临床一步法修复关节软骨缺损

临床一步法修复关节软骨缺损关节软骨缺乏血管、淋巴管及神经支配，且软骨细胞有丝分裂能力差，不能进行有效的自我修复[1]，因此，如何治疗关节软骨缺损面临巨大的挑战[2]。

目前临床上治疗关节软骨缺损的主要方法是自体软骨细胞移植（ACI），然而ACI存在无法避免的缺陷，即：需二次手术、软骨细胞缺乏及软骨形成受限、造成非负重关节面软骨缺损、不适用于骨性关节炎（OA）及类风湿性关节炎（RA）患者[3-6]。

随着组织工程学及再生医学的发展，研究者发现间充质干细胞因其具有自我更新、多向分化潜能及抑制免疫应答等功能，可替代软骨细胞修复关节软骨缺损[7]。

目前用于修复软骨缺损的间充质干细胞主要来自骨髓，需体外分离、鉴定及传代培养纯化后才能用于临床，体外培养时间长，花费大，且长时间体外培养可能导致细胞污染[8-11]。

因此越来越多的学者尝试利用全骨髓液或骨髓有核细胞（BNCs）修复关节软骨缺损。

利用全骨髓液或骨髓有核细胞（BNCs）修复关节软骨缺损，即所谓的一步法修复关节软骨缺损，可充分利用骨髓液含有的一切有利因素，如细胞间的相互作用、生长因子的诱导作用；可避免细胞因体外分离、鉴定及培养所带来的花费及风险，且不像两步法体外扩增培养需要优质生产规范（GMP）设备[2, 6, 12]。

目前临床上可利用一步法治疗软骨损伤、骨软骨损伤及骨性关节炎患者。

骨性关节炎2006年，Centeno[13]等在发表的个案报告中详细描述了利用一步法治疗重度髋关节骨性关节炎患者。

术前患者的Harris髋关节功能评分总分为50.8分，MRI 检测示髋关节间隙明显变窄、骨赘增生及软骨下骨囊泡形成。

在间隔4周的时间里，采用注射法两次向患者的髋关节注射透明质酸（HA）支架复合自体骨髓有核细胞（BNCs）。

术后4周，MRI检测示关节间隙清晰可辨，软骨下骨囊泡消失；术后12周，采用改良视觉模拟评分法（V AS）及功能评价指标进行评估，发现该患者的步行距离、坐姿耐受时间、站立耐受时间及日常娱乐活动较术前有了明显的改善。

软骨损伤Slynarski[14]等联合应用骨膜覆盖、新鲜骨髓液注射的方法治关节软骨损伤患者。

14例关节软骨损伤患者，平均年龄37岁，最大软骨缺损面积超过4cm2。

术后6个月，所有患者疼痛症状明显改善，83.44%患者恢复日常活动；术后12个月，85.7%患者的国际膝关节委员会评分表评分（KIDC评分）及改良的辛辛那提评分明显增高，KIDC评分平均为86.57，改良的辛辛那提评分从术前的3.3提高到8.4；MRI检查发现软骨表面连续，无继发的软骨下骨改变，类似正常软骨组织。

2010年，Pascarella[15]等报道了采用改良的基质诱导自体软骨细胞（AMIC）技术，即软骨下骨转孔+纤维蛋白胶支架复合自体骨髓液，治疗股骨髁及髌骨软骨损伤患者。

19例股骨髁或髌骨软骨损伤患者，平均年龄26岁，男性12例，女性7例，平均随访时间为24个月，术前及术后采用KIDC评分、改良的Lysholm 膝关节评分、改良的Ikeuchi评分及MRI检查进行评估。

术后24个月，IKDC 评分平均值由术前的30（24-40）提高到83（74-94），改良的Lysholm膝关节评分平均值由术前的54（38-83）提高到98（96-100），改良的Ikeuchi评分显示78%患者达到优良，MRI检查发现53%的患者软骨缺损面积及软骨下骨水肿明显减少，纤维蛋白胶和正常关节软骨结合紧密。

改良的AMIC技术将软骨下骨转孔和自体骨髓液一直结合，能最大限度的聚集间充质干细胞（MSCs）修复关节软骨缺损。

Gigante[16]等联合应用微骨折术、Ⅰ型胶原支架复合自体骨髓有核细胞移植，治疗有临床症状的膝关节股骨髁关节软骨缺损患者。

5例股骨髁关节软骨损伤患者，男性3例，女性2例，平均年龄43.4岁，平均软骨缺损面积3.7±0.9cm2。

术后12个月，关节镜检查发现移植物修复满意，类似正常关节软骨；移植物组织切片的组织学评分（ICRSⅡ）平均为59.8±14.5，番红O染色显示3例为纤维软骨组织修复，1例为类透明软骨组织修复，1例修复介于两者之间。

骨软骨损伤2009年，Giannini[6]等报道了应用移植支架复合骨髓有核细胞的方法修复踝关节距骨面骨软骨缺损。

48例踝关节距骨面骨软骨缺损患者，男性27例，女性21例，平均年龄28.5±9.5岁，平均骨软骨缺损面积2.07±0.48cm2，平均骨软骨缺损深度4.0±0.9mm。

48例患者因所用支架不同分成2组：胶原蛋白组23例，透明质酸组25例。

平均随访29个月（24-35月），采用美国足踝外科协会（AOFAS）评分表、MRI及组织学检查评估临床疗效。

术后随访6、12、18、24个月，发现胶原蛋白组及透明质酸组的AOFAS评分较术前有明显增高，但两组间无统计学差异，术前所有患者的平均AOFAS评分为64.4±14.5，术后6个月83.3±8.7，术后12个月88.9±8.2，术后24个月91.4±7.7，且发现软骨缺损面积大小与术后AOFAS评分密切相关，当软骨缺损面积≥3cm2时，AOFAS评分增高率最小。

平均随访4.4个月，94%的患者可参加低强度的体育活动；平均随访11.3个月，77%的患者可参加高强度的体育活动。

术后12个月，MRI检查发现2例患者新生软骨组织肥大；术后24个月，所有患者新生软骨组织类似周围正常软骨。

术后12个月，取5例（无症状者3例、新生软骨组织肥大者2例）患者修复组织行组织切片及染色，番红O染色显示蛋白聚糖高表达，免疫组化染色显示Ⅱ型胶原表达，且新生软骨组织与周围正常软骨组织紧密结合。

2010年，Giannini[17]等在发表的另一报道中比较了应用不同方法修复踝关节距骨面骨软骨缺损。

81例患者，男性47例，女性34例，平均年龄30±8岁，平均骨软骨缺损深度4.0±0.9mm。

84例患者根据不同修复方法分成3组：A组开放式ACI修复组（10例）；B组关节镜下ACI修复组（46例）；C组关节镜下HA支架复合自体骨髓有核细胞修复组（25例），术后采用AOFAS评分、X线检查、MRI检查及组织学切片评估临床疗效。

术后12个月及36个月，所以患者的临床症状较术前有明显改善。

术后AOFAS评分，A组：术前平均38±18，术后12个月平均89±14，术后36个月94±8；B组：术前平均57±14，术后12个月平均87±13，术后36个月89±13；C组：术前平均65±16，术后12个月平均89±9，术后36个月93±8，各组术后评分较术前有明显统计学意义，各组之间去统计学差异。

术后踝关节X线检查发现各组患者病例无骨性关节炎发生，MRI检查发现76%病例新生软骨组织与周围正常软骨组织紧密结合；术后关节镜检查所有患者新生软骨组织完整，类似正常软骨组织；新生软骨组织免疫组化染色显示Ⅱ型胶原及蛋白聚糖高表达。

Buda[18]等报道了应用HA支架复合骨髓有核细胞修复膝关节骨软骨缺损。

20例膝关节骨软骨损伤患者，男性12例，女性8例。

术后随访术后随访6、12、18、24个月，采用IKDC评分、膝关节损伤和骨关节炎（KOOS）评分、MRI 及组织学检查评价临床疗效。

术前平均IKDC评分为32.9±14.2，平均随访29.0±4.1个月，平均IKDC评分为90.4±9.2（P<0.005）；术前平均KOOS评分为47.1±14.9，平均随访29.0±4.1个月，平均IKDC评分为93.3±6.8（P<0.005），且发现评分结果不受患者年龄、性别及骨软骨缺损面积大小的影响。

术后MAI检查发现70%患者新生骨软骨组织连续平滑，与周围正常软骨组织紧密结合，软骨下骨完整。

术后新生软骨组织番红O染色显示细胞外基质富含蛋白聚糖，软骨下骨及潮线清晰可见；HE染色显示软骨细胞分布均一；免疫组化染色显示Ⅱ型胶原高表达。

综上所述，应用一步法即全骨髓液或骨髓有核细胞（BNCs）修复关节软骨缺损，临床疗效肯定，与应用ACI修复骨软骨缺损疗效相当[6, 13-18]，且避免了细胞体外分离、鉴定及培养所带来的费用及风险，更符合患者利益。

然而，临床应用间充质干细胞（hMSCs）修复关节软骨缺损，更应充分考虑其安全性。

目前对应用hMSCs安全性能的评价主要是体外实验。

一些研究发现，体外培养hMSCs 不会导致自发性的染色体畸变[19, 20]，然而另一些研究却发现体外长时间培养hMSCs可导致自发性畸变[21-23]。

同样的，在免疫缺陷的动物体内培养hMSCs也得到了同样矛盾的结论[24-28]。

但是，在Wakitani等的一项研究中发现，应用hMSCs 修复41例关节软骨损伤患者，随访11年零5个月，未发现局部感染及肿瘤形成[29]。

因此，临床应用全骨髓液或骨髓有核细胞（BNCs）修复关节软骨缺损仍面临巨大的挑战。

1. Brittberg, M., et al., Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologouschondrocyte transplantation. N Engl J Med, 1994. 331(14): p. 889-95.2. Veronesi, F., et al., Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expandedbone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease.Stem Cells Dev, 2013. 22(2): p.181-92.3. Wakitani, S., et al., Mesenchymal cell-based repair of large, full-thickness defects of articularcartilage. J Bone Joint Surg Am, 1994. 76(4): p. 579-92.4. Wakitani, S., et al., Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal celltransplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. Osteoarthritis Cartilage, 2002. 10(3): p. 199-206.5. Vasara, A.I., et al., Indentation stiffness of repair tissue after autologous chondrocytetransplantation. Clin Orthop Relat Res, 2005(433): p. 233-42.6. Giannini, S., et al., One-step bone marrow-derived cell transplantation in talar osteochondrallesions. Clin Orthop Relat Res, 2009. 467(12): p. 3307-20.7. Ochi, M., et al., Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in thetreatment of cartilage defects of the knee. J Bone Joint Surg Br, 2002. 84(4): p. 571-8.8. Kuroda, R., et al., Treatment of a full-thickness articular cartilage defect in the femoralcondyle of an athlete with autologous bone-marrow stromal cells.Osteoarthritis Cartilage, 2007. 15(2): p. 226-31.9. Wakitani, S., et al., Autologous bone marrow stromal cell transplantation for repair offull-thickness articular cartilage defects in human patellae: two case reports. Cell Transplant, 2004. 13(5): p. 595-600.10. Wakitani, S., et al., Repair of articular cartilage defects in the patello-femoral joint withautologous bone marrow mesenchymal cell transplantation: three case reports involving nine defects in five knees. J Tissue Eng Regen Med, 2007. 1(1): p. 74-9.11. Kasemkijwattana, C., et al., Autologous bone marrow mesenchymal stem cells implantationfor cartilage defects: two cases report. J Med Assoc Thai, 2011. 94(3): p. 395-400.12. Kacena, M.A., C.M. Gundberg, and M.C. Horowitz, A reciprocal regulatory interactionbetween megakaryocytes, bone cells, and hematopoietic stem cells.Bone, 2006. 39(5): p.978-84.13. Centeno, C.J., et al., Partial regeneration of the human hip via autologous bone marrownucleated cell transfer: A case study. Pain Physician, 2006. 9(3): p. 253-6.14. Slynarski, K., J. Deszczynski, and J. Karpinski, Fresh bone marrow and periosteumtransplantation for cartilage defects of the knee. Transplant Proc, 2006. 38(1): p. 318-9.15. Pascarella, A., et al., Treatment of articular cartilage lesions of the knee joint using a modifiedAMIC technique. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2010. 18(4): p. 509-13.16. Gigante, A., et al., Use of collagen scaffold and autologous bone marrow concentrate as aone-step cartilage repair in the knee: histological results of second-look biopsies at 1 year follow-up. Int J Immunopathol Pharmacol, 2011. 24(1 Suppl 2): p. 69-72.17. Giannini, S., et al., Cartilage repair evolution in post-traumatic osteochondral lesions of thetalus: from open field autologous chondrocyte to bone-marrow-derived cells transplantation.Injury, 2010. 41(11): p. 1196-203.18. Buda, R., et al., Osteochondral lesions of the knee: a new one-step repair technique withbone-marrow-derived cells. J Bone Joint Surg Am, 2010. 92 Suppl 2: p. 2-11.19. Bernardo, M.E., et al., Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergotransformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms. Cancer Res, 2007. 67(19): p. 9142-9.20. Tarte, K., et al., Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrenceof aneuploidy without transformation. Blood, 2010. 115(8): p. 1549-53.21. Rubio, D., et al., Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res, 2005. 65(8):p. 3035-9.22. Wang, Y., et al., Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BMmesenchymal stem cell culture. Cytotherapy, 2005. 7(6): p. 509-19.23. Rosland, G.V., et al., Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stemcells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer Res, 2009. 69(13): p.5331-9.24. Tolar, J., et al., Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells.Stem Cells, 2007.25(2): p. 371-9.25. Zhou, Y.F., et al., Spontaneous transformation of cultured mouse bone marrow-derivedstromal cells. Cancer Res, 2006. 66(22): p. 10849-54.26. Parekkadan, B., et al., Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepaticfailure. PLoS One, 2007. 2(9): p. e941.27. Yabana, T., et al., Enhancing epithelial engraftment of rat mesenchymal stem cells restoresepithelial barrier integrity. J Pathol, 2009. 218(3): p. 350-9.28. Bernardo, M.E. and W.E. Fibbe, Safety and efficacy of mesenchymal stromal cell therapy inautoimmune disorders. Ann N Y Acad Sci, 2012. 1266: p. 107-17.29. Wakitani, S., et al., Safety of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem celltransplantation for cartilage repair in 41 patients with 45 joints followed for up to 11 years and 5 months. J Tissue Eng Regen Med, 2011. 5(2): p. 146-50.。