人造海水的配方

人造海水的配方*
（引自Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996）
*：水＆化合物的总重量为
1kg.
《海洋微生物及其代谢产物》 -林永成主编 2003
细菌的分离：
牛肉膏蛋白胨琼脂、营养琼脂等是分离细菌的常用培养基，前苏联细菌学家设计的ZOBELL 2216E 培养基是培养好气性异养细菌较好的培养基，可培养多种细菌，SIMIDU 培养基也常用于海洋好气性异养细菌的分离，PFENNIGS 培养基适用于海洋光合细菌的分离，分离海洋弧菌可采用TCBS 培养基，培养基PH 一般为7.2-7.6,盐度为28到30,培养温度28到37， 培养时间1到7天，注意观察平板菌落变化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小菌落，为防止真菌的污染，常在培养基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等。

放线菌因生长缓慢且菌落不大，一般不会对细菌的分离产生影响。

放线菌的分离：
1 放线菌是数量最多、最常分离到的G+，JENSEN 的研究表明，离海岸越近，在0到1米水深的底泥样本中，链霉菌占分离的放线菌总数的86%，小单孢菌占12%，其他占2%。

2 分离培养基
多采用合成培养基（高氏合成一号、精氨酸、天门冬素培养基）和有机培养基（HV 、YE 、WAKSMAN 、bennett ）,高氏合成一号是分离的常用培养基，适合尤其是链霉
名称
质量（×10-3kg ） 氯化钠
氯化镁
硫酸钠
氯化钙
氯化钾
重碳酸钠
溴化钾
硼酸
氯化锶
氟化钠 23.98 5.029 4.01 1.14 0.699 0.172 0.100 0.0254 0.0143 0.0029
菌的生长，但细菌和真菌也大量生长。

HV是以腐植酸为唯一碳、氮源的培养基，对小单孢菌、小双孢菌、指孢囊菌、链孢囊菌的选择性高，但是生长的放线菌形态不完整，难以观察，给挑菌工作带来困难。

3抑制剂
放线菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、链霉素可抑制细菌，重铬酸钾对真菌和细菌均可抑制，0·005%-0·01%是较理想的分离抑制剂，有三个特点：抑制细菌和真菌的生长，不影响放线菌的正常生长，还可促进一些放线菌孢子的萌发，价格低廉。

4样品预处理
120干热处理样品1小时能大大减少细菌和链霉菌的数量，而对稀有放线菌影响较少，甚至能利于孢子萌发，由于海洋样品多潮湿，同时孢子对湿热敏感，故采用50到55度的热处理会促使大部分孢子萌发。

真菌的分离：
到2000年止已认知的海洋真菌仅仅444种，包括177属360种的子囊菌（占81·1%），51属74种半知菌（占16·7%）和7属10种的担子菌（占2·2%）
选择性富集
海水样品可通过浓缩或过滤，用无菌的0·45µm孔径的硝酸纤维素滤膜过滤海水，然后直接把滤膜放在培养基上培养。

分离酵母菌时，可将含50-200㎎／Ｌ氯霉素的分离培养基用浓盐酸调PH值至3·4酸性条件下可抑制很多细菌生长。

植物内生真菌分离方法：
进行分离前，对植物材料表面进行彻底消毒非常必要，典型的消毒剂有70%-90%的乙醇、漂白剂、1%的过氧乙酸和3%-30%的过氧化氢，多采用PDA培养基，并加入庆大霉素、氯霉素、链霉素等抗生素，抑制细菌和放线菌的生长。

鉴定：
16S rRNA相对分子量适中，易于进行序列测定和分析比较，可以为细菌鉴定提供相对稳定可靠的信息，广泛用于评价生物遗传多态性和系统发生关系。

18S rRNA成为目前研究真菌属物种多样性的分析比较。

原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，真核微生物转录区包含5S、18S、5·8S、28S。

（C+G）mol％在种内不超过4%,属内不超过10%。

低于2%没有分内学意义。

只具有否定价值，需与表型特征相结合。

16S rDNA成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，适用种及种以上的分类单位。

同源性≥95%的菌可归为同一属，≥97%可视为同一种，大于97%时必须测定DNA-DNA杂交率是否大于70%才能确定是否为新种。

由于对同种内的不同菌株分
辨力较差，更适合研究属及属以上的菌株。

18S rDNA普遍用于真菌物种的鉴定分析。

植物内生真菌的分离叶、叶脉、茎、树皮(韧皮部)等样品用自来水冲洗掉泥土，然后进行严格的表面消毒程序：依次浸泡在75％酒精lmin，3％一5％有效氯的次氯酸钠溶液3 min。

75％的酒精O．5 min，然后再用无菌水冲洗3遍。

晾干后，在超静台将其剪成约O．5 cm×0．5 cm左右小片。

将处理好后剪成的小片铺于PDA 平板上，加入氯霉素与链霉素各50斗g／mL抑制细菌的生长，在26℃培养培养2—3周分离内生真菌。

这些平板在第1周要每天检查1次，然后可以3、4 d检查1次。

一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上，经几次纯化保存于PDA斜面。

植物组织样品处理: 将采集的红树林植物样品先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去除植物组织表面的杂质, 把植物样品剪切成15 cm 左右长度的节段
进行表面消毒。

样品依次用次氯酸钠(含5%有效氯量)浸泡5 min,无菌水清洗3 次, 75%酒精浸泡3 min, 无菌水清洗3次, 晾干, 用粉碎机把植物组织粉碎备。