空 室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器 中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带 动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤 维素膜上。
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（五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
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（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
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（七）Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析
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二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA
随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以 上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
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3. PCR标记法： 将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记 的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入 到新合成的DNA分子中
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2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
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3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo
为
1 2
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
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二、分子杂交
• 将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核 酸分子放入同一个反应体系，两条互补链 可通过复性重新缔合形成双链，这一过程 成为核酸分子杂交。
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三、探针
探针：是指带有标记物的、能与被检测
的核酸片段互补的一段已知核酸片段。
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
双链核酸分子链间的氢键断裂。
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3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
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4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
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5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
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酶促标记法 1.切口平移法（nick translation)
1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外 切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以 互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切 口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将 标记的核苷酸掺入到新的DNA链中
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
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4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交