实验二淋巴细胞分离实验

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淋巴细胞分离过程中去除红细胞和血小板的方法

为获得高纯度淋巴细胞，必须进一步清除PBMC悬液中其他血细胞。

（一）去除红细胞：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。

低渗裂解法是加1ml蒸馏水于沉淀的PBMC中，不超过1min，红细胞即快速裂解，立即加入等量的 1.8%氯化钠溶液恢复为等渗状态，经洗涤即可去除红细胞。

氯化铵处理法是在沉淀的PBMC中加入1ml 0.83%氯化铵溶液，轻轻振摇2min，即可裂解红细胞，经洗涤即可去除红细胞。

红细胞裂解液的制备：碳酸氢钾（KHCO3）1.0g；氯化氨（NH4Cl）8.3g；EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至1000ml，即工作液。

（二）去除血小板：通过离心洗涤，即可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。

若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清（FCS）梯度离心法去除PBMC 中混杂的血小板。

[将PBMC悬液洗涤2~3次后，常可去除绝大部分混杂的血小板。

某些疾病状态下，外周血中血小板数量增多，常需通过胎牛血清（FCS）梯度离心才能去除过多的血小板，因FCS可让单个核细胞通过而阻止血小板通过。

] Place 3 ml FCS in a 15-ml centrifuge tube and carefully overlay with PBMC. Centrifuge 15 min in a GH-3.7 rotor at 800 rpm (200 g), 18℃to 20℃. Discard supernatant, which contains platelets. Resuspend pellet in HBSS/FCS at 2-5×107 cells per 1 to 2 ml. [Fetal calf serum (FCS; heat-inactivated 1 hr, 56℃)]（三）去除单核细胞和粒细胞：单核细胞的去除：①粘附去除法：单核细胞能粘附在塑料或玻璃的表面，而淋巴细胞则不能，由此可将单核细胞从PBMC悬液中分离出来。

兽医免疫学实验教学大纲

兽医免疫学实验教学大纲兽医免疫学实验教学大纲兽医免疫学是兽医学专业中的一门重要课程，它研究动物身体对病原微生物的免疫应答和免疫调节机制。

免疫学实验教学是培养学生免疫学实践能力的重要环节，通过实验教学，学生能够更好地理解和掌握免疫学的理论知识，并培养其实验操作技能。

实验一：抗原与抗体的相互作用在这个实验中，学生将学习抗原与抗体的相互作用原理。

首先，学生将收集不同种类的抗原，如细菌、病毒等，并制备相应的抗体。

然后，学生将进行免疫沉淀实验，通过观察抗原与抗体的反应，来判断抗体的特异性和亲和力。

实验二：淋巴细胞的分离与培养淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞类型，它们在免疫应答中起着关键作用。

在这个实验中，学生将学习淋巴细胞的分离与培养技术。

首先，学生将从小鼠或大鼠的淋巴组织中分离出淋巴细胞。

然后，学生将对淋巴细胞进行培养，并观察其生长和增殖情况。

实验三：细胞毒性试验细胞毒性试验是评价细胞免疫功能的重要方法之一。

在这个实验中，学生将学习细胞毒性试验的原理和操作技巧。

首先，学生将从小鼠或大鼠中分离出淋巴细胞，并与靶细胞进行共培养。

然后，学生将通过测定靶细胞的存活率来评估淋巴细胞的细胞毒性能力。

实验四：酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。

在这个实验中，学生将学习ELISA的原理和操作方法。

首先，学生将制备ELISA板，并将抗原或抗体固定在板上。

然后，学生将加入特异性的抗体或抗原标记物，并通过酶的反应来检测目标物质的存在和浓度。

实验五：免疫组化染色免疫组化染色是一种常用的免疫学实验技术，用于检测组织中特定抗原的分布和表达情况。

在这个实验中，学生将学习免疫组化染色的原理和操作方法。

首先，学生将制备组织切片，并进行抗原的抗体染色。

然后，学生将观察组织切片中抗原的分布和表达情况。

通过以上实验，学生将能够全面了解免疫学的基本原理和实验技术，并培养其实验操作技能和科学研究能力。

淋巴细胞分离的原理

淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。

淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。

具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。

2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。

3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。

4. 放入离心机，进行离心。

离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。

5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。

上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。

6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。

7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。

洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。

8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。

9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。

通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。

淋巴细胞培养方法

淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，对于研究免疫学以及治疗免疫相关疾病具有重要意义。

淋巴细胞的培养是研究淋巴细胞功能和特性的关键步骤。

本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，以帮助读者了解淋巴细胞培养的基本原理和操作步骤。

一、材料准备1. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。

2. 补充物：培养基中常需添加胎牛血清(FBS)、人血清(HS)等，以提供细胞所需的营养和生长因子。

3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，以防止细菌污染。

4. 受试者淋巴细胞：可以通过外周血或淋巴组织等方式获取。

二、淋巴细胞的分离1. 密度梯度离心法：将受试者淋巴细胞与离心管中的淋巴细胞分离液缓慢加入离心管中，离心分离液的密度逐渐由低到高，使淋巴细胞在不同密度的离心分离液之间分层离心。

离心后，淋巴细胞会沉积在特定密度的离心分离液上，可将淋巴细胞分离出来。

2. 磁珠分离法：利用表面标记有特定抗体的磁珠与淋巴细胞表面的特异抗原结合，通过磁场将目标淋巴细胞与其他细胞分离。

三、淋巴细胞的培养1. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪准确计算淋巴细胞的数量。

2. 细胞密度调整：根据实验需求，将细胞悬浮液中的淋巴细胞浓度调整至适当的浓度，通常为1-2 × 10^6个细胞/mL。

3. 培养基配制：根据实验需要，将培养基加热至37℃后，加入适量的补充物和抗生素，混匀均衡。

4. 细胞培养：将细胞悬浮液与预先配制好的培养基按照适当的比例混合，转移到细胞培养瓶或培养皿中。

5. 培养条件：将细胞培养瓶或培养皿置于37℃恒温培养箱中，设置适当的CO2浓度和湿度，通常为5% CO2和95%湿度。

定期观察细胞形态和生长情况。

6. 培养周期：根据实验需求，定期更换新鲜的培养基，一般为2-3天一次，以保证细胞的正常生长和代谢。

四、细胞活性检测1. 活细胞计数：使用染色剂如Trypan blue染色，观察染色细胞和未染色细胞的比例，以评估细胞的存活率。

小鼠淋巴细胞提取

小鼠淋巴细胞提取一、实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二、实验对象：小鼠三、实验器材：1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台四实验步骤：1、颈椎脱臼处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡2-3分钟，减少毛发造成污染。

2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。

用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。

用镊子捏住切口两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁，用乙醇消毒。

切开腹腔壁膜，用镊子夹住脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织。

3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。

用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。

（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。

5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。

离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示。

6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。

倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。

五、注意事项：①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。

覆盖层不必太厚，2Μl足矣。

②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告一、实验目的1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础二、实验材料1.淋巴细胞分离液2.EDTA抗凝剂常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固3.PBS缓冲液PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用4.戊巴比妥钠溶液作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。

用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。

5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml）三、实验原理外周血中各种细胞的密度不同。

密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。

第一层为血浆层。

第二层为环状乳白色淋巴细胞层。

第三层为透明分离液层。

第四层为红细胞层图1 小鼠外周血离心前后示意图四、实验步骤1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1)4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min7.弃上清液，加入4mlPBS待用图2 第一次离心后图片五、注意事项1.EDTA和淋巴细胞分离液使用前应预温至22℃2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在22~25℃，过低或过高应延长或缩短离心时间六、实验思考第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞，应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗凝补充分的缘故。

淋巴细胞的分离及鉴定

淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。

2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。

【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。

因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。

2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。

【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。

2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。

3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。

4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。

5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。

6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。

7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。

8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。

⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。

3.配制封闭液。

室温浸泡30分钟，PBS洗3次。

4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。

淋巴细胞分离液

2. 在实验过程中应注意哪些事项可减少实验误差？
二、巨噬细胞吞噬功能测定
实验目的
熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。
试剂:
1．淋巴细胞分离液（比重1.0770.001）。 2．肝素溶液用生理盐水配制成500U/ml。 3．Hanks液。 4．2g/L台盼蓝染液。 5．标本肝素抗凝的人外周静脉血。 6. 白细胞稀释液。
实验方法
1．室温下，将2ml抗凝血与2ml Hanks液混合
抗凝全血缓冲液
实验方法
2．取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液4ml沿管壁加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液与稀释血液体积比例为1：2）。
定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培养板置4C保存。测定前取出，室温静置10min 后再加盐酸异丙醇。
实验讨论
1. 试讨论MTT比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取
哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
福建医科大学陈敏
实验三细胞吞噬率与吞噬指数测定
实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液。小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌3% NaHCO3调pH至7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。
吸取白细胞层涂片染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml ) 0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、 5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一次。

1.提取淋巴细胞步骤

提取大鼠淋巴细胞的步骤：1.准备工作：将实验用具（小剪子3把，小镊子3把，磁盘1个，离心管1盒，离心管盖1盒，筛网1盒，表面皿1组，注射器2支，手套1副，1000ul枪头1盒，200ul枪头1盒，10ul枪头1盒，白大褂）放在紫外光下照射30分钟以上。

实验试剂（PBS、无血清的培养液、有血清的培养液、淋巴细胞分离液）准备好。

检查酒精灯内酒精量灯芯、酒精棉量。

脱颈处死，放入酒精中浸泡20分钟（可放到无菌室中）。

3.拿好实验药液（有血清的培养液，无血清的培养液，PBS，淋巴细胞分离液）进入无菌室，穿好白服套袖，于手上身上喷好酒精消毒，进入操作台，擦拭台子，台子干后点燃酒精灯。

（缓冲液，生化反应中以免影响体系PH值波动），将大鼠取出至于磁盘中，于腹中线剪开皮毛，向左侧剪开，用镊子在大鼠左侧找到长条状的脾脏，将脾脏至于PBS中分离结缔组织。

注意：勿将脾脏接触到皮毛引起污染，结缔组织尽量去除干净200目），浸湿，用镊子夹取脾脏至于筛网上，用第一个注射器芯将其碾碎干净（碾碎至筛网上剩余物质为白色），吸取无血清培养液2mlPBS的无用表面皿中。

注意：夹取脾脏的镊子不可以碰到筛网以外的液体中，以免污染组织；注入培养液时不要产生气泡（气泡会影响细胞生长）。

6.避光条件下，第二个注射器吸取3ml淋巴细胞分离液（先注入气体再抽取液体）加于离心管中（加4个）。

将装有组织液的表面皿倾用新的一二混用注射器吸取3ml缓慢注入离心管中，一定要让界面明显。

7.稳拿离心管放入离心机中，离心（2500r/min，20min）。

注意：动作稳，配平时找放的稳得离心管。

若脾脏的状态不好，可适当增加离心转数（3000）。

8.稳稳拿出离心管，用200ul 的枪吸取离心管中处于中间的淡黄色条带（先排气后插入吸取液体，一般能吸取500-600的液体），集中收于第五、六个离心管中，9.离心（1500r/min，10min），慢弃上清（倒入刚才的表面皿中），加入PBS 6-7ml反复吹吸充分，离心（1500r/min，10min）。

淋巴细胞分离的实验方法

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。

为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。

本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。

二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。

2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。

3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。

ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。

B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。

ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。

iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。

ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。

iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。

iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。

D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。

ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。

三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。

2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。

3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。

四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。

然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。

可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。

2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。

淋巴转化实验原理

淋巴转化实验原理
淋巴转化实验是一种常用于研究免疫细胞功能的实验方法。

其原理基于淋巴细胞具有特异的细胞识别和转化能力。

淋巴转化实验通常分为两个步骤：淋巴细胞的分离和淋巴细胞的转化。

第一步，淋巴细胞的分离。

根据不同的实验需求，可以从人体血液或小鼠淋巴组织中分离出淋巴细胞。

常用的方法是密度梯度离心法，将分离出的单个淋巴细胞经过洗涤，得到纯化的淋巴细胞样品。

第二步，淋巴细胞的转化。

淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外与刺激物（如抗原、细胞因子等）相互作用后产生免疫应答的过程。

在实验中，将分离得到的淋巴细胞与待测刺激物一起培养。

淋巴转化实验可以通过不同的指标来评估淋巴细胞的转化程度，如淋巴细胞增殖或细胞分泌物的检测。

增殖实验通常使用放射性示踪物或细胞染色剂来标记细胞，并通过测量标记物的放射性或染色程度来判断细胞增殖的程度。

细胞分泌物检测则利用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法来测量某些细胞因子或蛋
白质在培养液中的浓度变化。

通过淋巴转化实验，科研人员可以研究免疫细胞对刺激物的反应，揭示细胞免疫应答的分子机制，以及评估免疫功能的变化。

这对于研究免疫相关疾病的发生机制、新药物研发和免疫治疗策略的制定具有重要意义。

免疫学实验报告

实验报告一姓名：陈羽迪班级：12生物制药（1）学号：2012332870002一、实验目的1.熟悉人外周血淋巴细胞的组成2.熟悉人外周血淋巴细胞分离的方法3.熟悉密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理和方法二、方法步骤、观察内容1、采静脉血2ml加入抗凝管，轻轻摇动试管，混匀，5min后加入Hank's 液2ml，手动轻轻摇匀。

2、将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液管的液面上，注意保持两种液体界面清晰。

3、将试管平衡后置水平式离心机，1000rpm离心20min。

4、用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。

5、加入5倍体积的Hank's液，手动旋转试管使液体混匀，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀即主要为淋巴细胞（或单位个核细胞）。

加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml，混匀后进行计数。

（备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所用试剂、器材应是无菌的。

）6.细胞存活率检测：取10ul淋巴细胞悬液加入0.4%台昐蓝染色液10ul，混匀。

取10ul加入血细胞计数板，精制片刻，置显微镜高倍镜下观察。

三、观察结果离心后分为四层。

血浆层为黄色，淋巴细胞层为白色。

分离液层为浅黄色红细胞层为红色。

结果计算：四个大方格中淋巴细胞总数为339单个核细胞总数=339/4×5（稀释倍数）×1×10^4=4.24×10^6 细胞存活率=226/(226+10)=95.8%四、分析讨论1. 人外周血中的淋巴细胞组成？T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞2.根据细胞的表面标志分离淋巴细胞的原理是什么？不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同。

具体如下图：实验报告二姓名：陈羽迪班级：12生物制药（1）学号：2012332870002实验二：_E-玫瑰花环形成实验_一、实验目的1.掌握人T淋巴细胞形成E-花环的实验原理和操作方法。

淋巴细胞培养方法

淋巴细胞培养方法引言：淋巴细胞是机体中重要的免疫细胞，其培养方法对于研究免疫功能、疾病发生机制以及药物筛选具有重要意义。

本文将介绍一种常用的淋巴细胞培养方法，帮助研究者进行淋巴细胞的体外培养。

一、材料和试剂准备1. 血液样品：采集新鲜、无菌的血液样品，尽量避免使用已保存的血液。

2. 培养基：常用的淋巴细胞培养基包括RPMI 1640培养基、DMEM培养基等，可根据实验需要选择合适的培养基。

3. 补充物：培养基中可添加的补充物包括胎牛血清(FBS)、人血清(HS)、重组细胞因子等。

4. 抗生素：培养过程中可添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素等，以抑制细菌和真菌的污染。

二、淋巴细胞分离1. 密度梯度离心法：将新鲜血液样品稀释后，加入离心管中，缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，离心后淋巴细胞会沉积在离心管底部，可用无菌移液器吸取上清液。

2. 磁珠分离法：利用磁珠表面特异性抗体与淋巴细胞表面标志物结合，通过磁力将淋巴细胞与其他细胞分离。

三、淋巴细胞培养1. 细胞计数和调整：将分离得到的淋巴细胞进行细胞计数，根据需要调整细胞密度，通常为1-2×10^6个细胞/mL。

2. 培养基配置：根据实验需要配置相应的培养基，通常包括培养基、补充物和抗生素。

3. 培养条件：将淋巴细胞悬浮液均匀地加入含有培养基的培养皿中，置于37℃恒温培养箱中，通常采用5% CO2气氛。

4. 细胞增殖：培养过程中，淋巴细胞会进行增殖，可根据需要进行细胞传代。

5. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养液，以保持培养环境的稳定。

6. 实验操作：在培养过程中，可根据具体实验需要进行细胞刺激、药物处理等，以模拟体内环境或研究特定的生物学功能。

四、细胞检测和分析1. 细胞活力检测：使用细胞活力试剂盒等方法，对培养的淋巴细胞进行细胞活力检测，评估其生存状态和增殖情况。

2. 免疫分析：可使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等方法，对培养的淋巴细胞进行免疫表型分析、细胞因子检测等。

密度梯度离心法分离淋巴细胞实验报告

密度梯度离心法分离淋巴细胞实验报告1、实验目的掌握密度梯度法分离单个核淋巴细胞2、实验原理红细胞和多核白细胞的比重（1.092左右）比淋巴细胞的比重（1.075-1.090）大，因此利用一种比重介于1.075~1.092之间的等渗溶液（淋巴细胞分离液）作密度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布。

3、实验试剂和器材Balb/c鼠，1640培养基，淋巴细胞分离液，镊子，剪刀，金属网，研棒，平皿，枪头、15ml离心管、移液器、离心机、白瓷盘、酒精棉球、烧杯。

4、实验步骤1、对Balb/c鼠先用摘眼球放血并拉脊椎处死。

2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部，用剪刀和镊子在腹部剪开一个小口，用手撕开小鼠的皮毛，使肌肉裸露，用剪刀和镊子剪开肌肉，取脾脏。

去除血细胞及脂肪组织，用2ml 1640进行清洗。

3、将清洗过的脾脏放到置于平皿中的金属网上，先加入1ml 1640，用研磨棒压碎脾脏成单细胞，补加2ml 1640冲洗金属网。

4、将研磨的单细胞悬液小心的靠壁滴加入5ml体积的淋巴细胞分离液的液面上（小心不破坏淋巴细胞分离液液面），2000r/min，离心20min，此时离心管中由上至下细胞分四层。

用枪头小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层，放入加入了约10ml的PBS的离心管中，充分混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。

剩余约100ul PBS，重悬，混匀，即得淋巴细胞悬液。

5、实验结果1、离心后溶液分为四层，最上层为粉红色澄清液体，第二层处于分界处，稍微发白模糊，第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物，最下层为深红色沉淀。

2、最后得到的淋巴细胞悬液较为浑浊，颜色发白。

6、实验分析及讨论（一）实验讨论1、淋巴细胞分离液看起来是无色透明的，实际上由两种糖分构成，具有梯度，故可以对淋巴细胞产生分离作用。

2、再去脾脏前要确保小鼠已被处死，避免小鼠挣扎造成污染。

3、在解剖前用酒精棉球擦拭小鼠腹部，即可起到消毒作用，又可以弄湿鼠毛露出皮肤，方便解剖。

淋巴细胞转换实验报告

一、实验目的本次实验旨在通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，观察并分析淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，从而了解细胞免疫的功能和状态。

二、实验材料1. 实验试剂：- 外周血采集管- RPMI-1640培养基- 胎牛血清- 植物血凝素（PHA）- 青霉素-链霉素溶液- 0.25%胰蛋白酶- 台盼蓝染液- 计数板- 显微镜2. 实验仪器：- 酶标仪- 培养箱- 水浴箱- 移液器- 微量离心机三、实验方法1. 外周血采集：采集受试者外周血，将采集管置于室温下静置2小时，使红细胞自然沉降。

2. 淋巴细胞分离：将上层血浆转移至新的离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10分钟，然后加入胎牛血清终止消化。

3. 淋巴细胞洗涤：将消化后的细胞悬液离心洗涤，去除未结合的细胞碎片和红细胞。

4. 淋巴细胞培养：将洗涤后的淋巴细胞悬液转移至培养瓶中，加入适量的RPMI-1640培养基和PHA，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时。

5. 淋巴细胞计数：培养结束后，用台盼蓝染液对淋巴细胞进行染色，计数活细胞数量。

6. 淋巴细胞转化率计算：计算转化细胞的数量与总细胞数量的比值，即为淋巴细胞转化率。

四、实验结果1. 淋巴细胞数量：实验组淋巴细胞数量显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞增殖。

2. 淋巴细胞转化率：实验组淋巴细胞转化率显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞转化。

五、实验分析1. 淋巴细胞转化实验结果显示，PHA刺激可以显著促进淋巴细胞增殖和转化，这与淋巴细胞在免疫反应中的作用相符。

2. 实验结果表明，淋巴细胞转化率可以作为评价机体细胞免疫功能的一个重要指标。

六、实验结论本次实验通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，成功观察到了淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，为研究细胞免疫功能提供了实验依据。

七、实验注意事项1. 实验过程中，需严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。

实验二淋巴细胞分离实验

注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤注意事项
实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的原理实验步骤注意事项
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀
释
外
周, 30min
Ficoll
Ficoll
稀释的血浆、血小板 PBMC
红细胞粒细胞
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨（研磨同时滴加1640培养液，保持细胞活性）
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀

小鼠淋巴细胞分离方法

小鼠淋巴细胞分离方法一、实验用品的准备：1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20µl枪头、200µl枪头、1000µl枪头。

摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒；2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个；200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个；5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）；注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。

二、相关实验：（一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。

实验动物：BABALB/c小鼠；雌性实验材料：1．小鼠淋巴细胞分离液,2．60mm玻璃培养皿3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌4．气管切开包5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机6．1640培养基实验方法1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。

2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。

4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。

5. 3000转离心15分钟。

（病毒室离心机）6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。

7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。

8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

实验试剂用量：1．小鼠淋巴细胞分离液：60 mL 2．1640基础培养基：80 mL 3．5%FCS1640培养基：50Ml。

淋巴细胞转化实验报告

一、实验目的本实验旨在了解淋巴细胞转化的基本原理，掌握淋巴细胞转化实验的操作方法，并通过对实验结果的分析，评估机体细胞免疫功能。

二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到某些刺激物（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）的作用下，发生增殖、分化，转化为淋巴母细胞的过程。

淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法之一。

通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。

三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 试剂与耗材：植物血凝素（PHA）、小牛血清、培养液、显微镜、计数板、移液器、离心机等。

四、实验方法1. 采集小白鼠血液，分离淋巴细胞。

2. 将分离得到的淋巴细胞加入含有PHA的培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48小时。

3. 培养结束后，收集细胞，用固定液固定细胞，进行染色。

4. 在显微镜下观察淋巴细胞形态变化，计数淋巴母细胞数量。

5. 计算淋巴细胞转化率。

五、实验结果1. 观察到淋巴细胞在培养过程中，部分细胞体积增大，核染色质疏松，核仁明显，胞浆丰富，呈嗜碱性，符合淋巴母细胞特征。

2. 计算淋巴细胞转化率，本实验中淋巴细胞转化率为60.2%。

六、实验讨论1. 淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法，通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。

2. 本实验中，淋巴细胞转化率为60.2%，说明小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。

3. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。

七、结论本实验通过淋巴细胞转化实验，成功观察到了淋巴细胞在体外培养过程中的转化现象，并计算出淋巴细胞转化率。

结果表明，小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。

八、注意事项1. 实验操作过程中，应严格遵循无菌操作原则，防止污染。

2. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。

3. 实验结果的分析应结合临床实际情况，综合评估机体的免疫功能。

淋巴细胞分离计数实验报告

淋巴细胞分离计数实验报告一、实验目的本实验旨在通过淋巴细胞分离计数实验，了解淋巴细胞的分离过程和计数方法，并掌握相关技能。

二、实验原理1. 淋巴细胞的分离：通过梯度离心法将淋巴细胞与其他血液成分进行分离。

2. 细胞计数：使用显微镜和特殊计数板对淋巴细胞进行计数。

三、实验材料和设备1. 血液样品2. Ficoll-Paque液（用于梯度离心）3. 生理盐水4. 无菌注射器、针头5. 显微镜、计数板四、实验步骤1. 取适量血液样品加入无菌注射器中。

2. 将Ficoll-Paque液加入另一无菌注射器中。

3. 在针头上滴上生理盐水，避免空气进入。

4. 缓慢注入Ficoll-Paque液至血液样品上方。

注意不要将两种液体混合。

5. 离心20分钟，速度为400g。

此时，白色细胞会沉积到Ficoll-Paque层，红细胞会沉积到底部。

6. 用无菌注射器吸取上层白色细胞，转移到新的离心管中。

7. 加入适量生理盐水，混合均匀。

8. 离心10分钟，速度为200g。

此时，淋巴细胞会沉积到底部。

9. 弃去上层液体，用生理盐水洗涤淋巴细胞。

10. 在计数板上吸取适量淋巴细胞进行计数。

五、实验结果分析1. 淋巴细胞的分离效果：根据显微镜下观察到的细胞形态和数量来判断分离效果是否良好。

2. 细胞计数：根据计数板上的规则进行计数，并结合显微镜下观察到的图像来确定结果。

六、实验注意事项1. 操作过程要严格无菌，避免污染样品。

2. 离心过程中要注意速度和时间，以避免对样品产生影响。

3. 计数板要保持干燥和清洁。

七、实验结论通过本次淋巴细胞分离计数实验，我们成功地将淋巴细胞与其他血液成分进行了分离，并通过计数板对淋巴细胞进行了计数。

这些实验结果为我们进一步了解淋巴细胞的生物学特性和相关疾病提供了基础数据。