细胞生物学-14转基因动物

~30 cells Inner Cell Mass (128 cell stage)
1-totipotent 2-tissue culture 3-Transfectable 4-Selection 5- Differentiation In vitro
Plate out blastocysts in individual 10 mm dishes on mitotically inactive MEF or STO feeder cells to provide LIF and other factors
(Gene targeting)
ES cells spontaneously differentiate when allowed to aggregate in the absence of LIF
- LIF
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
ES Cells Differentiation
Drug or Growth factors
Tissues
Blood Vessels
Blood Cells
Neuronal Development
Bone Cells
Muscle Cells
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
Gene targeting in embryonic stem cells Targeting vector with the desired change is electroporated into ES cells Homologous recombinants are identified by drug selection &molecular screening Recombinant ES clones are injected into blastocysts to produce chimeric mice Chimeras are bred to produce heterozygotes Heterozygotes are intercrossed to produce homozygous mutants
(Gene targeting)
X
NEOMYCIN NEOMYCIN
X
Total 4 Kbp (each arm not less than 500bp) Delete coding sequences Change reading frame Transcription of Neo in antisense direction
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
SELECTION SELECTION MARKER GENES GENES
Positive selection: - neomycin phosphotransferase (neo) phosphotransferase - hygromycin phosphotransferase (hyg) phosphotransferase (hyg) - puromycine (pur) - hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt) hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt) Negative selection： Negative selection： - thymidine kinase (tk) - cytosine deaminase (cd) - hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt) hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt)
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
Homologous recombination
1- Length of homologous sequences 2- Isogenic DNA
Hom. Rec. Efficiency
Base pair 25bp 2000bp
第六章 基因打靶
Gene targeting
ES cells: Medium with 15% FCS 1000u/ml LIF CO2 : 7-10% 7LIF (leukaemia inhibitory factor) ： Maintains stem cells in an undifferentiated state
第六章 基因打靶
Transfer disaggregated contents to a fresh feeder cell tissue culture well and inspect daily for signs of differentiation. Primary cell colonies are clearly visible as distinct clumps
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
正负筛选策略（ 正负筛选策略（positive and negative selection，PNS） selection，PNS） 正负筛选策略是由Capecchi 正负筛选策略是由 Capecchi 等人首先使用选择标记基因 Capecchi等人首先使用选择标记基因 和非选择标记基因构建基因打靶载体。 和非选择标记基因构建基因打靶载体 。 其中正向选择标记基 因为neo基因，位于载体的基因敲除的目的片段中， 因为neo基因，位于载体的基因敲除的目的片段中，具有双重 neo基因 作用，即形成靶位基因的插入突变和正向筛选的标记； 作用 ， 即形成靶位基因的插入突变和正向筛选的标记 ； 而负 选择标记基因HSV tk基因位于目的片段的外侧 具有HSV 选择标记基因 HSV-tk 基因位于目的片段的外侧 ， 具有 HSV-tk HSV- 基因位于目的片段的外侧， HSV基因的重组细胞在GANC培养基中不能存活。 HSV-tk相似的 基因的重组细胞在 GANC 培养基中不能存活 。 与 HSV-tk 相似的 GANC培养基中不能存活 基因还有gpt 基因还有gpt (对6-巯基尿嘧啶敏感)和dta (diptheria毒素)。 巯基尿嘧啶敏感) (diptheria毒素 毒素)
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
基因打靶小鼠的策略 启动子缺失筛选法 启动子缺失筛选所选用的基因敲除载体存在一个无启动 子的正向选择基因neo 子的正向选择基因neo，并且目的基因片段也无该基因的启动 neo， 序列。当打靶载体和细胞基因组发生同源重组时， 序列 。 当打靶载体和细胞基因组发生同源重组时 ， 正向选择 基因在靶位点的基因启动子的作用下，表达功能性产物， 基因在靶位点的基因启动子的作用下 ， 表达功能性产物 ， 使 阳性细胞具有Ｇ418抗性 抗性， 阳性细胞具有Ｇ418抗性，从而可以在药物选择培养基中得到 同源重组阳性克隆。 同源重组阳性克隆 。 启动子缺失筛选方法是使用频率最高且 最为可靠的一种方法。 最为可靠的一种方法。
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
Early mouse development
From Sedivy & Joyner “Gene Targeting” 1992
第六章 基因打靶
Blastocyst
(Gene targeting)
Generating ES Cells
Harvest blastocysts on day 3.5 by flushing from the uterine lumem with M2 medium
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
历史 Kaufman建立了ES细胞 建立了ES细胞。 1981 Evans and Kaufman建立了ES细胞。 1986－ Robertson，Hooper，Kuehn等对ES细胞进行 等对ES 1986－1987 Robertson，Hooper，Kuehn等对ES细胞进行 遗传操作，并获得ES细胞来源的小鼠个体。 ES细胞来源的小鼠个体 遗传操作，并获得ES细胞来源的小鼠个体。 al在ES细胞中建立基于同源重组的基因 1988 Thomas et al在ES细胞中建立基于同源重组的基因 打靶技术。 打靶技术。 Jaenisch建立 microglobulin-deficient基因剔 1989 Jaenisch建立b2-microglobulin-deficient基因剔 除小鼠。 除小鼠。 Cre-LoxP系统用于ES细胞的打靶 系统用于ES细胞的打靶， 1994 Gu 将Cre-LoxP系统用于ES细胞的打靶，建立条件性 基因剔除技术。 基因剔除技术。
After 1-2 days, blastocysts hatch (A) and 1attach to the dish by migration of the trophectoderm (TE), while the inner cell mass (ICM) grows (B)
After about 96-120 hours in culture (C, D), the ICM can be 96dislodged from the TE layer, washed and transplanted to microdrops of medium containing trypsin to disperse the clumps
第六章 基因打靶
PolyPoly-A缺失筛选法
(Gene targeting)
Poly- 缺失筛选法的原理与启动子缺失筛选法相似， Poly-A 缺失筛选法的原理与启动子缺失筛选法相似 ， 一 般在打靶基因不能被诱导表达时，采用该方法。 般在打靶基因不能被诱导表达时 ， 采用该方法 。 载体设计特 点是正向选择基因neo 点是正向选择基因neo的3´末端缺乏转录终止信号。由于载体 neo的 末端缺乏转录终止信号。 无转录终止信号，neo基因的表达在转录水平受到抑制 无转录终止信号，neo基因的表达在转录水平受到抑制。但在 基因的表达在转录水平受到抑制。 同源重组的细胞中，neo基因可以利用基因组靶位基因的转录 同源重组的细胞中，neo基因可以利用基因组靶位基因的转录 终止信号得到有效表达，从而使阳性细胞获得Ｇ418抗性 终止信号得到有效表达，从而使阳性细胞获得Ｇ418抗性，实 抗性， 现同源重组转化细胞的富集。 现同源重组转化细胞的富集。
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
转基因动物的基本流程
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
Embryonic stem (ES) cells
Pluripotent stem cells derived from the inner cell mass of the blastocyst Can be cultured, manipulated and then reinjected into blastocysts, where they can go on to contribute to all parts of embryo. In principle, ES cells also might be able to generate large quantities of any desired cell .
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
打靶载体的设计
选用同源DNA 选用同源DNA 同源臂的长度 正、负选择
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
Factors influencing targeting efficiency
isogenic DNA (perfect homology) 1010-25 fold size of region of homology exponential relationship robust screen! Positive controls
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
NMNM-2细胞的核型图
第六章 基因打靶
(Gene targeting)
Stem cell cultures
Mouse Embryonic Fibroblast Cells: Mitotically inactivated by irradiation or mitomycin C
第六章 基因Baidu Nhomakorabea靶
基因打靶的类型
(Gene targeting)
• 基因剔除（常规、条件性） 基因剔除（常规、条件性） Knock(Gene Knock-out, conventional and conditional) • 基因敲入(Gene Knock-in) 基因敲入(Gene Knock• 基因捕获(Gene Trap) 基因捕获(Gene