《DNA克隆技术》
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DNA克隆技术
许丽辉
目录
一、概述
（一）基本概念 1 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
2 动物克隆 3 杂交
整理课件
目2 录
克隆羊： 细胞克隆： DNA克隆：
个体水平 细胞水平 分子水平
整理课件
目3 录
Байду номын сангаас
Ａ母绵羊
筛选和鉴定； 表达型载体必须具有指导基因表达的调控元
件。
整理课件
2目7 录
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
基因载体
整理课件
2目8 录
整理课件
2目9 录
整理课件
3目0 录
抗Amp
宿主细菌
整理课件
含Amp培养基
3目1 录
标志补救（ß-半乳糖苷酶法）
Am
lacZ
N2H
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
整理课件
2目5 录
（3）病毒载体 （4）粘性质粒
整理课件
2目6 录
2 载体的条件
有扩增所需的复制起始点，即能自主复制； 有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的
GATCC G
整理课件
1目6 录
3 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
整理课件
1目7 录
4 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
片段
片段
COOH
整理课件
3目2 录
X-gal
Lac Z
蓝色化合物
X-gal
整理课件
3目3 录
（LacZ基因 N端序列）
LacZ基因 C端序列
LacZ酶
插入片段 （LacZ基因失活）
整理课件
3目4 录
H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)
1997年,动物克隆: 克隆羊多莉
2001年，人类基因组计划 整理课件
1目2 录
重组DNA医药产品
整理课件
1目3 录
（三）重组DNA技术技术路线
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
整理课件
整理课件
2目1 录
分 三 目的基因及载体的分离
（一）目的基因的获取
直接从染色体DNA中分离 人工合成 1.60元/碱基 基因文库 反转录PCR mRNA cDNA PCR 直接索取
整理课件
2目2 录
（二） 基因载体
定义 能携带目的基因进入宿主细胞并且在
宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分 子。
1 载体的种类 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
整理课件
2目3 录
（1）质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某
些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
整理课件
2目4 录
（2）噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
目8 录
抑制和调节多 种激素的作用
人体生长激素释放激素(SS)
从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑
9升大肠杆菌 培养液
基因工程
整理课件
目9 录
整理课件
1目0 录
（二）重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工
1目4 录
二、重组DNA技术中常用的工具酶
整理课件
1目5 录
（一）限制性核酸内切酶
1 核酸酶的分类 2 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
整理课件
1目1 录
1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子 1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验
1977年，基因工程产品的出现
Ｂ母绵羊
卵细胞
细胞拆合技术
乳腺细胞
细胞质
细胞核
细胞核移植
融合后的卵细胞
卵裂
早期胚胎
胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩
多莉羊
整理课件
目4 录
4 重组：不同的DNA分子间发生共价
连接形成重组DNA 分子。
质粒DNA
基因片段
重组DNA
整理课件
目5 录
整理课件
目6 录
5 DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA (recombinant DNA) 。
5 共性 （1）只作用于双链DNA （2）活性有赖于Mg2+ （3）碱基识别特异性 （4）切口形式
6 使用原则及注意事项
整理课件
1目8 录
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
整理课件
1目9 录
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
整理课件
2目0 录
（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ （三）T4噬菌体DNA聚合酶 （四）TaqDNA聚合酶 （五）反转录酶 （六）连接酶 （七）末端（脱氧核苷酸）转移酶 （八）碱性磷酸酶
整理课件
目7 录
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
6 基因工程(genetic engineering) —— 实现 基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
整理课件
许丽辉
目录
一、概述
（一）基本概念 1 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
2 动物克隆 3 杂交
整理课件
目2 录
克隆羊： 细胞克隆： DNA克隆：
个体水平 细胞水平 分子水平
整理课件
目3 录
Байду номын сангаас
Ａ母绵羊
筛选和鉴定； 表达型载体必须具有指导基因表达的调控元
件。
整理课件
2目7 录
多克隆位点
polylinker
复制起始点 ori
遗传标记
Amp
基因载体
整理课件
2目8 录
整理课件
2目9 录
整理课件
3目0 录
抗Amp
宿主细菌
整理课件
含Amp培养基
3目1 录
标志补救（ß-半乳糖苷酶法）
Am
lacZ
N2H
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
整理课件
2目5 录
（3）病毒载体 （4）粘性质粒
整理课件
2目6 录
2 载体的条件
有扩增所需的复制起始点，即能自主复制； 有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的
GATCC G
整理课件
1目6 录
3 命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
整理课件
1目7 录
4 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
片段
片段
COOH
整理课件
3目2 录
X-gal
Lac Z
蓝色化合物
X-gal
整理课件
3目3 录
（LacZ基因 N端序列）
LacZ基因 C端序列
LacZ酶
插入片段 （LacZ基因失活）
整理课件
3目4 录
H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)
1997年,动物克隆: 克隆羊多莉
2001年，人类基因组计划 整理课件
1目2 录
重组DNA医药产品
整理课件
1目3 录
（三）重组DNA技术技术路线
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
整理课件
整理课件
2目1 录
分 三 目的基因及载体的分离
（一）目的基因的获取
直接从染色体DNA中分离 人工合成 1.60元/碱基 基因文库 反转录PCR mRNA cDNA PCR 直接索取
整理课件
2目2 录
（二） 基因载体
定义 能携带目的基因进入宿主细胞并且在
宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分 子。
1 载体的种类 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
整理课件
2目3 录
（1）质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某
些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
整理课件
2目4 录
（2）噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
目8 录
抑制和调节多 种激素的作用
人体生长激素释放激素(SS)
从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑
9升大肠杆菌 培养液
基因工程
整理课件
目9 录
整理课件
1目0 录
（二）重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工
1目4 录
二、重组DNA技术中常用的工具酶
整理课件
1目5 录
（一）限制性核酸内切酶
1 核酸酶的分类 2 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
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1目1 录
1972年,P.Berg: 构建第一个DNA重组分子 1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验
1977年，基因工程产品的出现
Ｂ母绵羊
卵细胞
细胞拆合技术
乳腺细胞
细胞质
细胞核
细胞核移植
融合后的卵细胞
卵裂
早期胚胎
胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩
多莉羊
整理课件
目4 录
4 重组：不同的DNA分子间发生共价
连接形成重组DNA 分子。
质粒DNA
基因片段
重组DNA
整理课件
目5 录
整理课件
目6 录
5 DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而 通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA (recombinant DNA) 。
5 共性 （1）只作用于双链DNA （2）活性有赖于Mg2+ （3）碱基识别特异性 （4）切口形式
6 使用原则及注意事项
整理课件
1目8 录
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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1目9 录
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
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2目0 录
（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ （三）T4噬菌体DNA聚合酶 （四）TaqDNA聚合酶 （五）反转录酶 （六）连接酶 （七）末端（脱氧核苷酸）转移酶 （八）碱性磷酸酶
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目7 录
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
6 基因工程(genetic engineering) —— 实现 基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
整理课件