产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究
产阿魏酸酯酶菌株的筛选与产酶条件优化
DOI:10. 13995 / j. cnki. 11 - 1802 / ts. 026092 引用格式:段晓莉,江波,张涛. 产阿魏酸酯酶菌株的 筛 选 与 产 酶 条 件 优 化 [ J] . 食 品 与 发 酵 工 业,2021,47 (12) :154 - 160. DUAN
目标菌株纯培养物划线于 LB 平板,观察菌落形 态和颜色;并进行 革 兰 氏 染 色 及 菌 株 个 体 形 态 观 察 。 1. 5. 2 生理生化特征
参照《 伯杰氏系统细菌学手册》 [15] 及《 常 见 细 菌 系统鉴定手册》 [16] 进行目标菌株生理生化特征检测。 1. 5. 3 分子生物学鉴定
小麦麸皮:江苏无锡欧尚超市。 1. 1. 2 仪器与设备
Agilent 1200 型高效液相色谱仪,美国 Agilent 公 司;Waters ACQUITY UPLC 液相色谱串联四极杆飞行 时间质谱仪,美国沃特世公司。
第一作者:硕士研究生( 张涛教授为通讯作者,E-mail:zhangtao@ jiangnan. edu. cn) 基金项目:国家食品科学与工程一流学 科 建 设 项 目 ( JUFSTR20180203 ) ;江 南 大 学 食 品 科 学 与 技 术 国 家 重 点 实 验 室 自 由 探 索 资 助 课 题 项 目
自然,121 ℃ 灭菌 20 min。 筛选固体培养基 ( g / L) :NaNO3 2,K2 HPO4 ·3H2 O
1,KCl 0. 5,MgSO4 ·7H2 O 0. 5,FeSO4 ·7H2 O 0. 01,琼 脂 15 ~ 20;pH 值自然,115 ℃ 灭菌 30 min。 0. 22 μm 滤 膜过滤 100 mg / L 阿魏酸乙酯的 N,N-二 甲 基 甲 酰 胺 溶液,添加 10% ( 体积分数) 阿魏酸乙酯溶液至灭菌 培养基中,摇 匀 至 培 养 基 呈 均 匀 的 乳 白 色 溶 液 后 倒 平板。
高中生物浙科版选修一教师用书：第1部分-阶段整合提升Word版含解析
阶段整合提升网络构建一、微生物培养基的配方1．基本成分虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源、无机盐，原因是：微生物的化学组成与其他生物大体相同，也是主要由C、H、O、N、P、S等元素组成，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物，归纳为碳源、氮源、无机盐、水四大类营养。
2．培养基配方中四种营养成分比较注：自养型微生物的碳源是无机碳，异养型微生物的碳源是有机碳。
由此可见，培养不同类型的微生物，培养基的组成不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种基本物质。
二、实验注意事项在大肠杆菌的培养和分离的实验中，要特别强调无菌操作，这是进行微生物实验中必备的操作要求，也是本模块多数实验的基本要求，应该形成无菌操作的行为习惯。
无菌操作，既包括各种器皿必须是无菌的，也包括各种培养基也必须是无菌的，同时还要求在接种时，不能带有其他杂菌，所以在实验过程中，应时刻保持这种无菌意识。
辨认菌落和菌种种类时，要能大致区分细菌、放线菌与酵母菌菌落，有些用肉眼不能判断的菌落也可借助显微镜进行观察判断。
三、平板划线(划线分离)法和稀释涂布平板(涂布分离)法比较1．(2015·浙江自选节选)某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，开展了产该酶菌株的筛选、酶的固定化及其特性分析研究，其流程如下图所示。
土样中的菌种筛选→菌株鉴定→优良菌株扩大培养→植酸酶提纯→植酸酶固定化→植酸酶特性分析请回答：(1)土壤悬液首先经80 ℃处理15分钟，其目的是筛选出________。
(2)在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行________，然后涂布于含有植酸钠的固体培养基上。
培养后观察到________，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与________强弱相关。
(3)筛选获得的菌株经鉴定后，将优良菌株进行液体扩大培养。
培养时需要振荡，其主要目的是________。
液体培养基与固体培养基相比，不含有的成分是________。
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
关键词 ： 色木霉 ； 绿 愈创 木酚 ； 态学特征 ； 形 酶活 力
中图 分 类 号 ：９ ５ Ｑ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）３— ０ ０— ４ １０ ９３ （０ ８ ０ ０４ ０
刘 敏， 张 明
２ ０３ ） ３０６ （ 安徽 农 业 大学生命科 学 学院 ， 合肥
摘
要： 以愈创 木酚为底 物 ， 采用 平板 筛选法 筛选得到 一株 产漆酶 菌株 ＷＳ ． ， 态学特性表 明该 茵属 于绿 色木 １２ 形
霉。对产酶条件的初步研究结果表明 ， Ｉ ＷＳ 一 ２菌株 的产 酶高峰期 出现在接 种培 养后 的第 ４ 。与蔗 糖、 糖、 乳糖 ｄ 乳 半 和 可溶性淀粉相 比， 以葡萄糖 为碳 源时， 发酵上清液 的漆 酶活力明显要 高， 大值 达 ２０ ／ 。 以 Ｎ １ 最 ３Ｕ Ｌ Ｈ Ｃ 为氮源 ， 最 有利 于 ＷＳ － １２漆酶的产生 ， 酶活力最高可达到 ２ ４ ／ 。００ ｍｎｌＬ的愈创木 酚和 Ａ Ｔ 漆 ３Ｕ Ｌ ， １ ｒ ／ ｏ Ｂ Ｓ对 ＷＳ － Ｉ２产漆 酶有明
明 ， － ｉ： ｈ ｎｍ ｎ＠ ａａ．ｄ ． ｎ Ｅｍａ ｚａｇ ｉｇ ｈｕ ｅｕ ｃ 。 ｌ
基金项 目： 安徽省高校 “ 十五” 优秀人才计划（ 教秘人 １０４— ０ ） 【 ２０ １０
收 稿 日期 ：０７一 ４—２ ２０ ｏ ８
化变色圈的菌落进行分离纯化 。将分离菌株 分别接种
到筛选平板上 和 Ｐ Ａ平板 上 ，８Ｃ恒 温培养 ， 出筛 Ｄ ２￣ 选 选平板上 出现明显 氧化变色圈 的菌 株 ， 通过 Ｐ Ａ平 并 Ｄ
毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究
廛题科夔毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究刘林刘明河(临沂师范学院生命科学学院，山东临沂276005)喃要】Pi chi apas t or i s能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯，是一种极具潜力的酵母表达系统。
以毕赤酵母基因工程茵为实验菌种，探索其在不同条件下的产植酸酶睛况，优化发酵条件，找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而降低生产成本。
睽键词]Pi chi apas t or i s；酵母表达系统；植酸酶；发酵条件植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸，是一种优良的食品和饲料添加剂，可消除单胃动物因不能分解植酸而引起的抗营养作用，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，具有良好的饲喂效果，同时，刚氐了磷对环境的污染。
植酸酶真正具有开发价值的仅限于微生物经发酵生产植酸酶。
国外对植酸酶的研究已有30多年的历史，但由于天然来源的植酸酶或者提取困难，或者分泌量太低，或者成本太高，难以满足生产的需要，由此构建基因工程菌，获得能高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径。
巴斯德毕赤酵母(Pi c hi a pa st or i s)是一种极具潜力的酵母表达系统，它能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯：同时，自20世纪70年代起建立的以巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟，以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种，探索其在不同条件下的产酶隋况，就能找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而刚氐生产成本。
1酵母细胞培养时C源的选择由于一些重组蛋白对细胞有毒害作用，通常在大容量、高密度的酵母培养过程中，需要在细胞扩增阶段用极高密度的抑制物来阻遏其他表达系统，诱导前又需将之去除。
而对于P．pa st or i s在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物(通常为甘油)，既可以满足细胞生长，又能有效地抑制外源基因的表达；在表达阶段，让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导产酶。
利用原生质体诱变筛选植酸酶高产菌株
１ ． 菌种筛选 ．１ ２ １ ． １ 菌种初筛 ． １ ２ ．
．４ ２ 将实验 室保 存 的菌种运用稀 释平 板法分离 ，０℃ １ ． 植酸 酶酶活 的测定 ３ 以植酸 钠为底物 ， 采用钒 钼酸铵 法测定植 酸酶 的 培养 ３ｄ 选 取单 菌落 （０株 ） 入斜 面 培养 基 ， 种 ， ５ 接 每 菌 株斜 面接 入 到 １ 三 角 瓶 进行 发 酵 ．５ ｌ 角 个 ２０ ｍ 三 瓶装液 量为 ５ １ ３ ０ｎ ，０℃、０ ｍ ｎ摇瓶 培养 ７ ， ｌ ２ ０ｒ ｉ ／ ２ｈ 测
再生平板培养基 ： ０ｍ 培养基 中含葡萄糖 ４ 、 １ ｌ ０ ．ｇ ０
ＮＡ Ｎ０３０． ＫＣ１０．５ ｇ、 ｇ ０４ ７ ０ ．５ ｇ、 ｅ ３ ｇ、 ０ Ｍ Ｓ ‘ Ｈ２ ００ Ｆ Ｓ０４‘
７ ２ ． １ 、 Ｈ Ｐ ４ ．１ ， ０ ｏ ｌ ａ １ Ｈ ０００ Ｋ ＥＯ ０ 用 ． ｍ ｌ Ｃ 溶液配 ０ ｇ ０ ｇ ６ ／Ｎ 制， 自然 ｐ Ｈ值 ，２ Ｃ 菌 ２ ｉ。 １ １ｏ灭 ０ｍ ｎ
酶活 。
将 培养 ７ ２ｈ的发 酵液经 ４０ ０ｒ ｉ ０ ｒ ｎ离心 除去 菌 ／ ａ
体，利用 截流分 子量为 １ ０ ａ的透 析袋在 无离子 ００ ０Ｄ 水 中将上 清液透析 ２ｈ得到去 除无机磷 的酶液 。吸取 ，
李秀珍 ， 山东轻 工业学院 ，５ ３３ 山东省 济南市西部新 ２０５ ，
植 酸钠 （ 由美 国 Ｓ ｍ ｉ ａ公 司 提供 ） 钼酸 铵 、 醋 面接 入 ３个三 角瓶进 行平行发 酵试验 ，５ ｌ ｇ 、 冰 ２ ０ｍ 三角瓶 ０ｎ ，０ｏ ２ ０ｒ ｉ ｌ Ｃ ／ ２ｈ 测定 酸、 磷酸二 氢钾 、 水 乙酸 钠 、 三 偏钒 酸铵 、 萄糖 、 化 装液 量为 ５ ｌ ３ 、０ ｍ ｎ摇瓶 培养 ７ ， 葡 氯
产植酸酶菌株的筛选、诱变及酶学性质初探
１ 材 料 与 方 法
１ １ 土 样采 集 ．
成 透 明圈来 初 步判 断 该 微 生 物 是 否产 植 酸酶 ， 有 但 些 产酸 菌株 也 能 降解 植 酸 钙 产 生 透 明 圈 ， 平板 透 故
在 烟 台大 学 校 园 内多 个植 被 丰 富 的环 境 中 ， 除
收 稿 日期 ： ０ ２ ５ ９ ２ １－ － ０ ０
第２ ５卷 第 ４期
２１ ０ ２年 １ ０月
烟 台大 学学 报 （ 自然 科学 与工 程版 ）
Ｊｕ ａ ｏ ａｔ ｎｖｒｉ Ｎ ｔｒ ｃ ｎｅａ ｄＥ ｇ ｅｒ ｇＥ ｉｏ ） ｏｒｌ ｆ ｎａ Ｕ ｉｅ ｔ ｎ Ｙ ｉ ｓ ｙ（ ａ ａ Ｓ ｉ ｃ ｎ ｎｉ ｅｉ ｄｔ ｎ ｕｌ ｅ ｎ ｎ ｉ
染 ， ． 一
酸酶 活性 ， 反应 灵 敏 ， 色稳 定 效 果 很好 ， 显 因此 本 研
究 采 用 了该 方法 ． 通 过对 产植 酸酶 的野 生型 菌种进 行诱 变育种 是 提 高植 酸酶 产量 的一种 有 效 方 法 ． 研 究从 土壤 中 本
筛 选产 植 酸酶 的菌 株 ， 过 紫外 线 与 亚 硝基 胍 复 合 通 诱 变提 高 了产酶 活 力 ， 进一 步 的生 产 研究 打 下 了 为
的维 生素 Ｃ一硫 酸 一钼酸铵 一 石 酸锑 钾法 测定 植 酒
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
霞品研究与开发
Ｆｏ ｄＲｅｅ ｒ ｈ Ａｎ ｖ ｐ ｎｔ ｏ ｓａ ｃ ｄＤｅ ｄｏ ｍｅ
２１ ０ １年 ６月
第３ 卷 期 １ ２ 第６ １ ９
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
李 鑫玲 ’孙晓菲 ’孟楠 ’ 卜 ， ， ， 美玲 ’刘进 。
（． １河南科 技大学 食 品与生物 工程学 院 ， 河南 洛阳 ４ １０ ； ． 岛啤酒 （ ７０３ ２青 太原 ） 有限公司 ， 山西 太原 ０ ０ ３ ） ３０ ２
４ 结 语
Ｃ ｏｅｅ ［ ． ｕｒｉｎＲ ｓａｃ ， ０ ，６ ５ ６ ５ ０ ｒ ａ ｔｎｓＪ Ｎ ｔ ｔ ｅｅｒｈ ０ ６２ ： ５ — ６ １ ｉｏ ２ 【】 Ｊｎ ａ Ｍ． ｏｄ ＇－ ｕｉ＇ ｅ ｎ ｒ ｏｏｅ ｕ ｕ ｅＣ ｓ ｏ ３ ａｎｔ Ｒ ｌａ Ｇ ｔ ｒ ｚａｄＭａ ａＤ ｌｒｓＬ ｑ ｅｄ ａｔ ． ｎ ｅｒ ｉ ｒ
摘 要 ： 土壤样本 中分 离出一株具有较 高活力 的产脂肪酶 菌株 ， 步确定为假 单胞菌属。对该 脂肪 酶产 酶条件进 从 初
行 优 化 ， 佳 碳 源为 糊精 、 最 氮源 为 硫 酸铵 ， 适发 酵 温度 为 ３ ， 最 ０℃ 最适 起 始 ｐ 为 ７ 。 Ｈ ． ０
关键词 ： 脂肪酶 ； 假单胞菌属 ； 产酶条件
６・ Ｏ
芎。 ０ 墓４ 。 ０
赡 ３０ ．
速搅 拌均匀 ， 高压灭菌倒板前再用磁力搅拌器混匀 ； 种
子培养 基 （ ： 萄糖 ２ ，Ｎ ２ ．， Ｐ ４ ．， ％）葡 ． （ Ｈ ） ０ ０ ＫＨ Ｏ ０１ ０ ｓ ５ 橄榄油 １ ， Ｓ ７ ． ， 白胨 ２５ ｐ ．； 酵 ． ＭｇＯ ・Ｈ ００ ５ 蛋 ０ ０ ．，Ｈ ７ 发 Ｏ 培养基（ ： 白胨 ２ ， ％）蛋 ． 蔗糖 ０ ， ０ ． 橄榄油 １ ，Ｎ ４￣ ４ ５ ． （ Ｈ ） Ｏ ０ Ｓ
青霉菌产植酸酶液体发酵条件研究
山西大学学报(自然科学版)21(3):263~267,1998Journal of Shanxi University(Nat.Sci.Ed.)青霉菌产植酸酶液体发酵条件研究*褚西宁赵美蓉***裴武红**(山西大学生命科学系,太原030006)摘要从油脂废料中分离到一株产植酸酶的青霉菌株。
研究了不同碳源,氮源对青霉菌液体发酵产植酸酶的影响。
结果最佳碳源为蔗糖,玉米淀粉。
最佳氮源为硝酸铵、蛋白胨。
通过正交试验获得适于产植酸酶的液体培养基的配方为:玉米淀粉2%,蔗糖1.5%,蛋白胨1%,硝酸铵0.2%以及少许无机盐。
在此基础上,对其他影响植酸酶产生的因素也作了研究。
关键词青霉菌,植酸酶,培养基配方中图法分类号Q81植酸广泛存在于油料,谷物等种子中,常以植酸钙(镁)盐的形式存在。
植酸是金属的强螯合剂、常使饲料中的磷、钙、锰、锌及其他微量元素无法得到充分利用,植酸也使体内的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等的活性降低。
单胃动物不分泌植酸酶,因此,饲料中的植酸将降低了单胃动物对矿物质和蛋白质的利用率并随粪便排出体外污染环境。
植酸酶可以降解植酸成为肌醇和无机磷酸。
添加到饲料中,可以提高单胃动物对饲料的利用率。
[1,2]我们分离到一株产植酸酶的青霉菌株P3对此菌株的液体培养基组成,配比及影响产酶的其他条件进行了研究,现将研究结果报导如下。
1材料与方法1.1培养基1.1.1斜面菌种PDA培养基1.1.2液体发酵培养基可溶性淀粉4%葡萄糖1%M gSO4.7H2O0.05%KCl0.05%FeSO40.01%(NH4)2SO40.7%K2HPO40.02%pH自然*省自然科学基金资助(591028)**现为军事医学科学院基础医学研究所博士生***现任教于山西长治医学院微生物学教研室收稿日期:1997-12-20264山西大学学报(自然科学版)21(3)1998灭菌1.1.3碳源试验培养基单(双)糖碳源试验:将液体发酵培养基中的葡萄糖用其它单(双糖)替代。
环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
生物化工 Biological Chemical Engineering
文章编号：2096-0387（2019）06-0036-04
Vol.5 No.6 Dec. 2019
环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
刘静，刘张虎，张雨霏
（湖北大学知行学院，湖北武汉 430011）
1 实验材料
1.1 土壤样本及菌种 本实验所使用土壤样本采集自湖北大学知行学
作者简介：刘静（1980—），女，湖北鄂州人，硕士，讲师，研究方向：生物工程教育研究。
第2期
刘静等：环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
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院周边，取样地主要为食堂排水渠污泥、餐馆垃圾处 2 实验方法
理处和学生公寓垃圾堆放处附近土壤。
司；胰蛋白胨（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限
将初筛所得菌株点样接种于酪素平板上，于 37℃
公司；酵母提取物 ( 分析纯 )：OXOID；葡萄糖、乳糖、 恒温培养箱中培养 24h 后挑选出 5 个透明圈与菌落
蔗糖（均为分析纯）：上海展云化工有限公司；果糖（生 直径比比值较大的菌株，接种于 50 mLLB 液体培养基
2.1 菌株富集与初筛
土壤样品中筛选得到并优化培养的菌株为一株
每 份 土 壤 样 品 加 入 无 菌 水 稀 释，取 稀 释 液 各
短杆细菌。 1.2 试剂
0.1 mL 均匀涂布于 LB 平板中，置于 37℃恒温培养箱 中培养 24 ～ 36h 后观察菌落生长状况，并挑选出清
干酪素、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试 晰的单菌落在斜面培养基进行划线培养。将分离出
应用于环保行业中 [3]。 土壤中的微生物种类繁多，易于从中筛选出产蛋
植酸酶高产菌株的选育
植酸酶高产菌株的选育李彦芹;李春青;周洁芳;庞志多;王凤华【摘要】从土壤中分离到1株植酸酶高产菌株Pe0,初步鉴定为米曲霉.为了提高植酸酶活力,对Pe0菌株分别进行紫外线和亚硝基胍诱变处理,经初筛、复筛、遗传稳定性能检测,得到1株酶活相对较高、性状相对稳定的菌株Pe2#,酶活稳定在10.66 U/mL,较原始菌株提高到3.34倍.另对其发酵条件进行优化,确定最适接种量为4％,最适pH为5.5,最适培养时间为6.5d.在此基础上进行培养基正交优化,结果表明:葡萄糖质量浓度为25 g/L,蛋白胨质量浓度为4 g/L,(NH4)2SO4质量浓度为2 g/L,MgSO4·7H2O质量浓度为0.1 g/L时所得菌株产酶活力最高.%In order to get the mutant strain which was stable and high production of phytase,the original Aspergillus oryzae strain Pe0 isolated in our laboratory was the staring strains,which were mutagenized separately by UV and nitrosoguanidine.By preliminary screening,rescreening and the detection of genetic stability,Pe2 #was obtained which had a relatively high activity and stable characteristics.Its stable activity was 10.66 U/mL,which increased 3.34 times comparing with original strain.To determine the optimum conditions for its enzyme productions,the fermentation conditions were optimized.The composition of the optimum medium were 25 g/L glucose,4 g/L peptone,2 g/L (NH4)2SO4 and 0.1 g/L M gSO4 · 7H2O.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(033)004【总页数】7页(P394-400)【关键词】植酸酶;诱变;选育;发酵优化【作者】李彦芹;李春青;周洁芳;庞志多;王凤华【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】Q935植酸(肌醇六磷酸)及其盐类是植物种子中磷普遍存在的形式，是植酸性饲料中普遍存在的一种抗营养因子，因其在吸收过程中易于和动物肠道内的金属离子，如Ca2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+等，以及与蛋白质形成不溶性络合物[1]，所以在生物体内的利用率很低.植酸酶(phytase)是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和六磷酸的一类酶的总称，系统名称为肌醇六磷酸酶，是一类特殊的酸性磷酸酶，可以抑制植酸对矿物质和蛋白质的亲和，解除植酸的抗营养作用，增加磷的利用率，降低农业生态负担.目前在婴儿食品、饲料的添加剂、废弃物处理等领域发挥重要作用.本实验对分离纯化的菌株Pe0进行诱变选育，获得产酶活力高的突变株，并对其进行性状稳定性研究及发酵条件优化，旨在得到产酶活力较高、性状相对稳定的菌株，以期对生产实践及科学研究提供一定的参考.1.1 菌种菌株Pe0,本实验室分离纯化菌种.1.2 试剂及培养基甲酰胺，亚硝基胍，三重蒸馏水， pH 5.5的醋酸缓冲液，植酸钠溶液，钼酸铵试剂，钒酸铵试剂，钒钼酸铵显色/终止液，乳酸石炭酸棉蓝染液；查氏培养基，初筛产酶培养基[2]，液体发酵培养基[2].1.3 实验仪器ZHWY-2102型双层大容量全温度恒温培养振荡器(上海智城分析仪器)；TDL-5型台式低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；722E可见分光光度计(上海光谱仪器). 2.1 鉴定将Pe0菌株根据《中国真菌志》[3]进行菌种鉴定，观察其菌落、分生孢子穗、分生孢子等的特征.2.2 酶活测定取4支10 mL离心管，其中1支作空白对照，分别加入3.0 mL植酸钠溶液，置于37 ℃水浴锅中预热5 min，然后每隔1 min依次在反应管中加入1.0 mL植酸酶提取液，在37 ℃水浴锅中温育30 min，每隔1 min加入4.0 mL钒钼酸铵显色/终止液，然后在空白管中加入1.0 mL植酸酶提取液，混合摇匀，4 000 r/min 离心10 min.于415 nm波长处测吸光度，参照磷标准曲线计算酶活[4].植酸酶酶活定义：在温度为37 ℃,pH 5.5 的条件下，每min从浓度为5.0 mmol/L 植酸钠溶液中释放1 μmol无机磷，即为1个植酸酶活性单位，以U 表示[5].磷浓度标准曲线见图1.酶活力单位定义：在37 ℃、pH 5.5条件下，在植酸钠溶液中每min释放1 nmol 无机磷所需要的酶量为1个酶活力单位.2.3 诱变处理将菌株Pe0转接到查氏培养基上28 ℃培养7 d进行活化.制备1～5×106 mL-1的孢子悬液，分别进行紫外线(15 W紫外灯30 cm处充分照射3，5，7，9 min)和亚硝基胍(300，400，500，600 μg / mL)的单因子诱变.经过中间培养，初筛、复筛并采用钒-钼酸铵法测酶活力，筛选酶活更高的菌株.2.4 菌株产酶稳定性测定将复筛得到的酶活高的菌株接种到液体发酵培养基上传代培养5代，每代测定其酶活，判断其遗传稳定性.2.5 发酵条件优化对获得的遗传性能稳定的菌株分别进行接种量、pH、发酵时间[6]及培养基成分的优化.3.1 菌种鉴定将菌株Pe0接种于查氏固体培养基，28 ℃培养4 d后，菌落直径平均为2.0 cm.最初菌落质地疏松，为白色，后转为黄色、黄褐色.分生孢子头呈放射状，其分生孢子梗有横隔，分生孢子为球形或椭圆形(图2).根据《真菌鉴定手册》初步鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae).3.2 菌株的诱变诱变得到200个菌株，对其中透明圈与菌落直径比值较大的9株进行复筛，其酶活测定结果见表1.诱变前后对比，菌落形态发生了一些变化：经紫外线诱变后的平板菌落比原始菌平板菌落大且厚实.这说明菌体经紫外线诱变作用，菌体基因确实受到影响，内在基因的变化导致菌体表观的改变，诱变效果较明显.经亚硝基胍处理的菌落形态无明显变化.紫外线诱变使植酸酶酶活由原来的3.19 U/mL最大增加到18.00 U/mL，为原始菌株的5.61倍；经亚硝基胍诱变后，植酸酶酶活由原来的3.19 U/mL最大增加到22.81 U/mL，为原始菌株的7.15倍.由此可见，透明圈与菌落直径比与酶活有一定的关系，但不完全是正相关.综合比较舍弃Pe1#，Pe1，Pe3.3.3 遗传稳定性将筛选出的Pe2#，Pe3#，Pe4#，Pe2，Pe4，Pe5菌株进行遗传稳定性检测，其结果如表2所示.比较表2各菌株传代的平均酶活，并进行方差分析，其稳定性最好的菌株为Pe2#,结果如表3，表4.由表4的均方值看出，Pe2#菌株具有较好的遗传稳定性.通过方差分析，其组间差异的P值远远大于0.05，说明传代次数对酶活性变化影响不显著，即传代次数未对其产酶活性产生影响，表明其具有稳定的遗传性，因此对该株菌进行下一步的研究.3.4 发酵条件优化3.4.1 最适接种量、pH、发酵时间的确定由图3可知，随接种量增加，酶活也不断地增加，接种量为4%时，酶活达到最高，接种量接近7%时，酶活很低，可能由于接种量过大引起菌种内部竞争，营养物质缺乏，产酶能力降低.由图4可以看出，最适pH为5.5.当pH低于5.5时，酶活在pH 4.5时高于pH 5，可能是由于粗酶液中含有植酸酶多种同功酶所致.当处于碱性环境中，基本不产酶，但在pH 6.5时出现1个小峰值，可能是在此条件下酶活部分恢复所致[7].由图5可知，4～6 d，酶活逐渐增加，培养至6.5 d时，酶活显著提高并达到最高，随着培养时间的增长，酶活反而降低.所以其最适培养时间为6.5 d.3.4.2 培养基成分优化的正交实验结果及分析采用L9(34)正交实验(表5)测定培养基中葡萄糖(A),蛋白胨(B),(NH4)2SO4(C),MgSO4·7H2O(D),对Pe2#菌株产酶的影响.由表6的R值数据及图6综合分析，各因素对产酶影响的大小依次为蛋白胨(B)>(NH4)2SO4(C)>MgSO4·7H2O(D)>葡萄糖(A)，其最佳组合为A3B3C2D1，即葡萄糖的质量浓度为25 g/L，蛋白胨质量浓度为4 g/L，(NH4)2SO4的质量浓度为2 g/L，MgSO4·7H2O的质量浓度为0.1 g/L .经计算，发现A(葡萄糖)的极差(R=9.63)、均方差值相对于因素B(蛋白胨)、C因素((NH4)2SO4)和D(MgSO4·7H2O)的极差、均方差很小，F值不显著，故对A 不做方差分析，将其作为误差项.因素B(蛋白胨)、C((NH4)2SO4)和D(MgSO4·7H2O)的均方差相对较大(表7)，说明其对米曲霉的产酶影响很大.本实验从土壤中分离到1株植酸酶高产菌株Pe0，初步鉴定为米曲霉，对Pe0菌株分别进行紫外线和亚硝基胍诱变处理，经初筛、复筛、遗传稳定性检测，得到1株酶活相对较高、性状相对稳定的菌株Pe2#，酶活稳定在10.66 U/mL，较原始菌株提高到3.34倍，相较于张卫兵[7]、王尊生等[8]实验得到的植酸酶活力提高1～3倍，并较常见曲霉属微生物内植酸酶的酶活显著提高了10倍.另对其发酵条件进行优化，确定最适接种量为4%，最适pH为5.5，最适培养时间为6.5 d.在此基础上进行培养基正交优化，结果表明,葡萄糖质量浓度为25 g/L，蛋白胨质量浓度为4 g/L，(NH4)2SO4质量浓度为2 g/L，MgSO4·7H2O质量浓度为0.1g/L时所得菌株产酶活力最高.本研究为该菌株更好地服务于饲料、食品等行业提供了一定的参考依据.【相关文献】[1]蔡鸿杰，李卫春，侯世洁，等.植酸酶分泌菌株的筛选研究[J].天津师范大学学报：自然科学版, 2006,26(2):19-22.CAI Hongjie, LI Weichun, HOU Shijie, et al. Screening of strains secreting phytase[J]. Journal of Tianjin Normal University:Natural Science Edition, 2006,26(2):19-22.[2]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979:132-135.WEI Jingchao. Fungal identification[M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 1979:132-135.[3]施安辉，王光玉，王秋霞.植酸酶高产菌株的选育及固态产酶条件的优化[J].山东食品发酵，2002,126(3):19-21.SHI Anhui, WANG Guangyu,WANG Qiuxia. The phytase producing strain breeding and solid state fermentation conditions optimization [J]. Shandong Food Fermentation, 2002,126(3): 19-21.[4]彭益强.植酸酶高产菌株的诱变选育和融合筛选[D].泉州：华侨大学,2002.PENG Yiqiang. Phytase high yield strains by induced mutation and screening fusion [D]. Quanzhou:Huaqiao University,2002.[5]中国国家标准化管理委员会.GB/T 18634—2009 [S].北京：中国标准出版社，2009.[6]SUNITHA K, KIM Y O, LEE J K. Statistical optimization of seed and inductions to enhance phytase production by recombinant Escherichia coli[J]. Biochemical Engineering Journal, 2000,5: 51-56.[7]张卫兵.高产植酸酶菌株的选育和培养条件的研究[D].西安：西北大学,2004.ZHANG Weibing. Screening of phytase-producing strainand studies of culture conditions[D]. Xi’an:Xibei University, 2004.[8]王尊生，王升厚，佟泽.青霉植酸酶的初步研究[J].微生物学杂志,2001(3): 59-60.WANG Zunsheng, WANG Shenghou, TONG Ze. Preliminary study of peniciliium producing phytase[J]. Journal of Microbiology,2001(3): 59-60.。
植酸酶高产菌株的选育及酶的分离纯化和性质研究的开题报告
植酸酶高产菌株的选育及酶的分离纯化和性质研究的开题报告一、选题背景和研究意义植酸是存在于豆类、谷类、油料、棉花籽等植物种子中的一种主要磷源，可作为家禽、家畜饲料添加剂，在农业生产中具有重要的应用价值。
然而，植酸作为一种反式结构的磷酸盐与矿物质结合紧密，难以被家禽、家畜消化吸收，导致营养物质的浪费。
因此，研究植酸酶的生物学特性和应用具有重要的理论和现实意义。
植酸酶是一种能够水解植酸为无机磷酸盐和次生代谢产物的酶，广泛存在于真菌、细菌和植物中。
通过筛选高效的植酸酶产生菌株，研究酶的分离纯化和性质，可以为实现植酸酶的工业化生产提供技术支持。
二、研究内容和目标本研究的主要内容包括选育高产植酸酶的细菌菌株、酶的分离纯化及性质研究。
具体目标如下：1. 通过菌落形态、生理生化特性及酶活性等方面的综合分析，筛选出高产植酸酶的细菌菌株；2. 采用离子交换、凝胶过滤等方法对酶进行初步的分离纯化，并对纯化后的酶进行酶活测定和SDS-PAGE电泳分析；3. 研究酶的最适温度、最适pH、热稳定性、储藏稳定性等性质。
三、研究方法和技术路线1. 选育高产菌株的方法：分离土壤中的细菌，并通过菌落形态、氧气需求条件、革兰氏染色、生理生化试验、文献查阅等手段，筛选出高产植酸酶的菌株；2. 酶的分离纯化：采用盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和柱层析等方法分离纯化酶，用不同浓度NaCl进行纯化后测定酶活，用SDS-PAGE电泳分析纯化后的酶的分子量；3. 酶性质的研究：测定酶的最适温度、最适pH、热稳定性、储藏稳定性等性质。
四、研究预期成果1. 筛选出高产植酸酶的细菌菌株，为后续工业化生产提供选育菌株的参考；2. 纯化出植酸酶，研究其最适温度、最适pH、热稳定性等性质，为酶的应用提供基础和参考，同时为植酸酶的工业化生产提供技术支持；3. 为解决植酸酶工业化生产中的技术难题，提供新的研究思路和方向，推动植酸酶的应用和推广。
植酸酶产生菌的筛选
植酸酶产生菌的筛选一、实验目的要求：1、明确透明圈法筛选植酸酶产生菌的原理；2、掌握从土壤中筛选微生物的基本要点；3、掌握自然选育菌株的初筛方法。
二、实验原理：植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。
菌株若产植酸酶，可以将培养基中不溶的植酸钙水解，从而在单菌落周围出现透明圈，一般来讲，透明圈与菌落直径比越大，则该菌株产植酸酶的活性越强。
三、实验试剂葡萄糖15 g·L-1，植酸钙5.0 g·L-1，(NH4)2SO4 3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.1 g·L-1，MnSO4·7H2O 0.1 g·L-1，琼脂20 g·L-1，pH7.0四、实验步骤1、取土样在枯枝败叶较多的地方，土层厚度大约8cm；2、溶解取5 g土样于100 mL烧杯中，加入45 mL无菌生理盐水，用玻璃棒不停地搅拌，待大颗粒溶解后，全部倒入100 mL锥形瓶，于100r·min-1的摇床上离心30 min，放入无菌室静置。
3、涂布菌悬液梯度稀释：用枪头取0.9 mL无菌水于2个离心管中，分别编号为10-1和10-2，打开装有土壤菌悬液的锥形瓶，取0.1 mL上清液注入编号为10-1离心管，盖上盖子摇匀，更换枪头从编号为10-1离心管取0.1 mL菌悬液，注入编号为10-2离心管，盖上盖子摇匀。
涂布过程：取3个平皿，分别注入0.1 mL土壤菌悬液，用三支已灭菌涂布棒涂匀静置，同上操作涂布10-1与10-2浓度的土壤菌悬液。
培养箱培养，在28℃下培养4天，从培养24h起，以后每12h观察一次，直至平皿中出现透明圈，立即进行菌种的纯化。
4、计数统计透明圈的数目，并计算最大透明圈与菌落直径的比值。
五、实验结果每个稀释度相应透明圈的数目；最大透明圈与菌落直径的比值。
产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定【文献综述】
文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。
这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。
在发酵堆肥中，有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。
菌株需要1。
内切葡萄糖苷酶(endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称EC 3.3.1.4，EBG)，也称为Cx酶，CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤维素小分子。
2.胞外-1，4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91)，也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH)，它从纤维素长链的非还原端水解β-1，4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶，EC3.2.21，缩写为BG)，也称为纤维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。
随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低，这种酶的特异性相对较差。
只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。
就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量，因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。
只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。
从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。
使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源，并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。
刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。
黑曲霉液态发酵生产植酸酶的动力学研究_石坚
黑曲霉液态发酵生产植酸酶的动力学研究石 坚1 孙君社1 苏东海1 经 玲2(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;2.中国农业大学理学院,北京100083)收稿日期:2002-09-16作者简介:石 坚,硕士研究生;孙君社,博士,教授,研究方向为生物技术在农产品加工中的应用。
摘 要 对黑曲霉(Aspergillus niger N D313)液态发酵生产植酸酶的发酵过程和发酵动力学进行了研究。
在摇瓶试验得到基本发酵工艺参数的基础上,应用10L 生物反应器进行放大试验取得了较好的结果,其最大菌体量(干重)达到1.19g ·100mL -1,酶活力达到3.6u ·mL -1。
试验通过分批补料手段控制比生长速率的变化,得到了描述发酵过程的动力学模型并回归了模型参数。
利用数学计算软件对试验数据与模型进行拟合,结果证明所建立的动力学模型能较好地反映并预测植酸酶的发酵过程。
关键词 黑曲霉;植酸酶;液态发酵;动力学模型中图分类号 T Q 920.1 文章编号 1007-4333(2003)02-0045-04 文献标识码 AKinetics stu dy on the production of phytase in submergedfermen tation by Asp .nigerShi Jian 1, Sun Junshe 1, Su Don ghai 1, Jin g Lin g 2(1.College of Fo od Science &Nutritio nal E n gineerin g ,China A gricu ltural University ,B eijin g 100083,China ;2.College of S cien ce ,China A gricultural U niversity ,Beijin g 100083,China )Abstract Based on the p rimary fermentation p arameters ob tained from flake cultures ,the law of g rowth and m etabolism of Asp .niger ND 313and the fermentation kinetic models were studied in an auto control b ioreactor .The fermentation in bioreactor was successfully p erformed with a maxim al biomass concentration (d ry m ass )of 1.19g ·100mL -1and a maximal enzym e activity of 3.6μ·m L -1.Then the kinetic formula of cell growth rate ,phytase produc -tion rate and glucose consumption rate were inferred by controling the specific biomass growth rate .The results of m athem atic fitting between model cal culated values and experimental val ues p roved the valid i ty and rationality of the kinetic model s .Key words Asp .niger ;phytase ;submerg ed -fermentation ;kinetics m odel 来源于微生物的植酸酶(Phy tase ,EC .3.1.3.8)能催化植酸,使其水解为各级磷酸肌醇、肌醇和正磷酸盐的混合物。
一株产植酸酶菌株的分离鉴定及其产酶特性_李丽娟
一株产植酸酶菌株的分离鉴定及其产酶特性李丽娟1,2，张殿昌1，苏天凤1，龚世园2，江世贵1（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300；2.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070）关键词：植酸酶;黄蓝状菌; 18S rDNA; 真菌鉴定中图分类号：Q93-331 文献标志码：A 文章编号：1673-9159(2007)04-0089-05Isolation and Identification of a Phytase -Producing StrainLI Li -juan 1,2, ZHANG Dian -chang 1, SU Tian -feng 1,GONG Shi -yuan 2,JIANG Shi -gui 1(1.South China Sea Fisheries Research Institute ，Chinese Academy of Fishery Sciences ，Guangzhou 510300，China ；2. College of Fisheries, Huazhong Agricultural University ，Wuhan 430070，China ) Abstract: 61 phytase -producing strains have been isolated from 6 soil samples and 1 distillers ’ grain sample. Among them, one has the maximum diameter ratio of its clear zone to its colony on the MSA plate. This strain was identified as Tarlaromyces flavus according to its morphological properties and the analysis of its 18S rRNA gene sequence. Its enzyme activity is 294 U/mL by liquid fermentation after incubation at 32 ℃ for 8 days. There is no report about phytase -producing Tarlaromyces flavus so far, so this discovery enriches the resources of phytase -producing strains and provides a new material for exploiting phytase. Key words: Phytase; Tarlaromyces flavus ; 18S rDNA; fungal indentification植酸酶（phytase ）是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸（或盐）的一类酶的总称，是一类特殊的酸性磷酸酶。
植酸酶筛选菌株的研究
植酸酶菌株筛选的研究摘要：从土壤以及腐质土中筛选得到产中性植酸酶的菌株, 对透明圈直径与菌落直径之比大的菌株进行复筛,将得到的高产菌株进行斜面培养并保存，以进行进一步的研究。
关键词：植酸酶，透明圈，筛选植酸酶，即肌醇六磷酸磷酸水解酶，是一类特殊的正磷酸单酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸。
作为一种新型的饲用酶制剂，它可使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷排泄量减少40%，而且能够通过降低植酸盐的抗营养作用，增加动物对蛋白质和一些金属离子的吸收能力。
目前，植酸酶已经开始试用在植物性食品中，达到分解植酸磷，平衡营养的作用。
植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌中，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入。
不同来源的植酸酶多种多样，根据最适pH 值的不同，植酸酶可分为酸性植酸酶、中性植酸酶和碱性植酸酶，中性植酸酶主要应用于消化道无胃、肠道呈中性的淡水鲤科鱼类饲料，对提高鱼类的生长效益、品质及降低饲料中植酸磷对环境的污染有重要意义，近几年在水产上受到重视。
此外，中性植酸酶还可在pH值逐渐升高至中性的单胃畜禽动物肠道中起作用，延长植酸酶在整个动物胃肠道中的作用时间，提高其有效性。
目前已分离出多种产中性植酸酶的芽孢杆菌(Bacillus)主要是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)及其他菌株(Bacillus sp.)等。
本研究拟从自然界的土壤中筛选出新的产中性植酸酶的菌株，以期进一步开发对产中性植酸酶研究，为其应用打下基础。
1、实验准备1. 玻璃器皿的洗涤将锥形瓶，试管，培养皿，量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。
移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。
洗涮干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析
第１期
彭远义等： 植酸酶高产菌株的筛选及其基因分析
１０９
物生产性能， 减少粪便中磷的排放量， 降低磷对环境 的污染 （Ｈｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｌｅｉ ａｎｄ ｓｔａｈｌ， ２００１）。 植酸酶主要存在于植物和微生物中，其中以微 生物产生的植酸酶具有良好的开发前景。通过植酸 酶产生菌的筛选和基因克隆，并利用分子生物学技 术构建基因工程菌，或在分子水平上改造植酸酶基 因， 以提高植酸酶产量或改变植酸酶酶学性质， 从而 降低生产成本， 提高其使用有效性， 已成为世界性的 研究热点之一 （ 姚斌等 ， １９９８； 王红宁等 ， ２００１； Ｅｒｉｃ
Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １０２ ｐｈｙｔａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ． Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ａｃｔｉｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｍ， ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ０３２１４， ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｐｈｙＡ 基因的完整序列， 基因全长 １ ５０６ ｂｐ， 其中包含一段长 １０２ ｂｐ 的内含子， 编码 ４６７ 个氨基酸， 有 １０ 个潜在的糖基化位点，
５’ 端有一编码 １９ 个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶的进一步研究提供了新的材料。 关键词： 植酸酶； 黑曲霉 ０３２１４； ｐｈｙＡ 基因； 序列分析
（１． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１６， Ｃｈｉｎａ；
植酸酶高产菌株的筛选与酶的分离纯化 精品
植酸酶高产菌株的筛选与酶的分离纯化一、研究意义植酸酶是催化植酸及植酸盐水解为肌醇与磷酸（磷酸盐）的一类酶的总称。
植酸及其盐类普遍存在于植物体中，是植物种子及营养器官中磷的主要贮存方式，一般植酸磷占禾谷种子及油料作物总磷60%~80%。
在人和单胃动物食物中，植酸具有强烈的抗营养作用。
这是由于一方面人和单胃动物缺乏分解植酸的酶类，无法利用植酸中的磷，另一方面植酸能与矿质元素如铁锌、钙和镁等蛋白质形成不溶性的稳定的复合物，降低了矿质元素和蛋白质的利用率。
植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。
二、实验目的从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株，利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和Sephadex G-100 凝胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。
三、实验材料3.1 材料3.1.1（1）筛选培养基：1%植酸钙，3%葡萄糖，200U/ml 青霉素钠，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO4.4H2O，0.05%MgSO4.7H2O，0.003% FeSO4·7H2O，1.5%琼脂，pH5.5。
（2）液体发酵培养基：1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.003% FeSO4.7H2O，pH5.5。
（3）查氏合成培养基：硝酸钠 2g，磷酸氢二钾 1g，氯化钾 0.5g，硫酸镁 0.5g，硫酸亚铁 0.01g，蔗糖 30g，琼脂 15~20g，水 1000mL，pH 自然，121℃灭菌20min。
（4）斜面培养基：0.05%MgS04·7H2O，0.003%MnSO4·7H2O，0.003%FeSO4·7H20，麸皮汁100ml，1.5~2%琼脂，pH5.5。
植酸酶在饲料中的研究应用
植酸酶在饲料中的研究应用作者：宫宇姚玲珑闫昭明赵蕾来源：《湖南饲料》 2019年第3期摘要:植酸酶催化水解植酸为肌醇与磷酸,为动物生长发育所利用。
植酸酶可以改善动物生产性能,降低生产成本,减少环境污染等。
本文综述了植酸酶的来源、特性、作用原理及其在畜禽、水产饲料中的最新应用和效果等,以期望为植酸酶在饲料中进一步的应用推广提供参考。
关键词:植酸酶:作用原理:饲料:研究应用磷是动物生长发育必需的营养元素之一,对动物生长发育有重要的作用.植物种子中的磷主要以植酸形式贮存,玉米、豆粕、菜粕所含的磷约40%-70%主要以植酸磷形式存在.由于单胃动物消化道内缺乏能分解消化植酸磷的酶,所以饲料中绝大部分磷从动物粪便中排出,进入水体,造成水体富营养化.因植酸酶可以改善动物机体对日粮中磷和其他营养成分的利用率,成为了人们关注的焦点.然而,由于不同研究间在日粮结构、测定指标上存在差异,导致植酸酶的最佳添加量与所能替代的无机磷量不完全一致,因此植酸酶在实际应用过程中,首先需要确定日粮中植酸酶与所能替代无机磷之间的数量关系.即植酸酶的磷当量.现在低蛋白日粮配制技术发展迅速,在合理添加氨基酸和酶制剂的前提下,配合饲料中粗蛋白和磷水平可以显著降低.为推动饲料行业科技进步.减少饲料原料消耗.降低养殖业对环境造成的污染,中国饲料工业协会对猪、禽饲料中的总磷设定了总体标准,即总磷在常规条件下只设定下限值的基础上增设了上限值.总而言之.为了满足动物在种种约束下对磷的需要,最好的方法是在动物日粮中添加植酸酶.1 植酸与植酸酶植酸又称六磷酸肌醇.能够结合矿物质(磷、镁、铁等)和蛋白质,同时形成的螯合物能够降低动物对磷的吸收效果.在植物饲料中,植酸通常与磷结合,所以又被称作植酸磷,常用饲料原料中的植酸磷含量一般不同.植酸酶可以催化植酸及其盐类.能够分解植酸分子中的磷,将植酸或其盐类降解为能被畜禽利用的肌醇和无机磷。
国际上通常把植酸酶分为两类:3-植酸酶和6-植酸酶,它们分别能够水解植酸分子上第3位和第6位磷酸基团.其中3-植酸酶由于性质更稳定,可耐酸和耐高温,在动物饲料中被广泛使用.2植酸酶来源植酸酶广泛分布于各种生命形式,最早由Suzuki等于1907年在米糠中发现,后来又相继在多种微生物和动物组织中检测到植酸酶的存在.植酸酶的来源不同.其在动物生产中的作用效果也不一样.由于微生物源植酸酶最适pH值的作用范围与动物消化道环境更匹配.其在动物饲料中的应用也最为广泛.高温制粒和高温消毒是现代饲料工业中常用的加工工艺.饲料用酶必须在常温下具有较高的酶活性,因为饲料用酶最终的作用场所在动物的肠道中,一般在37℃左右.因此,筛选具有热稳定性的植酸酶是目前的一个研究热点.2.1植物源植酸酶植酸酶广泛存在于植物界中.已分离出具有植酸酶活性的植物有黑小麦、玉米、大麦、稻、小麦、绿豆、豌豆及麸皮等,同时在马铃薯、莴苣、菠菜以及百合花粉中检测到植酸酶活性.不同种类植物来源的植酸酶.其活性也有差异,其中以谷物活性最高,而燕麦、玉米、高梁等高蛋白饲料作物中的植酸酶活性几乎可以忽略.由于植物来源的植酸酶含量和活性都极低,而其最佳pH为4.0—6.0.最适温度为45—600C,当其处在制粒高温或畜禽胃部的强酸环境时会完全失活。
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96. 8 %. 2. 2. 4 不同 pH 的提取液对酶收率的影响
配制 pH 为 5. 5 、6. 5 和 7. 5 0. 25 molΠL 乙酸 缓冲液 ,用 NaOH 和 HCl 调自来水 pH 至 5. 5 、6. 5 、 7. 5 、8. 5 ,然后分别对发酵物进行提取.
为 4 %和 0. 3 %.
关键词 : 植酸酶 ;黑曲霉 ;筛选 ;产酶条件
中图分类号 :Q936 文献标识码 :A
文章编号 :100727847 (2002) 0420343204
Studies on Screening of Strains Producing Phytase and Conditions of Producing Phytase
从图 2 中可以看出培养基中加水量在 35 % 时 ,测得的酶活最高 ,低于 35 %菌体生长缓慢 ;高 于 35 % 菌体虽生长很好 ,但测得的酶活较低 ,加 水量为 70 %的酶活只是 35 %的酶活 24. 5 % ,原因 可能是加水量低于 35 %时 , 培养基的水活度偏 低 ,菌体延缓期延长 ,生长缓慢 ;加水量过多 ,对数 生长期延长 ,不利于代谢产物积累. 这与其它文献
植酸酶活性单位定义 :在 37 ℃pH 5. 5 的条 件下 ,每分钟从底物释放 1 纳摩尔无机磷所需要
的植酸酶量 ,用 IU 表示.
2 结果和讨论ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. 1 产植酸酶菌株的筛选 由于植酸钙的螯合作用 ,使培养基形成白色
混浊 ,产植酸酶的菌株则会水解植酸钙 ,在菌落的 周围形成透明圈 ,根据透明圈的有无和大小 ,可以 初步判断该菌是否产植酸酶及酶活的高低. 90 余 株菌中筛选出 41 株菌产植酸酶 ,其中真菌 25 株 , 细菌 16 株. 从中选取 20 株透明圈直径与菌落直 径比值较大的菌株进行液体发酵. 测定发酵液酶 活 ,结果表明有 13 株菌酶活超过 10 IUΠml ,其中 , 一株黑曲霉 AN00101 的酶活最高 , 达到 171 IUΠ ml .
固体发酵培养基 :麸皮按试验设计加水灭菌 即是. 1. 1. 2 试剂
植酸钙 、植酸钠购于 Sigma 公司. 颜色Π终点混 合液 : 250 ml 钼 酸 铵 ( 100 gΠL ) + 250 ml 钒 酸 铵 (2. 35 gΠL) + 165 ml 65 %硝酸 + 335 ml 水. 1. 2 方法 1. 2. 1 产植酸酶菌株的初筛
Abstract : Aspergillus niger secreting phytase was separated by screening and rescreening ,and the conditions of pro2 ducing phytase was investigated. The results show : when A . niger is cultivated at 37 ℃for 114 hours in wheat bran
将从土壤分离及本实验室所保藏的共 90 余 株菌点接于筛选培养基上 ,在 30 ℃培养 3 d. 对有 透明圈的进行重复筛选. 1. 2. 2 产植酸酶菌株的复筛
挑取产 透 明 圈 菌 株 接 种 于 液 体 发 酵 培 养 基 中 ,30 ℃摇振培养 4 d 后 ,6 000 rΠmin 离心 20 min , 得粗酶液 ,测酶活. 1. 2. 3 产植酸酶菌株的固体发酵
solid medium added 35 percent running water ,and phytase was extracted by 3 percent chloride calcium solution , the highest enzyme activity was obtained 1. 3 ×104 IU in every gram fermented product . Moreover it is better for produc2 ing phytase to add 4 percent ammonium sulfate and 0. 3 percent magneium sulfate to medium.
第 4 期 程海娜等 :产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究 345
报道的培养基的最佳含水率比较结果偏低 ,主要 是因为没有把麸皮中的含水量计算在内.
图 2 培养基加水量对 AN00101 产植酸酶的影响 Fig. 2 Effect of water added to medium on producing phytase
摘 要 : 通过初筛和复筛 ,得到一株产植酸酶较高的黑曲霉 AN00101 菌株 ,并对该菌种的产酶条件进行了研
究. 结果表明 :配制加水量为 35 %的麸皮固体培养基 ,在 37 ℃培养 114 h ,用 3 % CaCl2 进行提取 ,每 g 固体发酵
物酶活高达 1. 3 ×104 IU. 经 L9 (34 ) 正交实验表明 ,硫酸铵和硫酸镁对产酶有显著的促进作用 ,适宜添加量分别
图 1 黑曲酶 AN00101 在含植酸钙平板上形成透明水 解圈 Fig. 1 The hydrolysis bound result by A. niger AN01001 in plate containing calcium phytase
2. 2 产酶条件的研究 固体发酵与液体发酵相比 ,具有设备较简单 、
Key words : phytase ; Aspergillus niger ;screening ; conditions of producing phytase ( Life Science Research ,2002 ,6 (4) : 343～346)
植酸酶 (phytase ,EC3. 1. 3. 8) 是催化植酸及其 盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称. 植酸酶 添加在饲料中 ,将其中的植酸水解成肌醇和磷酸 , 提高了磷的利用率 ,降低了粪便中磷的排放量 ,减 少了植酸磷对环境的污染. 更为重要的是 ,植酸酶 可使植酸盐蛋白质络合物降解而提高蛋白质的利 用率 ,减少植酸盐对微量元素的螯合 ,提高植物饲
从表 1 中可以看出用乙酸缓冲液提取时 ,当 pH 为 5. 5 、6. 5 时酶活较高 ,在 pH 7. 5 时酶活明显 下降. 自来水进行提取时 ,在 pH 7. 5 时酶活最高 , 用自来水 (其 pH 为 7. 5) 提取的效果比乙酸缓冲 液稍好些 ,这说明在提取时不仅 pH 对酶收率有 影响 ,而且不同提取液所要求的最适 pH 也不同.
3 44 生 命 科 学 研 究 2002 年
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 培养基
筛 选 培 养 基 ( %) : 植 酸 钙 0. 1 , 葡 萄 糖 3 ,
NH4NO3 0. 5 , KCI 0. 05 , MgSO4·7HO2 0. 05 ,MnSO4· 7HO2 0. 003 ,FeSO4·7HO2 0. 003 , 琼脂 1. 8 ,pH 5. 7. 此培养基用于筛选真菌 ,牛肉膏蛋白胨培养基加 0. 1 %的植酸钙用于筛选细菌.
第 6 卷 第 2002 年 12
4期 月
生命科学研究 Life Science Research
Vol. 6
Dec.
No. 4 2002
产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究Ξ
程海娜 ,莫湘涛 ,陈 宇 ,谭海滨 ,周 雄 ,夏立秋
(湖南师范大学 生命科学学院 微生物学系 ,中国湖南 长沙 410081)
成本低 、酶产量高和易于投产等优点 ,所以产酶条 件的研究注重于对固体发酵的研究. 2. 2. 1 培养基最适加水量的确定
培养基中水分含量对菌体的生长及酶的产生 都有很大影响 ,水分含量太少不利于菌的生长 ,太 多不利于代谢产物的积累. 在 250 ml 三角瓶中装 入 10 g 麸皮 ,再加入不同体积的自来水 ,使加水量 占总质量的 30 %～70 % ,每相差 5 %为一个处理 , 在 30 ℃培养 4 d ,测酶活.
表 1 不同 pH的提取液对酶收率的影响 Table 1 Effect of different pH extract solution on producing phytase
料的营养价值[1～4] . 此外 ,植酸酶制剂在食品 、医 药等方面有广泛的应用. 但目前植酸酶制剂价格 昂贵 ,无法推广到饲料工业中 ,本研究的目的是筛 选出植酸酶高产菌株 ,丰富植酸酶基因资源 ,以利 于构建植酸酶基因工程菌 ,为大规模发酵生产廉 价的植酸酶制剂奠定基础[5 ,6] .
Ξ 收稿日期 :2002208223 ;修回日期 :2002211215 基金项目 :国家创新基金项目 (OOC26214300645) 作者简介 :程海娜 (19762) ,女 ,河南邓州人 ,硕士研究生 ,从事植酸酶分子生物学等方面的研究 ;莫湘涛 (19672) ,男 ,湖南湘潭人 ,湖 南师范大学讲师 ,从事微生物分子生物学等方面的研究 ;陈宇 (19722) ,女 ,贵州安顺人 ,湖南师范大学讲师 ,从事微生物分子生物 学等方面的研究 ;夏立秋 (19552) ,男 ,湖南安乡人 ,湖南师范大学教授 ,硕士生导师 ,通讯作者 ,主要从事微生物分子和酶工程研 究.
液体发酵培养基 :60 g 麸皮加入到 935 ml 水 中 ,再加入 5 g NaOH ,在 121 ℃处理 20 min 后 ,用 8 层纱 布 过 滤. 所 得 滤 液 加 入 ( 1 g per 100 ml ) : (NH4 ) 2 SO4 0. 04 、MgSO4·7HO2 0. 02 、casitone 1 、 KH2 PO4 0. 05 、K2 HPO4 0. 04 , 细菌培养基的 pH 为 6. 5 ,真菌培养基的 pH 为 5. 7.