胰脏中胰岛素的分离提取背景知识
胰岛素的工艺流程
胰岛素的工艺流程胰岛素（Insulin）是一种重要的蛋白质激素，由胰岛细胞分泌，具有调节血糖水平的功能。
胰岛素工艺流程是指将胰岛素从猪胰腺或人工合成的甘露醇合成而来的原始胰岛素进行提取、纯化、结晶等一系列的步骤，最终得到纯度高、纯净度高，能够用于治疗糖尿病患者的胰岛素制剂。
下面是胰岛素的工艺流程。
1. 提取胰岛素原液：首先将猪胰腺或者人工合成的原始胰岛素进行切碎，然后使用一种生物酶解剂将胰岛素原液中的蛋白质、多肽等物质溶解。
酶解剂会切割蛋白质中的特定键，使得胰岛素原液中的胰岛素分子释放出来。
2. 过滤杂质：将酶解后的胰岛素原液通过过滤杂质的步骤，除去胰岛素原液中的悬浮物、微粒和其他不能溶解的杂质。
这样可以净化胰岛素原液，使得后续步骤更加顺利。
3. 纤维素过滤：使用纤维素过滤器过滤掉胰岛素原液中的大分子物质、细胞碎片等。
这个步骤可以进一步提高胰岛素原液的纯度。
4. 醇析：醇析是一种分离和纯化胰岛素的常用方法。
在这个步骤中，将胰岛素原液中加入醇（如甘露醇），将胰岛素分子与其他杂质分子分离。
胰岛素分子由于溶解度的不同，会与甘露醇形成共溶液，从而在滤液和沉淀中进行分离。
5. 结晶：通过降低溶液的温度和增加溶剂的浓度，使得胰岛素分子团聚形成晶体，从而进行进一步的纯化。
通过晶体的形成和生长，可以去除溶液中的杂质，并提高胰岛素的纯度。
6. 除水晶化：将胰岛素结晶物溶解在适当的溶剂中，加入保护剂和稳定剂。
7. 浓缩：将溶解的胰岛素液浓缩，提高其浓度，便于后续的制剂步骤。
8. 灭菌：为了确保胰岛素产品的无菌性和安全性，对其进行灭菌处理。
常用的灭菌方式有高温高压灭菌、过滤灭菌等。
9. 储存：对生产出的胰岛素制剂进行储存，通常在低温下保存，确保其稳定性和活性。
以上就是胰岛素的工艺流程，每个步骤都非常重要，可以确保最终产品的质量和纯净度，让胰岛素能够为糖尿病患者提供有效的治疗。
胰岛素的工艺流程在不断发展，为生产高效、安全、纯度高的胰岛素制剂提供了重要的技术支持。
胰岛素提取分离工艺
七、精制
1）第一次结晶 获得较纯的胰岛素，等电点结晶法，离心分离 2）第二次结晶 结晶、离心，同上 3）干燥
生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止 变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用 的方法是真空干燥和冷冻干燥，某些无活性核酸、 微生物酶制剂和酪蛋白等产品则较多应用喷雾干 燥、气流干燥等直接干燥法。
操作注意事项
去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的pH值至酸性 （在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去 除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性）
五、减压浓缩
吸上层清液至真空蒸发器内，下层用帆布过滤， 沉淀物弃去，滤液并入上清液。清液在30℃以下减 压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04~1.06（约为 原来体积的1/9~1/10）为止。
1、组织捣碎 目前工业生产中常用的组织捣碎是通过机
械破碎方法而实现的。例如通过刨削机、组 织破碎机等机械设备。
2、细胞破碎
有许多生物活性物质位于细胞内部，在细胞 培养（或发酵）过程中不能分泌到细胞外的培 养液（或发酵液）中。如青霉素酰化酶、碱性 磷脂酶等胞内酶，必须在固液分离之前先将细 胞破碎，使细胞内产物释放到液相中，然后再 进行固液分离。
5）锌沉淀
在收集液中加入4mol氨水调pH值至6.2~6.4， 加入3.6%（V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为 20%），在用4mol氨水调pH值至6.0，低温放置 过夜，离心得到沉淀。
6）第三次结晶
第三次等电点结晶，离心收集纯度高的胰岛素 锌盐。
7）干燥
获得白色粉状胰岛素
8）制剂
胰岛素口服液能受胃肠消化酶分解而失效， 因而必须制成注射液：有胰岛素注射液、蛋白 锌胰岛素注射液、精蛋白锌胰岛素注射液等。
人胰岛素的生产流程
人胰岛素的生产流程一、胰岛素的来源。
咱得先知道胰岛素从哪来呀。
最开始呢，胰岛素是从动物身上提取的，像猪啊牛啊的胰腺里就有胰岛素。
但是动物胰岛素和人胰岛素还是有点区别的，用起来可能会有点小问题，比如说有的人会过敏啥的。
后来呀，就慢慢研究怎么生产人胰岛素啦。
二、基因工程的魔法。
现在生产人胰岛素主要靠基因工程。
这就像是一场超级神奇的魔法。
科学家们先找到能够产生胰岛素的基因，这个基因就像是一个神秘的小密码。
然后把这个基因提取出来，这就好比从宝藏库里拿出了一件超级重要的宝贝。
三、微生物的大作用。
接下来呢，这个基因会被放到微生物里，通常是大肠杆菌或者酵母菌这些小家伙。
这些微生物就像一个个小小的工厂。
它们在合适的环境里，比如在有充足的营养，合适的温度、酸碱度的环境里，就开始按照这个基因的指令来生产胰岛素。
大肠杆菌繁殖起来可快啦，酵母菌也是很能干的小帮手。
它们不断地合成胰岛素，就像勤劳的小工匠一样。
四、提取和纯化。
等微生物生产出了胰岛素，可不能就这么直接用。
还得把胰岛素从这些微生物里提取出来呢。
这就像是从一堆杂物里把我们想要的宝贝挑出来。
这个过程可复杂啦，要用到好多高科技的手段。
提取出来之后也还没完，还得进行纯化。
纯化就是把那些杂质都去掉，只留下纯净的胰岛素。
这就像把一颗钻石从一堆石头里打磨得晶莹剔透一样。
五、检测和包装。
纯化后的胰岛素还得经过严格的检测。
这就像是给它做一个全面的体检。
要检测它的纯度够不够，活性好不好等等好多项目。
只有检测合格了，才能进行包装。
包装也很重要呢，要保证胰岛素在储存和运输的过程中不会被破坏。
生物分离提取技术项目一：从猪胰脏中提取胰岛素任务4胰岛素的纯化教案教学设计
另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。
学生回答……引入任务
三、教师讲解
1、沉淀的方法
（1）盐析法：此方法并未破坏蛋白质天然状态。沉淀出的蛋白质可不变性，所以盐析法是分离制备蛋白质或蛋白类生物制剂的常用方法。
盐析法的原理：
蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
胰岛素粗品的提取
胰岛素粗品的提取——酸醇提取减压浓缩法（一）实验目的：1、了解胰岛素的作用与性质；2、掌握胰脏中提取胰岛素的工艺过程；3、通过熟悉胰脏的粗提纯，培养学生生物分离手段应用的能力。
（二）实验器材与药品：空调，冰箱，组织捣碎机（绞肉机），天平，大转头低温离心机，蒸发浓缩仪，真空干燥箱，密度计，水浴加热锅，制冰机；剪刀，烧杯（1000ml），量筒，温度计，玻棒，滴管（2），纱布（粗布），漏斗，滤纸，PH试纸（酸、碱），注射器；猪胰，H2SO4，酒精，浓氨水，NaCl，草酸，无水丙酮。
（三）实验步骤：材料预处理：胰脏最好采用-30℃速冻法，贮存在-20℃，保存不超过8个月。
材料处理：将猪胰除去结缔组织等杂质，绞碎成胰浆。
提取：称一定重量（200g）置烧杯中，加入2.3～2.6倍量86-88%的醇和草酸。
草酸为冻胰脏的5%。
（先将草酸溶于事先配制好的乙醇中）。
（PH应为2．5～3．0，醇含量为70%左右）。
在温度为10～150C下搅拌（60/min）提取3h。
离心（粗布过滤），残渣再用一倍量68-70%乙醇和0.4%草酸提取2h。
离心（粗布过滤2次），合并二次浸出液。
[操作重要参数]：1）、PH 为2.5～3.0（胰岛素在酸性条件下稳定）2）、乙醇含量为70%左右。
（在此浓度下，胰岛素溶解度比较大，过高会使胰岛素变性）3）、温度为10～15℃（低温，保持胰岛素活性）碱化、酸化：提取液在不断搅拌下（35/min）加入浓氨水，调pH达8．0～8.4(液温10-15℃)，立即进行过滤（除去碱性蛋白质）（可离心），于澄清的滤液中迅速加入10%硫酸使pH调至3.6～3.8。
在5℃静置4-6h以上（使酸性杂蛋白沉降）。
[操作注意事项]：去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的 pH 值至酸性（在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性）。
减压浓缩：吸取上清液，下层沉淀用纱(帆)布过滤，滤液并入上清液，清液在300C以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04-1.06（约为原体积的1/9～1/10）为止。
胰岛素的相关知识PPT课件
注射部位的选择和轮换
注射部位的选择
根据患者的需求和胰岛素的类型 ，选择合适的注射部位，如腹部 、大腿外侧、上臂外侧等。
注射部位的轮换
为了避免皮肤硬结、脂肪萎缩等 不良反应，应定期更换注射部位 ，并确保每次注射部位都正确。
胰岛素的保存和运
胰岛素的保存
胰岛素应存放在阴凉干燥处，避免阳 光直射和高温，以免影响药效。
患者在接受胰岛素治疗过程中应密切 关注自身状况，如有异常及时就医， 以便及时发现并处理不良反应。
06
胰岛素的未来发展
新型胰岛素的开发和研究
总结词
随着科技的不断进步，新型胰岛素的开发和研究也在不断深入，旨在提供更加安全、有效、方便的治疗方案。
详细描述
目前，新型胰岛素的研究主要集中在两个方面，一是长效胰岛素的研究，旨在减少注射次数，提高患者的依从性； 二是新型胰岛素类似物的研发，旨在提供更加精准的血糖控制。
胰岛素在糖尿病治疗中的应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
胰岛素是治疗糖尿病的重要药物之一，可用于控制血糖、 预防并发症。
对于1型糖尿病患者，由于胰岛素分泌绝对不足，需要依赖 外源性胰岛素来控制血糖。对于2型糖尿病患者，随着病程 进展，胰岛功能逐渐衰退，也需要使用胰岛素来补充治疗 。此外，妊娠期糖尿病患者也需要使用胰岛素来控制血糖 。胰岛素治疗可以有效降低血糖水平，预防和延缓糖尿病 并发症的发生，提高患者的生活质量和预后。
注射部位脂肪增生和脂肪萎缩
长期注射胰岛素的患者可能会出现注射部位脂肪增生和脂肪萎缩的情况，导致胰 岛素吸收不良，影响治疗效果。
为避免这种情况，患者应定期更换注射部位，避免在同一部位反复注射，同时注 意注射技巧和方法，避免过度用力按摩注射部位。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
胰岛素的提取工艺流程
胰岛素的提取工艺流程英文回答：Insulin extraction is a complex process that involves several steps to obtain purified insulin from the pancreas. The process begins with the isolation of the pancreas from an animal source, such as pigs or cows. The pancreas is then minced into small pieces and subjected to enzymatic digestion.During enzymatic digestion, proteolytic enzymes are used to break down the proteins present in the pancreas. This step helps in releasing insulin, which is stored in specialized cells called beta cells within the pancreas. The mixture is then centrifuged to separate the insoluble residue from the soluble fraction.The soluble fraction obtained from the centrifugation step contains a mixture of proteins, including insulin. To separate insulin from other proteins, various purificationtechniques are employed. One commonly used method is ion exchange chromatography, which separates proteins based on their charge properties. Insulin, being a small protein with a specific charge, can be selectively adsorbed onto an ion exchange resin while other proteins pass through.After ion exchange chromatography, the insulin-containing fraction is further purified using techniques such as gel filtration chromatography. This method separates proteins based on their size, allowing for the isolation of insulin molecules from larger proteins. The purified insulin is then subjected to additionalpurification steps, including ultrafiltration and diafiltration, to remove any remaining impurities.Finally, the purified insulin is freeze-dried to obtain a stable powder form that can be easily stored and reconstituted for use. The freeze-drying process involves removing water from the insulin solution under vacuum conditions, resulting in the formation of a dry powder.中文回答：胰岛素的提取是一个复杂的过程，需要经过多个步骤才能从胰腺中获得纯化的胰岛素。
实训 胰岛素的提取分离
实训胰岛素的提取分离［任务描述］胰岛素是哺乳动物胰岛β细胞分泌的蛋白质类激素，胰岛素可以调节糖代谢，减少糖原异生，促进糖原合成，抑制糖原分解，加速葡萄糖的无氧酵解和有氧氧化，促进组织对葡萄糖的利用，并能促进葡萄糖转变为脂肪，是体内主要的降血糖激素，其应用于临床已有70多年的历史，至今仍是治疗糖尿病的首选药物。
胰岛素是一种分子量较小的蛋白质，分子中共有51个氨基酸，由A、B两条肽链组成，A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸，两条肽链之间借两个二硫键联结，A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键。
不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸。
猪胰岛素的相对分子量为5733，牛为5764，人为5784。
动物胰岛素存在一定的免疫原性，可能在人体产生抗体而致过敏反应，另外，动物胰岛素的效价低。
胰岛素为白色或类白色无定形粉末，等电点为5.30～5.35，在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液，在80％以下乙醇或丙酮中溶解，在90％以上乙醇或80％以上丙酮中难溶，在乙醚中不溶。
在酸性环境（pH2.5～3.5）较稳定，在碱性溶液中极易失去活力。
可形成锌、钴等胰岛素结晶，在显微镜下观察呈正方形或偏斜方形六面体结晶。
胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。
高浓度的盐，如饱和氯化钠、半饱和硫酸铵等，可使其沉淀析出；也能被蛋白质沉淀剂如三氯乙酸、苦味酸等沉淀；并有茚三酮、双缩脲等蛋白质的显色反应。
胰岛素能被胰岛素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白质水解酶水解而失活。
胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏胱氨酸和酪氨酸基团。
光氧化作用能导致分子中组氨酸被破坏。
超声波能引起其非专一性降解。
胰岛素能被活性炭、白陶土、氢氧化铝、磷酸钙、CMC 和DEAE-C（二乙胺基乙基纤维素）吸附。
本次实训任务以猪（或牛）的胰脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。
胰岛素的前世今生
怀疑与思考
胰腺是人和哺乳动物很重要的器官，它主要有两种功能。 胰腺分泌碱性的胰液，排入十二指肠，帮助消化脂肪、蛋白质和 碳水化合物，这就是胰腺的外分泌功能。胰腺中还有一种细胞像 小岛一样，不规则地分布在胰腺内，称为胰岛细胞。它能分泌出 胰岛素，透过微血管进入血液。胰岛素的主要功能是调节糖的代 谢，如果胰岛素的分泌量不足，就会得糖尿病。 人们很早就注意到了胰岛素的作用，有人把狗的胰腺切除， 狗就患上了糖尿病。有人口服新鲜的胰腺，想以此来治疗糖尿病， 却毫无结果。 班廷对此百思不解。一天他从图书馆借到了一本新杂志， 其中一篇文章提到了结石阻塞胰导管引起的病变：胰腺中除胰岛 之外全部细胞都萎缩了，但并不发生糖尿病。班廷从中受到启发： 用这种胰腺的提取物，不经口服而注射，一定能治疗糖尿病。口 服之所以无效是胰岛素被消化酵素分解了；萎缩的胰腺不再产生 消化酵素，因此也不必担心胰岛素被破坏了。一种获得胰岛素的 方法立刻呈现在班廷的脑海中，「结扎狗的胰导管，等待六到八 周，使胰腺萎缩，然后用萎缩的胰腺提取液来治疗糖尿病。」
我们每天分泌50单位胰岛素，分量约是胰脏总存量的五分之一。葡萄糖可以在一分 钟内直接刺激胰岛素的分泌。只是无论血糖浓度如何，肾上腺素都会抑制胰岛素的 分泌。所以，人感到压力时，释出肾上腺素，促进糖原生成作用〈glycogenesis〉以 供应大量的葡萄糖，又可抑制胰岛素而维持血糖的高浓度。
学界确立糖尿病与胰岛素分泌的直接关系，在1889年夏天就开始了。当时， 德国境内史特拉斯保大学的两位研究助理梅林〈J.von Mering〉与明考斯基〈O. Minkowski〉受命切除狗的部份胰脏与切除全胰，以比较两者的结果。两批实验狗 只的健康状况，差异甚大。无胰犬虚弱不堪，又常排尿；奇怪的是尿液吸引了无数 苍蝇。经分析，这些尿含糖量高，相似于糖尿病人所排出的。 其后二十年间，有 许多研究者想从胰中找寻能够抑制糖尿的物质，却没有成功。原因是方法不对，他 们不知道，关键性的胰岛素在分离过程中被破坏了。
胰岛素 生产工艺
胰岛素生产工艺
胰岛素的生产工艺可以分为以下几个步骤：
1. 获取胰岛素原料：胰岛素原料一般是由动物胰腺组织提取得到，通常使用猪胰腺或牛胰腺作为原料。
2. 组织处理：将胰腺组织进行清洗，去除杂质和血液。
3. 组织震碎：将清洗后的胰腺组织进行细胞破碎处理，可以使用切割机、搅拌机或超声波方法进行。
4. 酶解和提取：将震碎的胰腺组织加入酶解液中，在适当的温度和pH条件下进行胰岛素的酶解反应，使胰岛素释放出来。
5. 精制和纯化：通过离心、过滤、膜分离等技术，去除胰岛素溶液中的杂质。
可以使用超滤、逆渗透和钙化等方法进行精制和纯化。
6. 结晶和干燥：将精制的胰岛素溶液进行结晶处理，得到胰岛素晶体。
然后将晶体进行干燥，去除余留的溶剂，得到干燥的胰岛素。
7. 包装和贮存：将干燥的胰岛素进行包装，通常使用瓶装或制成注射剂进行包装。
然后进行质检和标签贴附，最后储存和配送。
需要注意的是，胰岛素的生产工艺可能会因不同的制造商和产品类型而略有差异，但以上步骤是一般的胰岛素生产工艺。
生物分离提取技术项目一：从猪胰脏中提取胰岛素任务3胰岛素的提取及固液分离教案教学设计
1.掌握胰岛素提取的原理和方法
2.掌握常用提取剂的种类和性质。
能力目标：
1.能够采用正确的方法提取胰岛素并完成固液分离。
2.能够正确使用设备。
3.能够维修、维护设备。
素质目标：
1.认真的工作态度。
2.积极主动的学习意识。
3.良好的团结协作精神。
4.设备使用过程中的安全意识。
重点难点：胰岛素提取
胰岛索是一种分子量较小的蛋白质激素，其基本结构单位（单体）分子量近6000，其二聚体分子量为12，000，由四个多肽键链以六个二硫键相连结而成。其中含胱氨酸约占12%，胰岛素的生理效能与此种氨基酸中二硫键有着极密切的关系，任何一个二硫键断裂都能使胰岛素失去活力。
因胰岛素属于蛋白质，所以它具有一般蛋白质性质。近数十年来国内外生产胰岛素的方法主要有两种：一是“减压浓缩法”；另一种是“乙醚沉淀法”，即是将酸性乙醇提取液经过初步提纯后用大量乙醚将胰岛素沉淀下来，然后制成纤维状胰岛素再精制成结晶。由于以上两种方法均不甚理想。近年来又在探索新的制备方法，其中以“海藻酸吸附法”较为成熟，我国亦试制成功，但用于工业生产上，还须进一步改进。在实际生产中，中国目前仍用“减压浓缩法”，现将“减压浓缩法”生产胰岛介绍如下：
课程《生物分离提取技术》2022/2023 学年第1学期 教师课程组
授课日期
班 级
项目一：从猪胰脏中提取胰岛素
任务1：猪胰脏的低温贮存
任务2：胰脏的组织捣碎及细胞破碎
任务3：胰岛素的提取及固液分离
任务4：胰岛素的纯化
任务5：胰岛素的浓缩
任务6：胰岛素的结晶与干燥
课 题：胰岛素的提取及固液分离
教学目标：
提取粗制品：
将新鲜或冰冻猪胰（牛胰更好）除去结缔组织等杂质，绞碎成冰胰浆。称重量置提取罐中，加入1．5～2．0倍量的酸性酒精溶液，使PH为2．5～3．0，醇含量为70%左右，在温度为13～150℃搅拌提取3h,压滤，使浸液尽量滤出。残渣再用上法提取一次。
胰岛素的发现史
2020年11月14日是胰岛素发现人班廷诞辰129周年纪念日，也是世卫组织和国际糖尿病联盟为纪念班廷而确定的世界糖尿病日。
小编在此特梳理胰岛素发现的过程，作为纪念。
前人研究奠定基础1.1869年德国病理学家保罗•兰格尔翰斯（Paul Langerhans，1847-1888）发现了胰岛，胰岛因而得名“Islets of Langerhans”，彼时保罗认为这是一种神经细胞。
2.1910年，英国生理学家Edward Albert Sharpey-Schafer（1850-1935）经过研究，提出糖尿病人是由于缺乏胰腺在正常状态下分泌的一种物质所导致，他将这种物质命名为Insula。
3.在胰岛素真正被发现之前，糖尿病是一种广泛存在而且极具死亡威胁的疾病，病人只能采取饥饿疗法，这种疗法是否有效并不清楚，但病人别无选择。
与此同时，众多科学家试图从胰腺中提取胰岛素，但是都以失败告终，因为胰岛素会随着胰腺的破坏被消化酶破坏。
班廷（Frederick Grant Banting，1891-1941）登场：初生牛犊不怕虎故事到这里，主角开始登场。
1917年，弗雷德里克•班廷刚刚从多伦多大学毕业，此时正值一战，班廷应召入伍奔赴法国前线。
战争中班廷英勇负伤，被医生建议截肢，倔强的班廷没有答应，最终反而痊愈。
战争结束后，班廷回国却找不到像样的工作，只能开了一家小诊所同时在一家医学院兼课勉强度日。
1920年，班廷在备课时看到一份病例报告，发现一个病人因为胰脏导管被结石堵塞，分泌消化酶的消化腺萎缩，但胰岛细胞依然存活良好。
班廷感到大受启发，如果手术结扎动物导管，等到消化腺萎缩岂不是就可以提取具有活性的胰岛素了！班廷踌躇满志，毅然关掉诊所辞掉兼职教师的工作，回到母校多伦多大学寻求糖尿病权威麦克莱德（JohnMcLeod，1876-1935）教授的资源支持。
麦克莱德教授对面前年轻人的想法不以为然，但经不住后者的软磨硬泡，最终同意在自己外出讲学的八周时间里使用自己的实验室，并派给他一个年轻的助手查尔斯•贝斯特，另外还有10条狗作为实验材料（麦克莱德实验室具有建立糖尿病狗模型的技术）班廷立刻按照之前的想法进行实验：首先进行胰脏导管结扎手术，等到消化腺萎缩，摘取胰脏进行提取。
胰岛素的分离纯化及其质量检测
胰岛素的分离纯化及其质量检测通过比较发现，离子交换树脂法为提取胰岛素最佳方法，但该法成本高，所用材料的花费及产物得率不平衡，而酸-醇提取减压浓缩法能做到最大地节约成本和带来经济效益，所以投入同样的费用和精力，酸-醇提取减压浓缩法所获得的经济效益最大。
因此，对于提取胰岛素来说，最好的方法就是酸-醇提取减压浓缩法。
1.具体操作方法【1】(酸-醇提取减压浓缩法)：（1）称取冰胰块100g，用组织捣碎机刨碎，加86%乙醇230ml和5%草酸230ml，在10-l5℃搅拌提取3h，用纱布过滤，留滤渣，滤液在4000r/min下离心5min，取上层清液。
滤渣再用115ml的68%乙醇和115ml0.4%草酸提取2h，同上法操作。
合并两次乙醇提取液。
（2）在l0-l5℃下不断搅拌提取液并加入浓氨水调pH8.0-8.4，立即进行压滤，除去碱性蛋白，此时滤液澄清，及时用硫酸酸化至pH3.6-3.8，并降温至5℃，静臵4h，使酸性蛋白充分沉淀。
（3）吸上层清液至另一烧杯中，下层用帆布过滤，弃去沉淀物。
滤液并人上清液，在30℃以下真空抽滤以除去乙醇，浓缩液体积约为原体积的1/9-1/10。
（4）浓缩液转入坩埚内于5min内加热至50℃，立即用冰盐水(20%NaCl溶液)降温至5℃，静臵3-4h，用分液漏斗分离出下层清液(脂层可回收胰岛素)。
用4mol/L的HC1调至pH2.3-2.5，并于20-25℃搅拌下加人27%固体氯化钠，保温静臵12h。
析出之盐析物为胰岛素粗品。
（5）盐析物称干重为27.3mg，加人200ml蒸馏水溶解，再加入10ml的冷丙酮，之后用4mol/L氨水调pH4.2-4.3，然后补加丙酮50ml，使溶液中水和丙酮的比例为7:3。
充分搅拌后低温放臵过夜，使溶液冷至5℃以下，次日在低温下离心分离。
（6）在滤液中加入4mol/L氨水使pH为6.2 -6.4，加入3.6%的醋酸锌溶液，此时溶液浓度为20%。
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1.1.3 胰岛素重大研究发展历程 1788年 人们就发现了糖尿病的产生于胰功能的破坏有 密切关系； 1922年起，开始将胰脏中获得的胰岛素应用于临床； 1926年首次从动物胰脏中提取到胰岛素结晶。是第一个 有生物活性的蛋白质结晶； 1955年阐明胰岛素序列的一级结构； 1965年9月17日，中国首次完整人工合成了结晶牛胰岛 素； 1970年用X衍射方法阐明了空间构型，为人工合成蛋白 质、探索生命奥秘做出了重大贡献； 1982年世界上第一个生物技术医药产品——DNA重组 人胰岛素上市，也是第一个基因工程药物产品。
目前,国际上生产医用重组人胰岛素( recombinant human insulin, rh I)的方法主要有3种:
1)用基因工程大肠杆菌( Escherichia coli, E. coli)分别发酵 生产人胰岛素( human insulin, hI)的A、B链,然后经化学再 氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。这 一方法缺点较多,目前已较少使用。 2)用基因工程E. coli发酵生产人胰岛素原( human proinsulin, hP I) ,后经加工形成hI。E. coli系统表达量高,但缺点是不利于 表达h I这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI 连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加 工才能形成有活性的hI; 3)通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成hI。酵母系 统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期 长,且重组蛋白分泌量少(1～50 mg/L) ,产量低。
胰岛素能被胰岛酶、胃蛋白酶、糜蛋白 酶等蛋白水解酶水解而失活。因胰岛素通常 只能注射给药。即使这样，在血液和组织中 也能被水解，所以药物作用时间较短。当与 鱼精蛋白或珠蛋白形成复合物或制成难溶解 的结晶，即能延长药效。
美国基因工程技术公司，简称基因泰克，是由风险投资家 Robert A. Swanson和生物化学家Herbert Boyer博士于1976创 立的生物技术公司，被认为是生物技术行业的创始者。创始人 Boyer博士，是DNA重组技术先驱者。1973年，Boyer和同事 Stanley Cohen用限制酶从DNA分子剪下需要的片段连接到质 粒上。1977年，公司制造出荷尔蒙生长抑制素；1978年，公 司合成了人类胰岛素。 1980年，基因工程技术公司上市，一 个小时内每股从35美元剧涨至88美元，公司的身价因此激增至 3500万美元。这一事件是股市涨幅最大的案例之一。1982年， 第一种DNA重组药品市场化：人工胰岛素。（EliLilly and Company得到特许权。） 2008年3月，基因泰克拥有超过 11,000名雇员，首席执行官是Arthur D. Levinson。瑞士罗式制 药集团在2009年3月26日出资约468亿美元全额收购了该公司 。
可植入闭环式泵由于更接近正常人体的胰岛素 分泌并能克服开环式泵需24h体外随身携带等缺点， 已成为该制剂的研发方向，其关键是如何突破血糖 传感器生物兼容性等技术关键
要使口服药成为现实的关键在于制备过程中如 何保持其生理活性，稳定胰岛素的构型，如何减少 胰岛素分子多聚体的形成，促进胰岛素在小肠的吸 收，如何减轻消化酶对胰岛素的破坏作用，以及如 何选择有机溶剂从而减少胃肠道的毒副作用。
胰岛素的一级结构
由51个氨基酸残基组成 分两条链：A链：21个氨基酸残基 B链：30个氨基酸残基 含三个二硫链：一个A链内的二硫键 两个链间二硫键
在各种动物的胰脏中，胰岛素的含量有些差异，牛、猪、 马、羊新鲜胰脏组织中分别含有胰岛素2.5、3.0、1.5、 10U/g。同一种动物不同发育阶段，其含量也有较大差 别。
胰岛素在pH为4.5-6.5范围内，几乎不溶水， 在室温下溶解度为10μg/m丙酮中溶解；在90%以 上乙醇或80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。
胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应：高浓度的 盐（如饱和氯化钠、半饱和硫酸铵溶液）可使其 沉淀析出，也能被蛋白质沉淀剂和三氯醋酸等沉 淀，并有茚三酮、双缩脲等蛋白质的显色反应。
1.1.4 胰岛素性质 胰岛素为白色或类白色粉末结晶。由于精 制方法不同，在显微镜下观察，可分两种形 态，一种为不规则细微颗粒，称“无定型”， 另一种为扁斜型六面体。 牛胰岛素分子量为5733，猪胰岛素分子量为 5761，人胰岛素分子量为5781。胰岛素等电点 为5.30-5.35,。因蛋白质等电点随溶液的离子强 度及离子性质不同而有所变化，因此在生产实 践中分离，精制或结晶时采用的等电点并不一 定正好是此值。
项目一：猪胰脏中胰岛素的提取
1.1 胰脏中胰岛素的分离提取背景知识
1.1.1 胰岛素结构及来源 1.1.2 胰岛素分类 1.1.3 胰岛素重大研究发展历程 1.1.4 胰岛素性质
1.1.1 胰岛素结构及来源
胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是由胰岛β细 胞分泌的。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物 质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的 激动而分泌的一种蛋白质激素。
表：一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异
名称
人
A8
苏氨酸
A9
丝氨酸
A10
异亮氨 酸
B30
苏氨酸
与人的 差异数
-
活性
猪
抹香鲸 马 象 牛
丙氨酸
甘氨酸 甘氨酸 缬氨酸 缬氨酸
丙氨酸
丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸
1
1 2 2 3 ↓ ↓ ↓
1.1.2 胰岛素分类 目前开发应用的胰岛素品种很多，有多种分类方法。 胰岛素制剂可根据胰岛素来源、制备工艺、作用时间 长短等来进行分类。 1、按来源分类：猪胰岛素、牛胰岛素、人胰岛素 2、根据制备工艺分类：提取胰岛素、半合成胰岛素、 生物合成人胰岛素及人胰岛素类似物（长秀霖、速秀 霖） 3、按纯度分类：普通胰岛素（结晶胰岛素）、单峰胰 岛素及单组分胰岛素（高纯度胰岛素）。 4、按起效时间分类：速效胰岛素、中效胰岛素、长效 胰岛素及混合胰岛素。 5、根据制剂性状分类：溶液型和混悬腥。 6、根据给药装置分类：注射式和非注射式。