产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究
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配制相同的麸皮培养基 3 瓶 ,分别在 30 ℃、 33 ℃和 37 ℃培养. 结果发现在 37 ℃时产酶最高 , 30 ℃和 33 ℃分 别 是 37 ℃酶 活 的 89. 5 % 和
96. 8 %. 2. 2. 4 不同 pH 的提取液对酶收率的影响
配制 pH 为 5. 5 、6. 5 和 7. 5 0. 25 molΠL 乙酸 缓冲液 ,用 NaOH 和 HCl 调自来水 pH 至 5. 5 、6. 5 、 7. 5 、8. 5 ,然后分别对发酵物进行提取.
为 4 %和 0. 3 %.
关键词 : 植酸酶 ;黑曲霉 ;筛选 ;产酶条件
中图分类号 :Q936 文献标识码 :A
文章编号 :100727847 (2002) 0420343204
Studies on Screening of Strains Producing Phytase and Conditions of Producing Phytase
从图 2 中可以看出培养基中加水量在 35 % 时 ,测得的酶活最高 ,低于 35 %菌体生长缓慢 ;高 于 35 % 菌体虽生长很好 ,但测得的酶活较低 ,加 水量为 70 %的酶活只是 35 %的酶活 24. 5 % ,原因 可能是加水量低于 35 %时 , 培养基的水活度偏 低 ,菌体延缓期延长 ,生长缓慢 ;加水量过多 ,对数 生长期延长 ,不利于代谢产物积累. 这与其它文献
植酸酶活性单位定义 :在 37 ℃pH 5. 5 的条 件下 ,每分钟从底物释放 1 纳摩尔无机磷所需要
的植酸酶量 ,用 IU 表示.
2 结果和讨论ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. 1 产植酸酶菌株的筛选 由于植酸钙的螯合作用 ,使培养基形成白色
混浊 ,产植酸酶的菌株则会水解植酸钙 ,在菌落的 周围形成透明圈 ,根据透明圈的有无和大小 ,可以 初步判断该菌是否产植酸酶及酶活的高低. 90 余 株菌中筛选出 41 株菌产植酸酶 ,其中真菌 25 株 , 细菌 16 株. 从中选取 20 株透明圈直径与菌落直 径比值较大的菌株进行液体发酵. 测定发酵液酶 活 ,结果表明有 13 株菌酶活超过 10 IUΠml ,其中 , 一株黑曲霉 AN00101 的酶活最高 , 达到 171 IUΠ ml .
固体发酵培养基 :麸皮按试验设计加水灭菌 即是. 1. 1. 2 试剂
植酸钙 、植酸钠购于 Sigma 公司. 颜色Π终点混 合液 : 250 ml 钼 酸 铵 ( 100 gΠL ) + 250 ml 钒 酸 铵 (2. 35 gΠL) + 165 ml 65 %硝酸 + 335 ml 水. 1. 2 方法 1. 2. 1 产植酸酶菌株的初筛
Abstract : Aspergillus niger secreting phytase was separated by screening and rescreening ,and the conditions of pro2 ducing phytase was investigated. The results show : when A . niger is cultivated at 37 ℃for 114 hours in wheat bran
将从土壤分离及本实验室所保藏的共 90 余 株菌点接于筛选培养基上 ,在 30 ℃培养 3 d. 对有 透明圈的进行重复筛选. 1. 2. 2 产植酸酶菌株的复筛
挑取产 透 明 圈 菌 株 接 种 于 液 体 发 酵 培 养 基 中 ,30 ℃摇振培养 4 d 后 ,6 000 rΠmin 离心 20 min , 得粗酶液 ,测酶活. 1. 2. 3 产植酸酶菌株的固体发酵
solid medium added 35 percent running water ,and phytase was extracted by 3 percent chloride calcium solution , the highest enzyme activity was obtained 1. 3 ×104 IU in every gram fermented product . Moreover it is better for produc2 ing phytase to add 4 percent ammonium sulfate and 0. 3 percent magneium sulfate to medium.
第 4 期 程海娜等 :产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究 345
报道的培养基的最佳含水率比较结果偏低 ,主要 是因为没有把麸皮中的含水量计算在内.
图 2 培养基加水量对 AN00101 产植酸酶的影响 Fig. 2 Effect of water added to medium on producing phytase
摘 要 : 通过初筛和复筛 ,得到一株产植酸酶较高的黑曲霉 AN00101 菌株 ,并对该菌种的产酶条件进行了研
究. 结果表明 :配制加水量为 35 %的麸皮固体培养基 ,在 37 ℃培养 114 h ,用 3 % CaCl2 进行提取 ,每 g 固体发酵
物酶活高达 1. 3 ×104 IU. 经 L9 (34 ) 正交实验表明 ,硫酸铵和硫酸镁对产酶有显著的促进作用 ,适宜添加量分别
图 1 黑曲酶 AN00101 在含植酸钙平板上形成透明水 解圈 Fig. 1 The hydrolysis bound result by A. niger AN01001 in plate containing calcium phytase
2. 2 产酶条件的研究 固体发酵与液体发酵相比 ,具有设备较简单 、
Key words : phytase ; Aspergillus niger ;screening ; conditions of producing phytase ( Life Science Research ,2002 ,6 (4) : 343～346)
植酸酶 (phytase ,EC3. 1. 3. 8) 是催化植酸及其 盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称. 植酸酶 添加在饲料中 ,将其中的植酸水解成肌醇和磷酸 , 提高了磷的利用率 ,降低了粪便中磷的排放量 ,减 少了植酸磷对环境的污染. 更为重要的是 ,植酸酶 可使植酸盐蛋白质络合物降解而提高蛋白质的利 用率 ,减少植酸盐对微量元素的螯合 ,提高植物饲
从表 1 中可以看出用乙酸缓冲液提取时 ,当 pH 为 5. 5 、6. 5 时酶活较高 ,在 pH 7. 5 时酶活明显 下降. 自来水进行提取时 ,在 pH 7. 5 时酶活最高 , 用自来水 (其 pH 为 7. 5) 提取的效果比乙酸缓冲 液稍好些 ,这说明在提取时不仅 pH 对酶收率有 影响 ,而且不同提取液所要求的最适 pH 也不同.
3 44 生 命 科 学 研 究 2002 年
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 培养基
筛 选 培 养 基 ( %) : 植 酸 钙 0. 1 , 葡 萄 糖 3 ,
NH4NO3 0. 5 , KCI 0. 05 , MgSO4·7HO2 0. 05 ,MnSO4· 7HO2 0. 003 ,FeSO4·7HO2 0. 003 , 琼脂 1. 8 ,pH 5. 7. 此培养基用于筛选真菌 ,牛肉膏蛋白胨培养基加 0. 1 %的植酸钙用于筛选细菌.
第 6 卷 第 2002 年 12
4期 月
生命科学研究 Life Science Research
Vol. 6
Dec.
No. 4 2002
产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究Ξ
程海娜 ,莫湘涛 ,陈 宇 ,谭海滨 ,周 雄 ,夏立秋
(湖南师范大学 生命科学学院 微生物学系 ,中国湖南 长沙 410081)
成本低 、酶产量高和易于投产等优点 ,所以产酶条 件的研究注重于对固体发酵的研究. 2. 2. 1 培养基最适加水量的确定
培养基中水分含量对菌体的生长及酶的产生 都有很大影响 ,水分含量太少不利于菌的生长 ,太 多不利于代谢产物的积累. 在 250 ml 三角瓶中装 入 10 g 麸皮 ,再加入不同体积的自来水 ,使加水量 占总质量的 30 %～70 % ,每相差 5 %为一个处理 , 在 30 ℃培养 4 d ,测酶活.
表 1 不同 pH的提取液对酶收率的影响 Table 1 Effect of different pH extract solution on producing phytase
料的营养价值[1～4] . 此外 ,植酸酶制剂在食品 、医 药等方面有广泛的应用. 但目前植酸酶制剂价格 昂贵 ,无法推广到饲料工业中 ,本研究的目的是筛 选出植酸酶高产菌株 ,丰富植酸酶基因资源 ,以利 于构建植酸酶基因工程菌 ,为大规模发酵生产廉 价的植酸酶制剂奠定基础[5 ,6] .
Ξ 收稿日期 :2002208223 ;修回日期 :2002211215 基金项目 :国家创新基金项目 (OOC26214300645) 作者简介 :程海娜 (19762) ,女 ,河南邓州人 ,硕士研究生 ,从事植酸酶分子生物学等方面的研究 ;莫湘涛 (19672) ,男 ,湖南湘潭人 ,湖 南师范大学讲师 ,从事微生物分子生物学等方面的研究 ;陈宇 (19722) ,女 ,贵州安顺人 ,湖南师范大学讲师 ,从事微生物分子生物 学等方面的研究 ;夏立秋 (19552) ,男 ,湖南安乡人 ,湖南师范大学教授 ,硕士生导师 ,通讯作者 ,主要从事微生物分子和酶工程研 究.
液体发酵培养基 :60 g 麸皮加入到 935 ml 水 中 ,再加入 5 g NaOH ,在 121 ℃处理 20 min 后 ,用 8 层纱 布 过 滤. 所 得 滤 液 加 入 ( 1 g per 100 ml ) : (NH4 ) 2 SO4 0. 04 、MgSO4·7HO2 0. 02 、casitone 1 、 KH2 PO4 0. 05 、K2 HPO4 0. 04 , 细菌培养基的 pH 为 6. 5 ,真菌培养基的 pH 为 5. 7.
图 3 发酵时间对 AN001011 产酶的影响 Fig. 3 Effect of fermented time on producing phytase
2. 2. 2 发酵时间对产酶的影响 在 250 ml 三角瓶中 ,每瓶装 15 g 固体发酵培
养基 ,从 72 h 开始每隔 6 h 测一瓶培养物的酶活. 从图 3 中可以看出在 90～120 h 酶活都比较高 ,在 114 h 时酶活最高 ,84 h 以前产酶量较低. 2. 2. 3 不同培养温度对产酶的影响
CHENG Hai2na ,MO Xiang2tao ,CHEN Yu ,TAN Hai2bing ,ZHOU Xiong ,XIA Li2qiu
( Department of Microbiology of Life Science College , Hunan Normal University , Changsha 410081 , Hunan , China)
挑取菌株接种于固体发酵培养基中 ,在 30 ℃ 培养 3～6 d ,每天翻动一次. 采用文献 [ 7 ]方法抽 提 ,得粗酶液 ,测酶活. 1. 2. 4 酶活力测定
粗酶液进行适当稀释后 ,取 0. 2 ml 加入 0. 6 ml pH 5. 5 0. 25 molΠL 乙酸缓冲液 ,在 37 ℃保温 5 min 后加入 8. 4 gΠL 植酸钠 1. 6 ml , 继续保温 30 min ,加入颜色Π终点混合液 1. 6 ml ,415 nm 测定无 机磷含量. 对照 :在 0. 2 ml 酶液加入 0. 6 ml 乙酸 缓冲液后 ,再加入 1. 6 ml 颜色Π终点混合液 ,最后 加入底物.
96. 8 %. 2. 2. 4 不同 pH 的提取液对酶收率的影响
配制 pH 为 5. 5 、6. 5 和 7. 5 0. 25 molΠL 乙酸 缓冲液 ,用 NaOH 和 HCl 调自来水 pH 至 5. 5 、6. 5 、 7. 5 、8. 5 ,然后分别对发酵物进行提取.
为 4 %和 0. 3 %.
关键词 : 植酸酶 ;黑曲霉 ;筛选 ;产酶条件
中图分类号 :Q936 文献标识码 :A
文章编号 :100727847 (2002) 0420343204
Studies on Screening of Strains Producing Phytase and Conditions of Producing Phytase
从图 2 中可以看出培养基中加水量在 35 % 时 ,测得的酶活最高 ,低于 35 %菌体生长缓慢 ;高 于 35 % 菌体虽生长很好 ,但测得的酶活较低 ,加 水量为 70 %的酶活只是 35 %的酶活 24. 5 % ,原因 可能是加水量低于 35 %时 , 培养基的水活度偏 低 ,菌体延缓期延长 ,生长缓慢 ;加水量过多 ,对数 生长期延长 ,不利于代谢产物积累. 这与其它文献
植酸酶活性单位定义 :在 37 ℃pH 5. 5 的条 件下 ,每分钟从底物释放 1 纳摩尔无机磷所需要
的植酸酶量 ,用 IU 表示.
2 结果和讨论ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. 1 产植酸酶菌株的筛选 由于植酸钙的螯合作用 ,使培养基形成白色
混浊 ,产植酸酶的菌株则会水解植酸钙 ,在菌落的 周围形成透明圈 ,根据透明圈的有无和大小 ,可以 初步判断该菌是否产植酸酶及酶活的高低. 90 余 株菌中筛选出 41 株菌产植酸酶 ,其中真菌 25 株 , 细菌 16 株. 从中选取 20 株透明圈直径与菌落直 径比值较大的菌株进行液体发酵. 测定发酵液酶 活 ,结果表明有 13 株菌酶活超过 10 IUΠml ,其中 , 一株黑曲霉 AN00101 的酶活最高 , 达到 171 IUΠ ml .
固体发酵培养基 :麸皮按试验设计加水灭菌 即是. 1. 1. 2 试剂
植酸钙 、植酸钠购于 Sigma 公司. 颜色Π终点混 合液 : 250 ml 钼 酸 铵 ( 100 gΠL ) + 250 ml 钒 酸 铵 (2. 35 gΠL) + 165 ml 65 %硝酸 + 335 ml 水. 1. 2 方法 1. 2. 1 产植酸酶菌株的初筛
Abstract : Aspergillus niger secreting phytase was separated by screening and rescreening ,and the conditions of pro2 ducing phytase was investigated. The results show : when A . niger is cultivated at 37 ℃for 114 hours in wheat bran
将从土壤分离及本实验室所保藏的共 90 余 株菌点接于筛选培养基上 ,在 30 ℃培养 3 d. 对有 透明圈的进行重复筛选. 1. 2. 2 产植酸酶菌株的复筛
挑取产 透 明 圈 菌 株 接 种 于 液 体 发 酵 培 养 基 中 ,30 ℃摇振培养 4 d 后 ,6 000 rΠmin 离心 20 min , 得粗酶液 ,测酶活. 1. 2. 3 产植酸酶菌株的固体发酵
solid medium added 35 percent running water ,and phytase was extracted by 3 percent chloride calcium solution , the highest enzyme activity was obtained 1. 3 ×104 IU in every gram fermented product . Moreover it is better for produc2 ing phytase to add 4 percent ammonium sulfate and 0. 3 percent magneium sulfate to medium.
第 4 期 程海娜等 :产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究 345
报道的培养基的最佳含水率比较结果偏低 ,主要 是因为没有把麸皮中的含水量计算在内.
图 2 培养基加水量对 AN00101 产植酸酶的影响 Fig. 2 Effect of water added to medium on producing phytase
摘 要 : 通过初筛和复筛 ,得到一株产植酸酶较高的黑曲霉 AN00101 菌株 ,并对该菌种的产酶条件进行了研
究. 结果表明 :配制加水量为 35 %的麸皮固体培养基 ,在 37 ℃培养 114 h ,用 3 % CaCl2 进行提取 ,每 g 固体发酵
物酶活高达 1. 3 ×104 IU. 经 L9 (34 ) 正交实验表明 ,硫酸铵和硫酸镁对产酶有显著的促进作用 ,适宜添加量分别
图 1 黑曲酶 AN00101 在含植酸钙平板上形成透明水 解圈 Fig. 1 The hydrolysis bound result by A. niger AN01001 in plate containing calcium phytase
2. 2 产酶条件的研究 固体发酵与液体发酵相比 ,具有设备较简单 、
Key words : phytase ; Aspergillus niger ;screening ; conditions of producing phytase ( Life Science Research ,2002 ,6 (4) : 343～346)
植酸酶 (phytase ,EC3. 1. 3. 8) 是催化植酸及其 盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称. 植酸酶 添加在饲料中 ,将其中的植酸水解成肌醇和磷酸 , 提高了磷的利用率 ,降低了粪便中磷的排放量 ,减 少了植酸磷对环境的污染. 更为重要的是 ,植酸酶 可使植酸盐蛋白质络合物降解而提高蛋白质的利 用率 ,减少植酸盐对微量元素的螯合 ,提高植物饲
从表 1 中可以看出用乙酸缓冲液提取时 ,当 pH 为 5. 5 、6. 5 时酶活较高 ,在 pH 7. 5 时酶活明显 下降. 自来水进行提取时 ,在 pH 7. 5 时酶活最高 , 用自来水 (其 pH 为 7. 5) 提取的效果比乙酸缓冲 液稍好些 ,这说明在提取时不仅 pH 对酶收率有 影响 ,而且不同提取液所要求的最适 pH 也不同.
3 44 生 命 科 学 研 究 2002 年
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 培养基
筛 选 培 养 基 ( %) : 植 酸 钙 0. 1 , 葡 萄 糖 3 ,
NH4NO3 0. 5 , KCI 0. 05 , MgSO4·7HO2 0. 05 ,MnSO4· 7HO2 0. 003 ,FeSO4·7HO2 0. 003 , 琼脂 1. 8 ,pH 5. 7. 此培养基用于筛选真菌 ,牛肉膏蛋白胨培养基加 0. 1 %的植酸钙用于筛选细菌.
第 6 卷 第 2002 年 12
4期 月
生命科学研究 Life Science Research
Vol. 6
Dec.
No. 4 2002
产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究Ξ
程海娜 ,莫湘涛 ,陈 宇 ,谭海滨 ,周 雄 ,夏立秋
(湖南师范大学 生命科学学院 微生物学系 ,中国湖南 长沙 410081)
成本低 、酶产量高和易于投产等优点 ,所以产酶条 件的研究注重于对固体发酵的研究. 2. 2. 1 培养基最适加水量的确定
培养基中水分含量对菌体的生长及酶的产生 都有很大影响 ,水分含量太少不利于菌的生长 ,太 多不利于代谢产物的积累. 在 250 ml 三角瓶中装 入 10 g 麸皮 ,再加入不同体积的自来水 ,使加水量 占总质量的 30 %～70 % ,每相差 5 %为一个处理 , 在 30 ℃培养 4 d ,测酶活.
表 1 不同 pH的提取液对酶收率的影响 Table 1 Effect of different pH extract solution on producing phytase
料的营养价值[1～4] . 此外 ,植酸酶制剂在食品 、医 药等方面有广泛的应用. 但目前植酸酶制剂价格 昂贵 ,无法推广到饲料工业中 ,本研究的目的是筛 选出植酸酶高产菌株 ,丰富植酸酶基因资源 ,以利 于构建植酸酶基因工程菌 ,为大规模发酵生产廉 价的植酸酶制剂奠定基础[5 ,6] .
Ξ 收稿日期 :2002208223 ;修回日期 :2002211215 基金项目 :国家创新基金项目 (OOC26214300645) 作者简介 :程海娜 (19762) ,女 ,河南邓州人 ,硕士研究生 ,从事植酸酶分子生物学等方面的研究 ;莫湘涛 (19672) ,男 ,湖南湘潭人 ,湖 南师范大学讲师 ,从事微生物分子生物学等方面的研究 ;陈宇 (19722) ,女 ,贵州安顺人 ,湖南师范大学讲师 ,从事微生物分子生物 学等方面的研究 ;夏立秋 (19552) ,男 ,湖南安乡人 ,湖南师范大学教授 ,硕士生导师 ,通讯作者 ,主要从事微生物分子和酶工程研 究.
液体发酵培养基 :60 g 麸皮加入到 935 ml 水 中 ,再加入 5 g NaOH ,在 121 ℃处理 20 min 后 ,用 8 层纱 布 过 滤. 所 得 滤 液 加 入 ( 1 g per 100 ml ) : (NH4 ) 2 SO4 0. 04 、MgSO4·7HO2 0. 02 、casitone 1 、 KH2 PO4 0. 05 、K2 HPO4 0. 04 , 细菌培养基的 pH 为 6. 5 ,真菌培养基的 pH 为 5. 7.
图 3 发酵时间对 AN001011 产酶的影响 Fig. 3 Effect of fermented time on producing phytase
2. 2. 2 发酵时间对产酶的影响 在 250 ml 三角瓶中 ,每瓶装 15 g 固体发酵培
养基 ,从 72 h 开始每隔 6 h 测一瓶培养物的酶活. 从图 3 中可以看出在 90～120 h 酶活都比较高 ,在 114 h 时酶活最高 ,84 h 以前产酶量较低. 2. 2. 3 不同培养温度对产酶的影响
CHENG Hai2na ,MO Xiang2tao ,CHEN Yu ,TAN Hai2bing ,ZHOU Xiong ,XIA Li2qiu
( Department of Microbiology of Life Science College , Hunan Normal University , Changsha 410081 , Hunan , China)
挑取菌株接种于固体发酵培养基中 ,在 30 ℃ 培养 3～6 d ,每天翻动一次. 采用文献 [ 7 ]方法抽 提 ,得粗酶液 ,测酶活. 1. 2. 4 酶活力测定
粗酶液进行适当稀释后 ,取 0. 2 ml 加入 0. 6 ml pH 5. 5 0. 25 molΠL 乙酸缓冲液 ,在 37 ℃保温 5 min 后加入 8. 4 gΠL 植酸钠 1. 6 ml , 继续保温 30 min ,加入颜色Π终点混合液 1. 6 ml ,415 nm 测定无 机磷含量. 对照 :在 0. 2 ml 酶液加入 0. 6 ml 乙酸 缓冲液后 ,再加入 1. 6 ml 颜色Π终点混合液 ,最后 加入底物.