流式细胞 flow cytometry
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术原理及方法
流式细胞技术（Flow cytometry）是一种用于检测和分析细胞的高通
量技术，能够同时分析多种细胞参数。
其原理是通过将单个细胞悬浮液通
过一个细长管道，然后通过激光束照射细胞并记录细胞与激光的相互作用，最后用多个光学信号检测器来收集和分析这些信息。
细胞排序是流式细胞技术的第二步。
流式细胞仪可以根据不同的细胞
参数，如大小、形状和荧光强度等对细胞进行排序。
这种方法可以根据用
户的需求，选择性地分离和收集一些细胞亚群，进一步进行下一步的实验
分析。
数据分析是流式细胞技术的最后一步。
流式细胞仪会收集大量的数据，包括荧光信号的亮度和位置等信息。
这些数据通常以直方图的形式呈现，
可以通过专业的分析软件进行解析和统计分析。
数据分析可以帮助研究人
员确定细胞亚群的比例、亚群之间的差异和相似性等信息。
流式细胞技术在许多领域中被广泛应用。
在免疫学研究中，流式细胞
技术可以用来分析和鉴定免疫细胞亚群，如T细胞、B细胞和巨噬细胞等，以及它们的功能状态和表达的分子。
在癌症研究中，流式细胞技术可以用
来检测肿瘤细胞和癌症干细胞，以便进行诊断和预后评估。
在生物医药研
究中，流式细胞技术可以用来评估各种药物对细胞表型、凋亡和增殖等影
响的研究。
综上所述，流式细胞技术是一种强大的细胞分析方法，能够同时检测
和分析多种细胞参数。
这种技术的原理和方法相对复杂，但其在生物医学
研究和应用中具有广泛的应用前景。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种用于分析和计数溶液中单个细胞的技术。
它结合了细胞生物学、免疫学和光学原理，可以对细胞的形态、大小、表面标记物、细胞内分子和细胞功能进行高度灵敏和高通量的检测。
流式细胞术在医学研究和临床诊断中被广泛应用，例如免疫表型分析、癌症诊断、染色体分析和细胞周期分析等。
流式细胞术的基本原理是将细胞溶液通过一个微小的流动池，细胞在流动池中被依次单个地通过一个激光束，同时检测和测量细胞的荧光信号和散射光。
这里主要介绍基于光散射和荧光信号的流式细胞术原理。
光散射是指细胞与入射光发生相互作用后，在各个方向上散射出的光。
光散射信号主要包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
前向散射光与细胞的大小相关，大细胞产生强烈的散射信号，小细胞产生较弱的散射信号。
侧向散射光与细胞的内部复杂性和粒子的复杂性相关，比如细胞的细胞器、蛋白质聚集体和细胞颗粒等。
荧光信号是基于染料的荧光分子在光激发下发射出的荧光信号。
细胞表面的抗原可以通过荧光标记的抗体进行特异性检测。
荧光染料可以与抗体结合，并通过激光的作用激发染料分子，产生荧光信号。
通过使用不同波长的激光器和荧光探针，可以同时检测多个不同的荧光信号。
为了实现对不同细胞类型的准确检测和计数，流式细胞仪使用光学系统和电子学系统进行信号采集和处理。
光学系统包括激光器、光学滤镜和光电二倍频管（PMT）。
激光器产生高能量、单色的激光束，通常使用激光器输出的可见光波长，如蓝色（488nm）、绿色（532nm）和红色（633nm）等。
光学滤镜用于选择和隔离特定波长范围的光信号。
PMT是用来接收荧光信号和散射光信号的光电器件，能够将光信号转换为可计量的电信号。
电子学系统包括脉冲幅度分析器、数据采集系统和计算机。
脉冲幅度分析器将接收到的电信号转换为数字信号，并分析信号的幅度、持续时间和频率等参数。
数据采集系统将脉冲信号转换为数字数据，并存储在计算机中。
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理流式细胞技术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的高效分析方法。
其原理基于光学技术和细胞自动排序系统，可以对大量细胞进行快速、高效的分析和分类。
以下是流式细胞技术的原理介绍。
首先，细胞需要经过处理步骤，使其适合流式细胞技术的操作。
这包括剥离细胞、制备单细胞悬浮液、染色等。
常用的染色方法包括细胞外标记和细胞内染色。
细胞外标记是将特定的抗体或荧光标记结合于细胞表面的分子上；而细胞内染色则是将特定的抗体或荧光染料引入细胞内。
接下来，染色后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，由涡旋泵将细胞悬浮液排列成单个细胞在流体中依次通过的单个小流液管，即样品管。
激光束经过透镜系统被聚焦至小流液管中，而小流液管的流体流速由电子流变计控制。
当细胞通过激光束时，光在细胞上发生散射。
根据细胞对激光光线的散射特性，可以将散射光信号分为前向散射光（Forward Scatter，FSC）、侧向散射光（Side Scatter，SSC）和反向散射光（Back Scatter）。
前向散射光与细胞大小和形态有关；侧向散射光与细胞内质量和颗粒数量相关；反向散射光较少用于细胞分析。
此外，染色后的细胞还能发射荧光信号。
流式细胞仪通过不同波长的激光器来激发染料或抗体标记的荧光信号。
细胞上标记的荧光分子在激发光照射下发出特定波长的荧光信号，这些信号被探测器收集。
常用的荧光染料有FITC、PE、APC等。
激发信号和荧光信号会被流式细胞仪上的多个探测器收集，并转化为电信号。
将电信号转化为数字信号后，可以得到散射图和荧光直方图。
散射图通过前向散射光和侧向散射光来反映细胞的大小、形态和复杂性。
荧光直方图则反映了细胞上特定荧光分子的存在和表达程度。
最后，通过流式细胞仪的计算机软件进行数据分析。
该软件可以根据荧光信号的大小和形状，对细胞进行分类和定量分析。
同时，流式细胞仪还可以使用特定门控技术（Gating）来筛选掉不感兴趣的细胞亚群，提高检测的准确性。
流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理
FL-2(-)
FITC 单标
FL2 - %FL1
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
PE 单标
FL-2(PE)
FL1 - %FL2
FL-2(PE)
After Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(-)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
非特异性染色
抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。
同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同 种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非 特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。
实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体; 同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。
侧向散射光SSC
SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用1. 引言流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术。
通过使用流式细胞仪，可以对生物细胞进行快速、精准的多参数分析，为科学家和医生提供了大量的有关细胞的信息。
流式细胞术已成为生物学领域的重要工具，被广泛应用于细胞分析、免疫表型分析、药物筛选等领域。
2. 原理流式细胞术基于细胞在封闭流动系统中单个通过的原理。
其基本流程包括样本制备、细胞标记、细胞检测和数据分析。
2.1 样本制备样本制备是流式细胞术的第一步，它需要将待检测的细胞样本制备成单细胞悬浮液。
这可以通过细胞培养、组织切片或体液等方式获得细胞样本。
重点是要避免细胞凝聚和聚集，以确保细胞在流式细胞仪中单个通过。
2.2 细胞标记细胞标记是流式细胞术的关键步骤之一。
它使用荧光染料或抗体等标记物与目标细胞发生特异性反应。
荧光染料可以通过不同的通道发出不同波长的荧光信号，从而实现多参数分析。
细胞表面标记的抗体通常与荧光素共价结合，以产生可检测的荧光信号。
同时，可以利用染料进行细胞内部器官或分子的标记，以更详细地研究细胞的功能和结构。
2.3 细胞检测细胞检测是流式细胞术中最关键的步骤之一。
它通过流式细胞仪将标记后的细胞悬浮液以单个细胞的形式通过单个检测区域。
这些细胞在流式细胞仪中被激活并产生荧光信号。
光电传感器将捕获和记录这些荧光信号，并将其转化为数字信号，供数据分析使用。
2.4 数据分析数据分析是流式细胞术的最后一步。
通过对获得的荧光信号的数字化处理，可以获得有关细胞的详细信息，包括细胞表面标记物的表达水平、细胞数量统计、细胞大小等信息。
数据分析可以使用专业的流式细胞仪软件完成，也可以使用其他数据分析软件进行更复杂的数据处理。
3. 应用流式细胞术作为一种全面、高通量的细胞分析技术，广泛应用于各个领域。
3.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中得到了广泛应用。
通过对免疫细胞的表面标记物进行检测，可以评估免疫细胞亚群的数量、功能和表达水平。
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理介绍流式细胞技术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物学、医学和临床研究的分析技术。
它通过激光和光学系统对细胞进行高通量、高灵敏度的单细胞分析，能够实时监测并分析细胞的生理状态、表型特征、功能及亚细胞水平的分子表达。
流式细胞技术不仅可以用于细胞表面标记物的鉴定、表型分析等，还可以对细胞内蛋白质、DNA、RNA等进行定量测量，为科学家提供了大量有关细胞的宝贵信息。
流式细胞技术原理光学系统流式细胞技术的关键是其光学系统。
它由激光光源、光学镜头、光学滤光片、探测器等组成。
1.激光光源：常用的激光包括氩离子激光器、氦氖激光器等。
激光的主要作用是提供高强度、单色、聚焦的光源。
2.光学镜头：流式细胞仪使用透镜或反射镜将激光束聚焦在样品上，使得细胞能够接受到足够强度的光。
3.光学滤光片：为了区分不同荧光信号，流式细胞仪通常使用多个滤光片。
这些滤光片根据特定的波长和波长范围选择通过或阻挡光信号。
4.探测器：流式细胞仪通常配备多个探测器，以收集经滤光片过滤后的光信号。
常见的探测器包括光电倍增管和光电二极管。
流式细胞仪工作原理流式细胞仪将细胞悬浮液通过微细管道引导经过激光束。
细胞依次通过激光束，激发细胞中的荧光分子，产生荧光信号。
这些荧光信号由探测器收集并转换为电信号，最终生成细胞数据。
流式细胞仪的工作原理可分为三个步骤：步骤一：细胞进样将细胞悬浮液加入流式细胞仪装置，通过压力或重力等力作用下，细胞在微细管道中流动。
在流动过程中，细胞保持单个或少数细胞同时通过激光束。
步骤二：激发和荧光收集细胞在激光束下通过时，激光光源激发细胞中的荧光分子。
这些荧光分子发出一定波长的荧光信号。
探测器收集这些荧光信号并转换为电信号。
步骤三：数据分析流式细胞仪获取的电信号被送入计算机进行数据分析。
通过电子学、光学系统和计算机系统的协同工作，可以得到关于细胞表型、免疫细胞亚群等信息。
流式细胞技术的应用细胞表型分析流式细胞技术可以用于细胞表型的研究。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞术检测原理
流式细胞术检测原理
流式细胞术（Flow cytometry）是一种基于细胞染色技术和流体动力学原理的分析仪器，主要用于分离、分析和检测细胞、微生物等样品中的细胞数量、大小、形态和生理状态等多项指标。
其检测原理是将样品中的细胞单独定位在精密的光学系统中，使用非常短的激光脉冲从而观察分析细胞。
在流式细胞术中，样品先进行预处理，以使细胞单独存在、不会聚集在一起或堵塞孔口。
细胞溶液被引入流式细胞术仪器的液体流管中，快速流动，并在途中被一个激光束所照射。
激光光束穿过流动的细胞，使得其中的染料激发并发出荧光，荧光信号被称为荧光强度。
检测系统会收集荧光信号，并将其转换为电信号，接着将诸如细胞大小、荧光强度和复杂度等信息转换为数字数据。
最终，所有这些数据都被存储在计算机中，可与之前的数据进行比较分析，从而获得关于细胞的详细数据信息。
流式细胞术检测原理能够检测出许多细胞特征，可以广泛用于细胞生物学、免疫学、癌症学等领域。
在医学、疾病诊断和治疗上有着广泛的应用价值。
流式细胞术的原理
流式细胞术的原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过检测细胞在流动状态下的物理和化学特性来进行分析和分类的技术。
它是一种高通量、高灵敏度的细胞分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
本文将介绍流式细胞术的原理及其在生命科学研究中的应用。
首先，流式细胞术的原理是基于光学原理的。
当细胞悬浮液通过流式细胞仪时，它们会被单个地吸引到一束激光光束中。
这束光会激发细胞中的荧光染料或荧光标记抗体，使其发出荧光信号。
流式细胞仪会同时检测细胞的散射光和荧光信号，通过这些信号可以得到有关细胞大小、形状、表面标记物等信息。
因此，流式细胞术可以实现对数以千计细胞的高速分析，从而为生物学研究提供了强大的工具。
其次，流式细胞术的原理还涉及细胞分类和计数。
通过流式细胞仪可以对细胞进行精确的分类和计数，这对于研究细胞的表型和功能非常重要。
通过选择不同的荧光标记物，可以实现对不同类型细胞的鉴定和分类，从而为疾病诊断和治疗提供重要依据。
此外，流式细胞术还可以用于研究细胞的功能和活力。
通过检测细胞内的荧光信号强度和分布，可以了解细胞的代谢活性、蛋白质表达水平等信息。
这对于研究细胞的生物学特性和疾病机制具有重要意义。
最后，流式细胞术在生命科学研究中有着广泛的应用。
它可以用于免疫学研究，如免疫细胞表面标记物的鉴定和分析；用于肿瘤学研究，如检测肿瘤细胞的表型和数量变化；用于细胞生物学研究，如细胞周期和凋亡的研究等。
此外，流式细胞术还在临床诊断、药物筛选和药效评价等领域有着重要的应用价值。
总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度的细胞分析技术，其原理基于光学原理，可以实现对细胞的精确分类、计数和功能分析。
它在生命科学研究中有着广泛的应用前景，为科学家们提供了强大的工具，促进了生命科学领域的发展和进步。
flowcytometry
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
CBA(Cytometric Bead Array)
Traditional Analysis -- Percent positive
5）网织红细胞计数 6）白细胞分类计数
第七节 其他应用
溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。
第八节 细胞分选
FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞 中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞 的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式 一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同 则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以 上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、 分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集 胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可 用于基因诊断。
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展
流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展一、本文概述流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）作为一种先进的细胞分析技术，自其诞生以来，在生物医学领域发挥了重要的作用。
本文旨在全面概述流式细胞仪的发展历史，深入剖析其基本原理，以及探讨其在不同领域的应用进展。
我们将从流式细胞仪的初步概念出发，追溯其技术的演进过程，分析其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域的应用实例，并展望未来的发展趋势。
通过对流式细胞仪的深入研究，我们希望能够为相关领域的研究人员提供有价值的参考，推动流式细胞仪技术的进一步发展。
二、流式细胞仪的发展历史流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速测量和分析细胞特性的高科技仪器。
自其诞生以来，流式细胞仪在生物医学研究领域发挥了重要作用，其发展历史可追溯至20世纪60年代末。
1965年，美国科学家Wallace H. Coulter首次提出了流式细胞仪的基本概念，并设计出了第一台原型机。
这台机器利用了液流原理和荧光检测技术，可以对单个细胞进行快速、定量的分析。
1970年，Coulter Science公司正式推出了世界上第一台商用流式细胞仪，标志着流式细胞技术的诞生。
随着科技的进步，流式细胞仪在随后几十年中经历了不断的改进和创新。
在硬件方面，流式细胞仪的激光源从最初的单一波长发展到多波长，甚至引入了紫外、红外等多种激光，使得可以同时检测多种细胞参数。
在软件方面，数据分析和处理能力得到了显著提升，可以实现对大量数据的快速、准确分析。
流式细胞仪的应用领域也不断拓宽。
从最初的免疫学研究，到现在的肿瘤学、细胞生物学、分子生物学等多个领域，流式细胞仪已经成为了不可或缺的研究工具。
随着单细胞测序技术的发展，流式细胞仪与单细胞测序技术的结合，为深入研究细胞异质性和疾病发生机制提供了新的手段。
流式细胞仪的发展历史是一部科技进步的缩影。
从最初的原型机到现在的多功能仪器，流式细胞仪在硬件、软件和应用领域都取得了显著的进步。
小鼠记忆细胞t细胞流式
小鼠记忆细胞t细胞流式
流式细胞术（Flow Cytometry）是一种在细胞水平上进行单细胞分析的技术，广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学等领域。
在小鼠的记忆T细胞研究中，流式细胞术可以用来检测和分选记忆T细胞。
记忆T细胞是免疫系统的重要组成部分，它们可以在再次遇到相同抗原时快速增殖并发挥免疫效应，从而保护机体免受病原体的侵害。
记忆T细胞的检测对于理解免疫应答的机制和开发新的免疫疗法具有重要意义。
在进行小鼠记忆T细胞流式分析时，首先需要对小鼠进行免疫刺激，使得记忆T细胞活化并表达特定的表面标记。
然后，通过流式细胞术对小鼠的脾脏或淋巴结等进行单细胞悬液制备，并通过荧光标记的抗体对记忆T细胞进行染色。
最后，通过流式细胞仪对细胞进行逐个检测，根据细胞表面标记物的表达情况对记忆T细胞进行分选和分析。
流式细胞术的优点在于它可以快速、准确地从大量的细胞中分选出特定的细胞亚群，而且可以对每个细胞进行多个参数的分析，从而得到丰富的信息。
然而，流式细胞术的操作过程较为复杂，需要专业的技术和设备，而且成本也相对较高。
总的来说，流式细胞术是一种强大的工具，它在记忆T细胞的研究中发挥着重要的作用。
通过流式细胞术，我们可以更好地理解和利用记忆T细胞，为免疫学研究和免疫疗法的发展提供重要的基础。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞
写在课前的话流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。
它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。
一、流式细胞术概念(一) 概念流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。
研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。
目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。
(二) 流式细胞术的特点1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。
2. 准可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。
3. 精通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。
（三）流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM ）操作流程流式细胞术的操作流程简单概括为：培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织、骨髓、外周血、脱落细胞等不同类型的样品。
首先制备成单细胞悬液后，再经过荧光染色就可以上机进行检测。
如果需要分选，可以通过细胞分选把感兴趣的细胞分选出来进行进一步培养或者进行其他生物学行为的研究。
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术（Flow cytometry）是一种被广泛用于生物学和医学领域的细胞分析和排序技术。
该技术采用激光离子流和散射光学的原理，快速测定单个细胞的生物学和物理特性。
该技术不仅可以进行细胞计数、大小、形态特征、表面结构、细胞周期、代谢活性、细胞分化和生长状态等分析，还可以进行单细胞分选和纯化以及细胞染色体分析等研究。
基本原理流式细胞术的原理是通过射流将单个细胞迅速送入激光束中，该激光束激发细胞中的荧光染料和标记物或散射光学特性，进而检测细胞的光学信号，并进行信号转换和数字化处理，最终得到单个细胞的特异性指标。
流式细胞术的主要组成部分包括样品处理系统、流式细胞分析系统和数据分析系统。
样品处理系统：将细胞样品经过预处理、染色或标记，使其适用于流式细胞分析。
常用的样品预处理方法包括：细胞分离、染色、去除细胞碎片和去除红细胞等。
对于需要分选的细胞，还需要使用细胞排序技术分离目标细胞。
流式细胞分析系统：该系统包括激光、光电倍增管、光学透镜、光学滤波器、样品输送系统和电子系统等。
通过激光激发样品中的荧光染料或标记物，分析细胞的光学特性。
常用的荧光染料包括：FITC、PE、APC、PerCP、Cy5等。
常用的标记物包括：抗体、细胞因子、小分子荧光探针、DNA荧光探针等。
通过修改流式细胞分析仪的配置，可实现不同荧光染料和标记物的测定。
数据分析系统：流式细胞仪测定数据的处理和分析是采用计算机系统完成的。
数据分析的常用指标包括：细胞计数、细胞孔径（大小）、荧光强度（比例和强度）、散射特性等。
一般情况下，在细胞的某个特定荧光标记物上测定的强度与其他群体相比，该指标被用来区分并描述细胞。
流式细胞术的应用流式细胞术被广泛应用于生物医学研究和诊断中。
以下是一些常见的应用领域：1. 分析细胞表面和胞内蛋白表达：通过荧光共轭的抗体和标记物来测定单个细胞膜和胞内蛋白的表达量和分布，从而确定细胞分化状态和生理状态。
流式细胞仪行标
流式细胞仪行标
流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是一种用于分析和分离活细胞的实验室技术。
它可以用来测定细胞的大小、复杂性（颗粒度）、内部荧光强度以及细胞表面或内部的特定分子标记。
流式细胞仪的工作流程大致包括以下步骤：
1. 样本制备：首先需要将细胞样本制备成单细胞悬液，并加入荧光染料或抗体以标记目标分子。
2. 染色：细胞悬液与荧光标记的抗体或染料混合后，孵育一段时间以使标记物结合到目标细胞上。
3. 样本加载：经过染色的细胞样本通过流式细胞仪的样本输入系统，通常是一个细管，称为流道。
4. 液流形成：细胞样本被雾化成单个细胞的液滴，这些液滴通过流道以一定速度流动。
5. 激光照射：流动中的细胞逐个经过激光束的照射。
激光激发细胞内或表面的荧光标记，使其发出光信号。
6. 信号检测：流式细胞仪配备有光电探测器，用来检测细胞发出的光信号。
每个细胞产生的信号被转换为电信号，并记录下来。
7. 数据分析：收集到的信号被计算机系统分析，根据细胞的荧光强度和散射光特性，可以得到细胞的各种参
数，如细胞大小、颗粒度、细胞膜和胞内分子的表达水平等。
8. 数据呈现：分析结果通常以二维图表（如前向散射与侧向散射图、荧光强度直方图）或三维/四维图表的形式展现，便于研究者进行进一步的数据解读和实验设计。
流式细胞仪广泛应用于免疫学、肿瘤学、细胞生物学等领域，对于疾病诊断、细胞分选、功能性研究等方面有着重要作用。
通过精确地测量和分析细胞的物理和化学特性，流式细胞仪能够提供关于细胞状态和功能的丰富信息。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术（flow cytometry）是一种常用的细胞分析和分选技术，通过对悬浮细胞进行连续的、高通量的单细胞多参数分析，能够准确地获得细胞的多种信息，如大小、形态、表面标记物、蛋白质表达水平、细胞周期等。
流式细胞术的原理基于光学系统和流式细胞仪的相互配合。
其基本原理如下：1. 细胞样品制备：将待分析的细胞样品进行预处理，如去除细胞碎片、异物、血细胞混杂等，使其成为适合流式细胞仪分析的单细胞悬浮液。
2. 光源和染料：流式仪器利用一束单色、高能、激光光源对悬浮细胞进行照射。
细胞内染料的选择取决于研究目的，如荧光染料可用于标记特定蛋白质、细胞器或细胞表面受体。
3. 光学系统：经过光源照射后，激光光线经过特定的滤光片进行滤波，以选择特定波长的荧光信号。
光线通过一个透镜经过流式细胞仪的进样通道瞬间击中正在流动的细胞。
击中细胞的激光光线会被散射，产生前向散射光和侧散射光。
4. 散射光检测：前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）是流式细胞仪最基本的检测参数。
FSC反映细胞的大小和形态，SSC则反映细胞的复杂度和内部结构。
5. 荧光信号检测：流式细胞仪在经过细胞后会收集产生的荧光信号。
通过特定的荧光滤光片，选择出目标染料所发射的波长范围，并通过光电倍增管转化为电信号。
这些电信号被记录下来，并转化为数据。
6. 数据分析：流式细胞术生成的数据会在计算机中进行分析和解读。
通常会用分析软件对荧光信号进行解析，进一步分析细胞表型、蛋白质表达、细胞周期等信息。
通过上述原理，流式细胞术能够快速准确地进行细胞的高通量分析和分选，为生物学、医学等领域的研究提供了重要工具。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1: 一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光（强度或类别）进行分选或分析。
应用学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
笊満膨倉卅号、划声股需器r」进样曹-上厂激尤束>i厂二色JxWtt3 &沪阻斷涯片< / /用L 浅咒汪乱计乐箜賂特点农母E <-UY £] 1测量速度快；2•可进行多参数测量；3•是一门综合性的高科技方法（FCM综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学， 免疫学，激光和计算机等多 门学科和技术）；4•既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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Flow + + + Relatively easy
Imaging + + +
More difficult
Multiple parameter analysis (>5) Simultaneous analysis of multiple parameters
Analysis of properties of a single parameter Costly technique
Single Stain Controls - which reagents?
Caveats for substituting reagents:
– Controls should be as bright as possible
• As bright or brighter than the experimental stains
• spillover varies from reagent to reagent
补偿
• 荧光色谱发出的荧光通常有一个很大的波普范围
（ ≥100nm ） • 每个检测器能够检测到一种以上的荧光色谱 (spillover or bleed over) • 需要通过补偿来使得一个检测器只检测一种荧光
Differences/Similarities between Flow and Imaging Property
Population analysis/Statistics Single cell details/architecture Live cell sorting (analysis??) Analysis in native microenvironment Analysis of cellular functions (e.g. Ca++ influx) Need to use a substrate for cell “support”
流式细胞术 Flow Cytometry，FCM
FCM
• Flow ~ cells in motion
• Cyto ~ cell
• Metry ~ measure
• Measuring properties of cells while in a fluid stream • FACS - Fluorescence Activated Cell Sorting? FACS is a trademark of Becton Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS). All FACS instruments are BDIS systems, but not all cytometers are FACS.
– GFP, CFSE, and FITC are NOT the same fluorochrome
• even though they are all green!
– With tandem dyes (Cy5PE/Cy7PE etc.) it is necessary to use the exact same reagent
样本单细胞悬液的制备
新鲜实体组织样本的制备
酶消化法
机械法（剪碎法、网搓法、研磨法 化学处理法（胰酶+0.2%EDTA） 组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备 石蜡包埋组织样本的制备 300目）
外周血单个核细胞样本的制备
骨髓细胞单细胞悬液的制备 培养细胞的单细胞悬液的制备 脱落细胞样品单细胞悬液的制备
+/+ +
+/+ +
Archiving of permanent records
+
+/-
Electronics
Laser
Voltage
Low signal height High signal height
Time
Laser
Voltage
Time
Voltage
Laser
h
Time
Count
Intensity
C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备： （1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。 （2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存 ，至少固定18小时（过夜）。 （3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细 胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
刺激方法
小鼠IL-2 小鼠IL-4 方法1 方法2
小鼠IL-5
小鼠IL-6 小鼠IFN-γ 小鼠TNF-α
方法2
方法3 方法1or 方法4 方法1
方法1: 细胞在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时 方法2: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠 的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2和IL-4的培养基培养两天；然后在含有 重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、 Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。 方法3: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时 方法4: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时
FCS和SSC
• FSC（大小）和SSC（内部结构）, 用这二者 能区分出一群细胞中的不同细胞群。
粒细胞 淋巴细胞
SSC
单核细胞 红细胞、碎片 和死细胞
FSC
画门（Gating）
Whole blood light scatter
流式细胞术的应用
• 细胞群比例及表型测定(CD4+/CD8+ T cells) • 细胞因子（激活的细胞因子、CBA）
• 细胞增殖（CFSE、Brdu）
• 细胞凋亡(PI、Annexin V、TUNEL)
• 细胞周期（PI、DAPI）
• 细胞吞噬杀伤能力（CFSE、CMFDA） • 信号通路 • 其他（ROS、Ca2+）
FCM 数据分析
• 通过流式细胞仪获得实验结果（FACS检测获 得 .fcs文件） • 用专业流式分析软件进行操作（Free or Commercial ） • 分析方法取决于你的实验数据和实验者的实验 方法 • 任何操作都是将你所获得的数值转化成你所关 注的样品信息。
常见流式图类型（2D）
3D
抗体标记方法
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。 (2) 用1ml含5% 血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离 心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗 体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上（4℃）放置30min,
离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
(3) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：
（1）收集1×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心 5min。 （2）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用 2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。 （3）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后， 800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。 （4）加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。 （5）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
所需试剂
• 荧光标记的细胞因子抗体：FITC、PE和APC标记的细 胞因子抗体（BD、eBioscience、Biolegend、R&d） • 溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素溶解红细胞
• 激活剂
• 阻断剂（BFA） • 不含谷氨酰胺的RPMI-1640 • 固定透膜剂 • 其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛 的PBS，4℃储存。
（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。
胞内细胞因子检测
• 目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、 原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting
dilution analysis，LDA）和单细胞PCR。
• 原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA 表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信 号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且 人肉眼识别能力有很大的局限性。 • ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以 进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术
激活剂
• Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)
• Ionomycin
• Staphylococcal enterotoxin B(SEB) • CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀 释的血液细胞 • CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应， 浓度一般为10ug/ml
对照
• 空白对照 - 设定PMT电压 ，检测自发荧光, 有时作为阴性对照 • 补偿对照（单标） -纠正光谱外溢 • FMO(Fluorescence minus one,荧光减一) 对照 - 圈定阳性群 • 生物学对照 -实验对照 (untreated vs treated) - 同种型(for non-specific binding)