生物样品前处理、制备、分离
干湿结合生物学研究方法
干湿结合生物学研究方法在生物学研究领域,干湿结合的方法已经成为一种高效、全面的研究策略,涵盖了从生物样品的前处理到测序与表达分析等多个步骤。
干湿结合生物学研究方法结合了湿法和干法两种技术,下面将详细介绍这些内容。
1、湿法生物样品前处理湿法生物样品前处理是一种常用的样品处理方法,主要利用液体介质进行样品破碎、细胞裂解和蛋白质、核酸等生物分子的提取。
湿法处理具有高效、温和的优点,适用于大部分生物样品的处理。
湿法生物样品前处理的主要步骤包括:样品收集、细胞破碎、细胞裂解、蛋白质变性、核酸提取等。
在操作过程中,需要注意保持无菌条件,避免样品污染,同时要尽量减少对生物分子的破坏,保持其天然活性。
2、干法生物样品前处理干法生物样品前处理主要利用干粉试剂或干式生化试剂进行样品破碎、细胞裂解和生物分子的提取。
干法处理具有简便、快速、无需特殊设备的优点,适用于一些不易获得的生物样品或需要快速处理的紧急样品。
干法生物样品前处理的主要步骤包括:样品收集、细胞破碎、细胞裂解、干燥、试剂添加等。
在操作过程中,需要注意避免样品污染,保证细胞的充分破碎和裂解,同时要保证生物分子的完整性。
3、蛋白质生物样品分离与纯化蛋白质生物样品分离与纯化是生物学研究中的重要步骤,其主要目的是将目标蛋白质与其他生物分子(如核酸、脂质等)进行有效分离,从而对其进行深入研究和应用。
蛋白质生物样品分离与纯化的主要方法包括:离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳等。
这些方法各有特点,适用范围也不同,需要根据具体研究需求进行选择。
在操作过程中,需要注意保证样品的均一性和回收率,同时要尽量避免非特异性吸附和样品损失。
4、DNA生物样品提取与纯化DNA生物样品提取与纯化的目的是从生物样品中提取出高质量的DNA,去除其中的杂质和干扰物质,以便进行后续的基因组学研究。
DNA生物样品提取与纯化的主要方法包括:酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法、磁珠法等。
这些方法都能够高效地提取和纯化DNA,但操作过程和适用范围略有不同。
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分,再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱,从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理(如血浆、尿等)。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化:根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术(SPE)是从上世纪八十年代中期发展起
来的,广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法(SPE)就是用固体物质作为萃取剂,采用 高效、高选择性的固定相,进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相,当液体样品通过固定相时,保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质,内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释,不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的,在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度,而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品前处理
[5]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学.2006,(34)7: 1035-1041
[6]张丽华,肖国平,宋游.微波技术在生物样品预处理中的应用[J].基础和应用基础研究与放射化学与核化学:133
2.对于在常温下需要长时间反应的样品,可将准备好的样品放置过夜,第2天再放进消解炉消解。
3.对于预处理时间长的难处理样品,也可采用放过夜的方法,第2天再进行消解处理。样品经过处理后,若溶液体积小于5ml时,则必须补加水或酸,使其体积不小于5ml,然后再进行微波消解。
总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。
[1]周婷婷,范国荣,吴玉田.超临界流体萃取法在生物样品前处理中的应用[J].药学学报.2004 ,39(4) :317 – 320
[2]张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006, 18(1):56-58
[3]李向阳,杨梅,彭宝珠.固相微萃取在生物药物分析中的应用[J].2002,23(4):69-71
目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛[5]。
分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。
生物样品前处理、制备、分离
生物样品前处理、制备、分离及保存器材
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中国刑警学院法医系
1. 概 述 1.1 生物样品处理制备的主要特点: ⑴生物材料的组成极其复杂,常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物样品在生物材料中的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长。 ⑶许多生物样品一旦离开了生物体内的环境时就极易失活,因此分离过程中如何防止其失活,就是生物样品提取制备最困难之处。 ⑷生物样品的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断。
样品置耐压的圆底烧瓶中,将瓶浸入干冰-乙醇混合物内,使瓶内物迅速冻结成硬块,然后连接高真空度的真空泵。
*
增加过滤推动力。常压、加压、减压。
加助滤剂。如硅藻土、活性炭、细砂等。
提高过滤时的温度。以减少溶液粘度,增大溶质的溶解度,但不适于热敏物质。 离心过滤法,利用离心力促使滤液通过过滤介质,适于分离小量组织样品。
加压和减压过滤在过滤介质的下面都必须有支持滤板,如强度较大的烧瓷滤板等。
3.2 超滤 超过滤即超滤,自20年代问世后,直至60年代以来发展迅速,很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术,广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子(如蛋白质、酶、核酸等)的浓缩、分离和纯化。
滤渣:滤渣越厚,过滤速度越慢。
过滤液性状:过滤液中有沉淀、胶状物或其它可压缩的物质,均能造成滤膜孔堵塞,减慢过滤速度。
*
3.1.3 提高过滤速度的常用方法
选择适当的过滤介质 应考虑:①孔径大小应适于截流被分离的固体颗粒,孔径过大,则滤液不清,过小则滤速慢。②孔的数目多,孔道短且直,则滤速快,否则滤速慢。③耐酸碱,化学稳定性好。④有一定机械强度,易于回收。⑤使用寿命长,成本低。 过滤介质的材质: ①棉、麻、丝织品; 玻璃纤维、垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板、涤纶等; 滤纸(工业用和分析用,慢速、中速、快速),实验室里最常用。
化学分析方法的生物样品前处理技术
化学分析方法的生物样品前处理技术化学分析是现代科学研究和工业生产中不可或缺的一环。
为了获得准确和可靠的化学分析结果,对于生物样品的前处理技术至关重要。
本文将介绍几种常用的生物样品前处理技术,包括固相萃取、液液萃取、溶剂萃取和分离提纯技术。
一、固相萃取技术固相萃取(Solid-phase Extraction,简称SPE)是一种用于生物样品前处理的重要技术。
其原理是将待检样品与吸附剂接触或通过吸附剂时,目标分析物被吸附到吸附剂上,达到样品的富集和净化。
固相萃取技术具有以下优点:操作简单、灵敏度高、富集效果好、耗时短等。
在化学分析领域中被广泛应用。
二、液液萃取技术液液萃取(Liquid-Liquid Extraction,简称LLE)是一种通过溶剂与待检样品中目标分析物的选择性溶解度差异而发生分离的技术。
其原理是将待检样品与萃取溶剂进行充分混合搅拌后,静置,根据目标分析物在两种溶剂中的分配系数,使其转移到相应的溶剂层中。
液液萃取技术适用范围广泛,操作简单。
但其溶剂消耗大,使用过程中易产生有机溶剂挥发、环境危害等问题,因此在实际应用中需要加以控制和优化。
三、溶剂萃取技术溶剂萃取技术(Solvent Extraction)是指通过非挥发性溶剂将目标分析物从待测样品中提取出来。
它是一种在液液界面上基于物质间相互作用力原理进行的分离技术。
该技术广泛应用于生物样品的前处理中。
溶剂萃取技术不仅可以提取有机物,还能用于提取无机物,同时能实现溶液的浓缩和纯化。
在生物样品前处理中,该技术常与其他技术,如SPE技术结合使用,以实现样品更好的富集和净化效果。
四、分离提纯技术分离提纯技术在生物样品前处理过程中起到了至关重要的作用。
常见的分离提纯技术包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等。
薄层色谱技术(Thin Layer Chromatography,简称TLC)是一种常用的分离化合物的方法。
它通过将待测样品在薄层色谱板上作用,根据各种成分的溶解度差异和物理化学性质等特点进行分离。
生物样品的预处理
蛋白酶抑制剂的添加
保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等)
提取物缓冲液的选择(中性)
提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等)
匀浆化前的预处理(冷冻)
1.2 动物组织预处理注意事项
各种发酵产品,由于菌种不同和发酵液特性不同,其预处理方法的选择也有所不同。
01
大多数发酵产物存在于发酵液中,也有少数产物存在于菌体中,或发酵液和菌体中都含有。
螯合剂法
叁
贰
壹
酚类化合物的干扰及对策
牛血清白蛋白(BSA)法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原-抗体间的相互作用,形成可溶性的或不溶性的复合物,减小了原花色素类物质与RNA结合的机会
丙酮法 用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可有效从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA
高速匀浆机
高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法,设备由高压泵和匀浆阀组成。
研磨法与珠磨法 研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成,加入少量研磨剂(如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土) 珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英沙、氧化铝等研磨剂(直径<1 mm)一起快速搅拌或研磨,研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞,使细胞破碎,释放出内含物。在珠液分离器的协助下,珠子被滞留在破碎室内,浆液流出从而实现连续操作。 适用:微生物(细菌)与植物细胞
通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。
01
03
02
植物组织往往富含多糖,而多糖的许多理化性质与RNA很相似,较难将它们分开。含多糖的RNA沉淀难溶于水,或溶解后产生粘稠状的溶液,对RNA提取造成较大的干扰。
生物分离工程
生物分离工程生物分离工程是指采用物理、化学和生物学方法将生物体或其组成部分从混合物中分离出来,并纯化得到目标物质的一种工程领域。
该领域涉及到许多专业知识,包括生物学、生化学、物理化学等多个学科的理论和技术,应用广泛。
生物分离工程的目的是将生物体中的目标物分离出来,以便进行药物发现、分析化学以及生命科学研究等方面的应用。
生物分离工程包括生物分离过程、分离器设备及工艺控制等多个方面。
生物分离过程是将混合物中的目标物通过特定的工艺流程进行分离,得到纯化的目标物质。
一般包括以下几个步骤:(1)前处理:对样品进行初步处理,如细胞破碎、离心、过滤等。
(2)初步分离:将混合溶液通过某些技术方法进行初步分离,如各种色谱技术、电泳分离、凝胶柱分离等。
(3)中间分离:在初步分离的基础上,对样品进一步处理,如双向电泳、反渗透膜分离、超重力分离等。
(4)终极分离:最后通过某些技术,将目标物质从混合物中完全分离出来,如聚集素层析、反转移层析、凝胶电泳等。
分离器设备是指在生物分离过程中使用的各种设备,根据不同的分离过程,分离器设备也有所不同。
例如,在分离蛋白质时,最常用的分离器设备是各种色谱技术和电泳分离设备,而在分离细胞时,采用的设备则主要是离心机、过滤器等。
工艺控制是指对生物分离工程中各个步骤进行控制和调节,以确保分离工艺的有效性和纯化度的提高。
常用的工艺控制手段包括调节温度、压力、流量等系列参数的控制,并且可以采用自动化操作,进一步提高生物分离工程的自动化程度。
生物分离工程的应用非常广泛,包括生命科学研究、药物研发、食品工业以及纯化工程、环境保护等方面。
例如,在药物研发中,生物分离工程用于分离制备药物,提高药物纯度和效果;在食品工业中,生物分离工程用于提高食品的品质和安全性;在环境保护中,生物分离工程可用于处理污水和有害气体等。
总之,生物分离工程是一项复杂、细致的研究领域,在各个行业都有广泛的应用。
随着科技的发展和人们对生命科学研究的不断深入,生物分离工程将会越来越得到关注和重视,为人们的生活和健康做出更大的贡献。
生物样本样品前处理
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常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷
乙醚 戊烷 环己烷 正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
分子量 84.9 88.1 92.6 74.1 72.2 84.2 86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
注:“*”表示与水互溶
沸点(℃) 40
5、固相萃取法:可实现自动化,基质效应降低,同时完成样品的富
集与净化;但成本较高
3
液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同,使化合物从生物基质中转移至有机相中。
➢两相的分离需借助两相的密度差来实现
➢原理:相似相溶
➢分配系数:kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率
常见表面活性剂:Triton-X-100,吐温等
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集,考虑将待测物从容器中解离出来。
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讨论和问题
Thank you!
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0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
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固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
6
固相提取法
7
固相提取法
8
固相提取法
改变化合物PH,酸性 保留,碱性洗脱
77.1 77
34.5 36.1 80.7
69 110.6 82.4
66 81.6 117 100
密度(g/mL) 1.33 0.90 0.89 0.71 0.63 0.78 0.66 0.87 0.79 0.89 0.78 1.00 1.00
样本前处理需要怎么做?
样本前处理需要怎么做?在科学研究中,对于样本的前处理工作非常重要。
样本前处理是指分离出需要研究的物质,并且消除任何可能干扰研究的有机、无机物或其他杂质。
这些处理措施可以使研究结果更加准确和可靠。
下面我们将介绍几种常见的样本前处理方法。
1. 样品的收集和保存样品的收集和保存是样品前处理的第一步。
在收集样品时,应选择具有代表性的样品,以确保结果的准确性。
样品的保存方法与其类型有关。
比如,对于生物样品,应保持其完整性和准确性,避免长时间储存和重复冻融。
对于固体和液体样品,可以通过添加干燥剂,冷冻或低温储存来保持其长期稳定性。
2. 分离和提取样品的分离和提取是样品前处理的重要步骤。
对于复杂样品,需要选择合适的方法进行分离和提取。
可以使用化学、光学、机械或电化学方法来实现分离和提取。
常用的方法包括过滤、萃取、离心、蒸馏和固相萃取等。
3. 样品准备样品准备是样品前处理的重要步骤之一。
它是指对样品进行处理、制备使其符合分析要求的过程。
样品的准备取决于分析技术的种类和目的。
例如,对于纯化的DNA/RNA分析,需要进行脱盐和浓缩,而对于元素分析,需要进行酸化处理,以保证分析的准确和可靠。
4. 标准曲线的制备标准曲线是样品前处理过程中重要的一步。
该曲线用于确定样品中各成分的含量,以及分析结果的准确性和可靠性。
在样品前处理中,需要制定一个合适的标准曲线,以保证样品和标准的检测信号之间具有良好的线性关系。
标准曲线的制备方法包括内标法、外标法和加标法等。
5. 检查和验证样本前处理的最后一步是检查和验证。
在检查和验证的过程中,需要确定样品是否符合分析要求并且没有任何干扰物。
这包括使用正控制物质和空白样本来检测仪器偏移和噪音级别等。
在确认样品前处理的质量后,可以开始进行实验分析。
总之,样品前处理是样品分析的关键步骤。
通过适当的方法进行样品前处理,可以保证研究结果的准确性和平均性。
生物制药技术中的生物样品处理与分析方法
生物制药技术中的生物样品处理与分析方法生物制药技术在医药领域的应用日益广泛,其关键环节之一是生物样品的处理与分析。
生物样品处理与分析方法的选择和优化对于保证生物制药产品的质量和效力至关重要。
本文将介绍生物制药技术中常用的生物样品处理与分析方法,包括样品采集、样品前处理、样品分析等,以及其所涉及的原理和应用。
一、样品采集在生物制药技术中,样品采集是第一步,直接影响后续的样品处理与分析结果。
常见的生物样品包括血液、尿液、组织等。
对于血液样品,最常用的采集方法是采用针头抽血,然后将血液转移到适当的采样管中。
对于尿液样品,通常采用尿杯收集新鲜尿液,然后进行必要的保存和处理。
对于组织样品,常用的方法是通过手术或穿刺获取组织样本,并将其保存在适当的容器中。
二、样品前处理生物样品经过采集后,需要进行前处理来去除干扰物和提取目标分析物。
常见的前处理方法包括离心、过滤、沉淀等。
离心是通过旋转离心机使样品分离成上清液和沉淀物,用于去除离心后产生的沉淀物。
过滤是通过使用合适孔径的过滤器去除样品中的固体颗粒和杂质,例如细胞碎块和蛋白质等。
沉淀是通过加入特定试剂使样品中的目标分析物凝聚成沉淀物,然后通过离心或过滤的方式将其分离出来。
这些前处理方法能够有效地去除样品中的干扰物,提高后续分析的准确性和灵敏度。
三、样品分析生物制药技术中的样品分析是通过对样品中的目标分析物进行定量或定性分析,来评估生物制药产品的质量和效力。
常见的样品分析方法包括免疫学分析、核酸分析、代谢物分析等。
1. 免疫学分析免疫学分析是通过检测样品中的特定抗原或抗体来定量或定性样品中的分析物。
免疫学分析常见的方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光分析、免疫电泳等。
通过这些方法,可以检测生物制药产品中的特定蛋白质、抗体等成分,评估产品的纯度和含量。
2. 核酸分析核酸分析是通过检测样品中的DNA或RNA来定量或定性样品中的分析物。
常见的核酸分析方法包括聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交、基因测序等。
样品前处理名词解释
样品前处理名词解释
样品前处理是指在样品制备之前进行的一系列操作,用于降低样品制备过程中产生的误差和污染,提高样品分析的准确性和可靠性。
以下是样品前处理的一些常见名词解释:
1. 样品制备:将原材料或制备物转化为可分析样品的过程,通常包括提取、粉碎、结晶、干燥等步骤。
2. 去离子水:一种通过去除水中的阴离子和阳离子而制备的纯净水。
3. 样品处理剂:一种用于样品处理的物质,通常具有去除样品中杂质、溶解样品、调节pH值等功能。
4. 电子去离子器(EDS):一种用于去除金属离子的仪器,可以通过向样品中添加特定的试剂来去除其中的金属离子。
5. 凝胶电泳:一种用于分离蛋白质、核酸等分子的技术,通过将样品注射到凝胶中,利用特定的离子和电场作用来分离不同的分子。
6. 表面活性剂:一类具有表面活性作用的物质,可以调节样品表面的状态,改善样品的吸附、扩散等性能。
7. 生物分离技术:用于从样品中提取不同种类的分子或化合物的技术,包括离心分离、溶液萃取、膜分离等。
8. 表征:用于对样品进行各种物理、化学、生物等分析技术的评估和测试,以确定样品的组成和性质。
生物样本样品前处理
包括抗凝、分离血清或血浆等步骤,为血液学实验提 供合格的样本。
THANKS
感谢观看
对于光敏感的样品,在处理和 保存过程中应避免直接光照, 采用避光容器或包装材料。
添加稳定剂
根据样品的性质,可以添加适量 的稳定剂,如抗氧化剂、防腐剂 等,以保持样品的稳定性。
减少处理时间
尽量缩短样品前处理的时间,减 少样品暴露在不利环境中的机会
,从而降低样品变质的风险。
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样品前处理中的质量控制
质量控制标准制定
稳定性和可重复性。
前处理流程简介
样本收集与保存
根据研究目的和实验设计,选择合适的生物样本(如血液、尿液、组织等),并进行适当的保存和处理,以避免样本 变质或目标分析物的损失。
样本预处理
对收集到的生物样本进行初步处理,如离心、过滤、稀释等,以去除杂质和干扰因素,为后续的分析步骤提供纯净的 样本。
目标分析物的提取与富集
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代谢物衍生化
利用色谱、质谱等技术对代谢物 进行分离和纯化,去除干扰物质。
对于某些难以检测或不稳定的代 谢物,可以通过衍生化反应提高 其检测灵敏度和稳定性。
其他生物样本前处理技术
组织样本前处理
包括组织固定、脱水、包埋、切片等步骤,为后续组 织学观察和实验提供基础。
细胞样本前处理
包括细胞培养、传代、冻存等步骤,为细胞实验提供 充足的细胞来源。
03
样品分离与纯化
分离技术介绍
01
02
03Leabharlann 色谱分离技术利用不同物质在固定相和 流动相之间的分配系数差 异,实现样品的分离,如 液相色谱、气相色谱等。
电泳分离技术
利用物质在电场作用下的 迁移速度差异,实现样品 的分离,如凝胶电泳、毛 细管电泳等。
生物样品分析前处理技术
生物样品分析前处理技术生物样品的前处理涉及很多方面,但主要应考虑生物样品的种类,被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题;1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型;例如,血浆或血清需除蛋白,使药物从蛋白结合物中释出;唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白;尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出,当原型药物排泄在尿中时,可简单地用水稀释一定倍数后进行测定;2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等,采取相应的前处理方法;例如,药物的酸碱性pka、溶解性质涉及到药物的提取手段;是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定;药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性;药物在样品中的浓度相差很大,浓度大的样品,对前处理要求可稍低;浓度越低则样品前处理要求越高;此外,药物在体内常产生许多代谢产物,其中一些代谢物仍具有药理活性,需要与原型药分别测定,因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性;3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同;即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关;一般说来,放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性,因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品;而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法,分离要求就要相应高一些;至于常用的高效液相色谱法,为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上,上柱前需对生物样品进行去蛋白,有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理;样品处理步骤与分析方法的选择一去除蛋白质在测定血样时,首先应去除蛋白质;去除蛋白质可使结合型的药物均出来,以便测定药物的总浓度;去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡,减少乳化的形成,以及可以保护仪器性能如保护HPLC柱不被沾污,延长使用期限;去除蛋白法有以下几种;1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂;可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚,使与蛋白质结合的药物释放出来;常用的水溶性有机溶剂有:乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等;含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:1~3时,就可以将90%以上的蛋白质除去;水溶性有机溶剂的种类不同时,析出的蛋白质形状亦不同;并且所得上清液的pH值也稍有差别,如用乙腈或甲醇时,上清液pH为~,用乙醇或丙酮时,上清液pH为9~10;操作时,将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离,取上清液作为样品;通常分离血浆或血清用的离心机3000r/min不能将蛋白质沉淀完全,而采用超速离心机10000r/min离心1~2min便可将析出的蛋白质完全沉淀;离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管,可使析出的蛋白质牢固地粘在管底,便于上清液的吸取;2.加入中性盐加入中性盐,使溶液的离子强度发生变化;中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来,从而使蛋白质脱水而沉淀;常用的中性盐有:饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等;操作时,如按血清与饱和硫酸铵的比例为1:2,混合,离心10000r/min1~2min,即可除去90%以上的蛋白质;所得上清液的pH为~这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时,药物的回收率高,因而常常被采用;3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形式存在;此时加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀;常用的强酸有:10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5%偏磷酸等;含药物血清与强酸的比例为1:混合,离心〈10000r/min1~2min,就可以除去90%以上的蛋白质;取上清液作为样品;因加入了强酸,上清液呈酸性pH0~4,在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白;过量的三氯醋酸可经煮沸,分解为氯仿和二氧化碳而被除去;也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法;过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和,然后加乙醇使产生的高氯酸钾钠沉淀而被除去;偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去;4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时,金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀;常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等;离心分离后所得的上清液pH 分别为~和~;5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时,常需用酶解法;最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素;它不仅可使组织酶,并可使药物析出;枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶,可在较宽的pH活圈~内使蛋白质的肽键降解,在50~60℃具有最大活力;酶解法操作简便;先将待测组织加Tris-缓冲液pH 10·5及酶,60℃培育1h,用玻璃棉过滤,得澄清滤液,即可供药物提取用;酶解法的优点是:可避兔某些药物在酸及高温下降解:对与蛋白质结合牢的药物如保泰松、苯妥英纳,可显着改善回收率;可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成,当采用HPLC法检测时,无需再进行过多的净化操作;酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物;二缀合物的水解尿中药物多数呈缀合状态;一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物,可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物;还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物;由于缀合物较原型药物具有较大的极性,不易被有机溶剂提取;为了测定尿液中药物总量,无论是直接测定或萃取分离之前,都需要将缀合物中的药物释出;有些药物仅需较温和条件即可使药物游离,有些则需较剧烈的方法,常用酸水解或酶水解的方法;酸水解时,可加入适量的盐酸液;至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件,随药物的不同而异,这些条件应通过实验来确定;对于遇酸及受热不稳定的药物,可以用酶水解法;常用葡萄糖醛酸甙酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸甙硫酸酯酶的混合酶;酶水解很少使被测药物或共存物发生降解;虽然酶水解的时间较常,以及由酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及色谱柱顶部阻塞的缺点,但仍被优先选用;三分离、纯化与浓集不管分析目的是什么,其选择性是相当重要的;这是因为内源性物质、代谢物或其它药物的干扰能影响分析结果;对于大多数药物而言,生物样品的分析通常由两步组成:样品的前处理分离、纯化、浓集和对最终提取物的仪器分析;前处理是为了除去介质中含有的大量内源性物质等杂质,提取出低浓度的被测药物,同时浓集药物或代谢物的浓度,使其在所用分析技术的检测范围之内;分析的专属性也有部分取决于仪器分析这一步骤,但主要仍是样品的前处理;提取法是应用最多的分离、纯化方法;提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物,并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集;提取法包括液-液提取法和液-固提取法;1.液-液提取法liquid-liquid extraction,LLE多数药物是亲脂性的,在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度,而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质;因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质,从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品; 应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等; 对所选用的有机溶剂,要求对被测组分的溶解度大:沸点低,易于浓集、挥散;与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等;最常用的溶剂是乙醚和氯仿等;提取时所用的有机溶剂要适量;一般有机相与水相体液样品容积比为1:1或2:1;根据被测药物的性质及方法需要,可从实验中考察其用量与测定响应之间的关系,来确定有机溶剂的最佳用量;PH的影响在溶剂提取中十分重要;水相的pH随药物的理化性质的不同而异,但生物样品一般多在碱性下提取;这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质,而生物样品中的内源性物质多是酸性的,一般不含脂溶性碱性物质,所以在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来;曾有人将空白血清分别与pH2、pH7、及PH13的缓冲液混后用乙醚提取,提取液用RP-HPLCUV-220nm检测测定色谱图时图,发现在碱性pH13下提取液的杂质峰最少,而在中性及酸性下杂质峰显着多而强;当一些碱性药物在碱性pH不稳定时,则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取;而中性药物则在pH7附近提取愚然它可在任一pH被提取;提取时于水相体液样品中加入有机溶剂后,一般只提取一次;个别情况下如杂质不易除去,则须将第二次提取分离出的含药有机相,再用一定pH的水溶液反提取back extraction,然后再从水相将药物提取到有机相;液-液提取法的优点在于它的选择性,这是依赖于有机溶剂的选择;药物能与多数内源性物质分离;而且在使用非专属性的光谱法分析时,这是一个很大的优点;例如,如果一个亲脂性药物的代谢程度很大,它的代谢物与母体化合物具有同样的发色团,这些代谢物将极大地干扰测试;但如果采用一亲脂性溶剂进行提取,该药物能被选择性地提取,而将相对极性大的代谢物留在生物体液中;如果是色谱法,则可利用亲水性溶剂提取药物和代谢物,从而达到分离并共同测定的目的;但是,液-液提取法并不是适用于所有化合物;例如,极性大的药物通常不能用该法提取,但使用离子对试剂,ion pair reagent的离子对提取法impair extraction method,能够将液-液提取法的应用扩展到这类药物中;液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生;乳化作用能引起药物的损失,从而导致较低的回收率;,通常采用较大体积的提取用溶剂或温和的混合方法能克服乳化现象;如果采用相对于样品体积较大体积的溶剂进行提取,在后续步骤中,需将被测组分浓集;2.液-固提取法liquid-solid extration,LES液-固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法;也可以认为是规模缩小的柱色谱法;这种方法是应用液相色谱法原理处理样品;将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱,以溶剂淋洗后,将生物样品通过,使其药物或杂质保留在担体上,用适当溶剂洗去杂质,再用适当溶剂将药物洗脱下来;与LLE相比较,LES具有如下优点:LES较少引入杂质;消除了LIE的主要缺陷――乳化现象;提取效率高;可用少量生物样品进行分析如50~100ul的血浆样品;柱为可弃型,废弃物易从实验室移走;再最后洗脱中多采用以水为主的溶剂系统,大大增加了安全型;最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作,尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物;常用于填充柱的担体大致分为两类:第一类为亲水性的硅藻土等,它可以捕集全部样品,即样品全部吸附在担体颗粒表面,形成一薄层,然后采用一种与水不相混溶的有机溶剂倾入柱中,即可分离药物;第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或C18化学键硅胶等,它们可从样品中吸附亲脂性药物,然后用有机溶剂分离药物;如填充离子交换树脂,可用于高极性、能电离药物的分离;在过去的十多年中,HPLC法色谱柱填充物的种类与数目迅速扩大,这给生物样品的液-固提取前处理法的发展带来了契机,各生产厂家制备出各种微型柱已在广泛地用作固体提取剂;其中有的供手工操作,也有供自动化设备的;1液-固提取法的手工操作法:从市场上可得到含不同吸附剂的微型柱;如由美国Analytichem International公司生产的 Bond Elut和由美国 Waters公司生产的 Sep-pak微型柱等,目前应用最广泛;将样品溶解在适当的溶剂中,加到微型柱上端,在下端通过负压使溶剂流动,商品生产者已生产出“真空集合管”“自动离心式样品萃取器”等,能同时分析操作8~10个微型柱;也可以通过在微型柱的上端利用注射器达到正压或用离心的方法使溶剂流动;洗脱出的分析样品在每一微型柱的正下方用试管收集;微型柱使用的一般步骤:1:用有机溶剂如甲醇,预先湿润微型柱,使增加填料与待测物相互作用的表面积,并可除去可能干扰分析的填料残留物;2:用色谱纯的水或合适的溶剂冲洗,除去过多的甲醇,并为样品提供表面积;3:进样,通过微型柱废液弃去;4:用水或合适溶剂洗柱,选择性地除去将会干扰后面色谱分析的内源性杂质步骤用合适的溶剂洗脱样品,收集,洗脱液用于后面的分析测定或进一步研究;Bond Elut微型柱采用各种极性、非极性硅胶键合填料,Sep-pak系列有C18硅胶、硅酸镁、氧化铝等四种填料;2自动化液固提取法:1983年出现了半自动样品制备系统advanced automated sample processer,AASP,高级自动化样品处理机,Varian公司,使液-固提取法更加简便、快速;这种半自动样品制备系统能使被分析物从固定相洗脱;其制备方法包括:样品经过10个固定填充微柱的离线萃取后,填充微柱被转移到自动进样器作为预柱,其流动相可将被分析物洗脱至分析柱;此法分析物损失小且分析快速;但样品的制备和分析仍然是两个分开的过程;AASP经过两条途径进行了进一步的自动化:一种是采用机器手,另一种是采用带有探头的自动进样器;机器手主要使人工的样品必理过程自动化;因为AASP的填充微柱必须被人工转移到也谱系统,故此法仍是离钱分析;第二种方法是自动进样器与AASP阀门的清洗接头处连接,从而实现了被分析物被自动洗脱到分析柱前、固相活化样品添加和填充微柱清洗的在线联用;3.被测组分的浓集样品在提取过程中,虽然被测组分得到了纯化,但因微量的组分分布在较大体积数毫升的提取溶剂中,提取液往往还不能直接进行分析;一些分析方法如GC法和HPLC法等都受到进样量的限制,若将提取液直接注入仪器,被测组分量可能达不到检测灵敏度,因此,常需要使组分浓集后再进行测定;浓集的方法主要有两种:一种方法是在末次提取时加入的提取液尽量少,使被测组分提取到小体积溶剂中,然后直接吸出适量供测定;另一种方法是挥去溶剂时应避免直接加热,防止被测组分破坏或挥失;挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干;对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物,可采用减压法挥去溶剂;溶剂蒸发所用的试管,底部应为尖锥型,这样可使最后数毫升溶剂集中在管尖,便于量取;近年来,许多学者在研究工作中利用了柱切换技术,生物样品不用溶剂而直接进行分析;这时HPLC仪用来进行样品的制备前处理和分析,其色谱系统由一个预柱和一个分析柱组成;采用柱切换技术,在样品进入分析柱进行分离分析之前,将样品在预柱土进行痕量富集;样品进入预柱,预柱保留被测组分,而将杂质冲入废池,进一步冲洗预柱使样品更洁净,被测组分被反冲出预柱进入分析柱,用UV法、荧光法或电化学法进行最终定量;整个过程是自动化进行的,从开始进样直到数据、报告都由微处理器控制这是一种连接柱的应用技术;即将液-固提取微型柱作为预柱与HPLC仪连接,增加一个泵,先将样品流经预柱,使起到纯化与富集作用,再经分析柱,能提高分析的灵敏度;采用此系列,预柱可被多次利用如每次100ul血浆可注射150次四化学衍生化分离前将药物进行化学衍生化的目的是:1使药物变成具有能被分离的性质;2提高检测灵敏度;3增强药物的稳定性;4提高对光学异构体分离的能力等;药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化,如含有-COOH、-OH、NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化;化学衍生化对GC和HPLC尤为重要;1.GC中化学衍生化法:药物的化学衍生化前处理对GC十分必要,衍生化可使药物分子中的极性基团,如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物,从而使GC的温度不必很高即可适合GC 的分析要求;主要的衍生化反应有烷基化alkylations、酰化acrylations、硅烷化silylations等;其中已硅烷化用得最广泛; 常用的烷基化试剂有碘甲烷CH1、叠氮甲烷CHN2、氢氧化三甲基苯胺TMAH等;常用得酰化试剂有:乙酸酐、丙酸酐等;硅烷化试剂有:三甲基氯硅烷TMCS、双-三甲基硅烷乙酰胺BSA、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺BSTFA、三甲基硅烷咪唑IMTS等;具有光学异构体的药物,由于R-与S +构型不同,使之具有不同的药效和药动学特性,因此,异构体的分离也是十分重要的;分离光学异构体的方法之一,就是采用不对称试剂,使其生成非对映异构体衍生物,然后用GC法或HPLC法进行分析测定;常用的称试剂有:S-N-三氟乙酰脯胺酰氯、S-N-五氟乙酰脯胺酰氯等;2.HPLC中化学衍生化法当采用HPLC法时,其衍生化的目的是为了提高药物的检测灵敏度;一些在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的药物,可以使其与衍生成对可见-紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物;化学衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法;由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应,故与药物具有相同官能团的杂质也会同样生成衍生,这样就有可能妨碍药物的检测;同时,如果杂质含量多时,药物与衍生化试剂的反应率降低,因此,应尽可能将药物进行精制后再衍生化;柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的,所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物,从而提高了选择性;HPLC常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等;在测定生物样品中药物及其代谢物时,样品的前处理是十分重要的;除了少数情况,将体液经简单处理后进行直接测定外,一般要在测定之前进行样品的前处理,即进行分离、纯化、浓集,必要时还需对待测组分进行化学衍生化,从而为测定创造良好的条件;生物样品进行前处理的目的在于:①药物进入体内后,经吸收、分布、代谢,然后排出体外;在体液、组织和排泄物中除了游离型原型药物之外,还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质,如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙gl uronides、硫酸酯sulphates缀合物等多种形式存在,需要分离后测定药物及代谢物;②生物样品的介质组成比较复杂;如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物,也含有Na+、K+、X-等无机化合物;其中影响最大的是蛋白质,若用HPLC法测定药物浓度时,蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞,严重影响分离效果;因此,为了保护仪器,提高测定的灵敏度,必须进行除蛋白等前处理;常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织,但实际上最常用的是比较容易得到的血液血浆、血清、金血、尿液、唾液;在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等;下面仅介绍常用的血样、尿样及唾液;一血样血浆plasma和血清serum是最常用的生物样品;测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度,而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度;一般认为,当药物在体内达到稳定状态时,血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关,即血浆中的药物浓度反映了药物在体内靶器官的状况,因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标;供测定的血样应能代表整个血药浓度,因而应待药物在血液中分布均匀后取样;动物实验时,可直接从动脉或心脏取血;对于病人,通常采取静脉血,有时根据血药浓度和分析方法灵敏度,也可用毛细管采血;由采集的血液制取血浆或血清;血浆的制备将采取的血液置含有抗凝剂如:肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等的试管中,混合后,以2500~3000rpm离心5min使与血细胞分离,分取上清液即为血浆;血清的制备将采取的血样在室温下至少放置30min到1h,待凝结出血饼后,用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼,然后以2000~3000rpm离心分离5~10min,分取上清液.即为血清;血浆比血清分离快,而且制取的量多,其量约为全血的一半;但由于所用抗凝剂的种类不同,用血浆测定药物浓度有时不一致;血清的获取量小,但血清成分更接近于组织液的化学成分,测定血清中有关物质的含量,比全血更能反映机体的具体情况;同时,药物与纤维蛋白几乎不结合,因此,血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的;基于上述原因,现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度;对大多数药物来说,血浆浓度与红细胞中的浓度成正比,所以测定全血也不能提供更多的数据,而全血的净化较血浆和血清更为麻烦,尤其是溶血后,血色素会给测定带来干扰;但在个别情况下也有采用全血测定药物浓度的;例如氯噻酮可与红细胞结合,其动力学行为与在血浆中不同,在血细胞的药物浓度比血浆药物浓度大50~100倍;又如一些三环降压药物,对个别患者来说,在血浆和红细胞的分配比率不是一个常数,因此宜采用全血进行测定;全血Whole blood也应加入抗凝剂混合,防止凝血后影响测定;血样的采取量受到一定限制,特别是间隔比较短的多次取样,患者不易配合;过去一般取1~2ml;随着高灵敏度测定方法的建立,取量可减少到1ml以下;采取静脉血时,目前通行的方法是用注射器直接从静脉抽取,然后置试管中:采取毛细管取血时,应用毛细管或特殊的微量采血管采取;采取血样时,应由从事医疗工作的医生、护士或者临床检查技师实施,药剂师等不能进行采血工作;血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异;例如:进行药物动力学参数的测定时,需给出药物在体内的药物浓度.时间曲线;应根据动力学曲线模型〈单室还是双室、给药方式来确定取样间隔和次数,主要应在曲线首尾及峰值附近或浓度变化较大处取祥;采样次数示意图见如进行治疗药物浓度监测therapeutic drug monitoring,TDM时,则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义;但每种药物的半衰期不同,因此达到稳态的时间也不间,取样时间也随之不同;药物进入体内后,大多数很快与血浆中的蛋白质白蛋白、球蛋白结合成结合型,并与未结合的游离型药物处于平衡状态而存在;结合型药物bound型不能通过血管壁,而游离型药物free型能够到达药物作用部位,因此可以说药物疗效与游离型药物浓度有着比较密切的关系,当然最理想的是测定游离型药物;由于测定游离型药物必须经过“超速离心”或“超滤法”等复杂的分离操作,又因药物的蛋白结合率没有很大的个体差异,通常血药总浓度结合型与游离的总和可以有效表示游离药物的浓度,因此,大多数的检验室不测定游离型药物,而是测定药物的总浓度;但某些疾病可改变药物与血浆蛋白的结合率,如肝硬化病人奎尼丁的游离型药物分数几乎增加三倍;肾病时,苯妥英、水杨酸、安妥明等的血浆蛋白结合卒明显下降;有些药物血浆蛋白结合率存在着很大的个体差异,如奎尼丁的血浆蛋白结合率的范围为50%~90%,不同个体问游离药物浓度差达10倍;也就是说在肝硬化、肾功能不全、肾病变、低营养等状态下,血中白蛋白浓度显着减少,药物的蛋白结合率下降,游离型药物浓度上升,此时应测定游离型药物浓度;采取血样后,应及时分离血浆或血清,并最好立即进行分析;如不能立即测定时,应妥善储存;血浆或血清样品不经蒸发、浓缩,必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存;短期保存时置冰箱4℃中,长期保存时要在冷冻橱库-20℃中冷冻保存;要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存;若不预先分离,血凝后冰冻保存,则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化;二唾液唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的,平时所说的唾液就是指此混合液;一般成人每天分泌1~,但个体差异大,即使是同-个人每日之内、每日之间也有变动;各腺体分泌的唾液组成也会有很大差别;对口腔粘膜给予机械的或化学的剌激时,会影响各唾液腺。
DNA测序样品前处理分离技术
DNA测序样品前处理分离技术DNA测序技术是现代生物学研究和临床医学诊断的重要工具,而样品前处理及分离技术则是确保测序结果准确性和可靠性的基石。
样品的质量直接影响到后续的核酸提取效率、测序深度以及数据的解读。
因此,掌握有效的DNA测序样品前处理分离技术至关重要。
以下是该领域六个核心要点的深入探讨:1. 样品采集与保存样品采集是DNA测序流程的首要步骤,不同类型的生物样本(如血液、唾液、组织、微生物培养物等)需采用特定的采集方法。
采集后的样本必须迅速处理或保存,以防DNA降解。
常用的保存方法包括冷冻(-20°C或-80°C)、添加RNA酶抑制剂以及使用特定的保存液(如EDTA、盐酸胍溶液),这些措施可有效抑制核酸酶活性,保持DNA完整性。
2. 细胞裂解与去污细胞裂解是释放DNA的关键步骤,通常采用物理(如珠磨、超声波破碎)、化学(使用裂解缓冲液包含的表面活性剂、蛋白酶K等)或酶学方法。
去污过程则旨在去除蛋白质、脂质等杂质,常用的技术包括酚-氯仿抽提和固相萃取柱技术。
高效去污不仅能够提高DNA的纯度,还有助于减少后续测序中的污染风险。
3. DNA提取与纯化DNA提取是将DNA从裂解液中分离出来,常用的方法有离心柱法、磁珠法和沉淀法。
离心柱法基于亲和层析原理,利用硅胶膜或纤维素膜捕获DNA;磁珠法则利用表面偶联有DNA结合分子的磁性微粒,在磁场作用下实现DNA的快速富集与清洗;沉淀法则依赖于DNA在高盐浓度或酒精存在下的凝聚性质。
纯化过程需精细操作,以确保DNA片段大小符合测序要求,并去除任何残留的污染物。
4. 核酸定量与质量控制DNA提取后,需通过紫外光吸收(如A260/A280比值)或荧光定量(如Qubit荧光计)确定DNA浓度和纯度。
此外,电泳(如琼脂糖凝胶电泳)可用于检测DNA的完整性,评估是否有断裂或降解现象。
准确的定量与质量控制对于后续的文库制备至关重要,可避免因DNA质量不佳导致的测序失败或数据偏差。
生物样品前处理
生物样品前处理第四节生物样品分析的前处理技术一般要在测定之前进行样品的前处理,即进行分离、纯化、浓集,必要时还需对待测组分进行化学衍生化,从而为测定创造良好的条件。
生物样品进行前处理的目的在于:1.药物进入体内后,经吸收、分布、代谢,然后排出体外。
在体液、组织和排泄物中除了游离型(原型)药物之外,还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质,如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙(glucuronides)、硫酸酯(sulphates)缀合物等多种形式存在,需要分离后测定药物及代谢物;2.生物样品的介质组成比较复杂。
如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物,也含有Na +、K+、X-等无机化合物]。
其中影响最大的是蛋白质,若用HPLC法测定药物浓度时,蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞,严重影响分离效果。
因此,为了保护仪器,提高测定的灵敏度,必须进行除蛋白等前处理。
一、常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织,但实际上最常用的是比较容易得到的血液(血浆、血清、金血)、尿液、唾液。
在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。
(一)血样血浆(plasma)和血清(serum)是最常用的生物样品。
血浆中的药物浓度反映了药物在体内(靶器官)的状况,因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。
供测定的血样应能代表整个血药浓度,因而应待药物在血液中分布均匀后取样。
由采集的血液制取血浆或血清。
血浆的制备将采取的血液置含有抗凝剂(如:肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等)的试管中,混合后,以2500~3000rpm 离心5min使与血细胞分离,分取上清液即为血浆。
血清的制备将采取的血样在室温下至少放置30min到1h,待凝结出血饼后,用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼,然后以2000~3000rpm离心分离5~10min,分取上清液.即为血清。
血浆比血清分离快,而且制取的量多,其量约为全血的一半。
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落,并在适宜的培养条件下进行纯化和生长,以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品,包括土样、水样、空气、食品等,然后将样品采集到无菌容器中,再将其送到实验室。
在进行样品处理之前,需要先进行简单的初步处理,将样品进行稀释或者过滤,将其中的杂质和大颗粒物去除,以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基,根据不同的微生物种类,需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下,我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等,以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中,打开试管口,加入适量的制备好的培养基,然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上,使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中,以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内,不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落,每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取,并再次进行培养,就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后,需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上,使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内,微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态,可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析,可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作,以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
生物样品的样品制备技术
生物样品的样品制备技术生物样品的样品制备技术是一项复杂的过程,它可以影响数据的准确性和可重复性。
生物样本包括血液、组织、血清、唾液、尿液等等。
生物医学研究和临床实践都需要对这些生物样品进行定量、定性、分析和诊断,因此,在样品的制备过程中,需要考虑样品的种类、处理方法、仪器设备和操作技巧等因素。
本文将对生物样品的样品制备技术进行讨论。
一、生物样品的收集和保存样品的质量和稳定性对最终的结果至关重要。
因此,在样品的收集和保存过程中,需要注意以下几点:(1)准确记录样品的信息包括样品编号、收集日期、收集地点、样品类型、收集量等信息。
这些信息对于后续的分析和研究非常重要。
(2)样品的收集采用适宜的采集管或容器进行收集,避免污染和损伤。
例如,血样的采集需要用无菌针头和无菌采血管,并且需要严格按照标准操作程序进行采血。
(3)样品的处理样品的预处理可以移除杂质、保护样品、提高分析灵敏度等目的,简化后续的操作流程。
如,将血样进行离心分离血浆和血细胞。
(4)样品保存根据不同的样品种类,选择合适的保存方法,避免样品的降解和变质。
例如,血样和组织样品应该保存在低温和冷冻条件下。
二、生物样品的样品制备流程生物样品的样品制备流程包括样品的处理、分离、纯化等步骤。
这些步骤可以提取感兴趣的化合物、分子、生物标志物等,从而实现对样品的定量、定性、分析和诊断。
(1)样品的处理样品的处理包括前处理、蛋白质去除、核酸去除等步骤。
前处理可以清洗或降解杂质,保护目标样品,如血液样品的前处理可以去除氯仿、磷酸钾等浓度高的化合物。
蛋白质去除可以通常使用抗体、酶等进行。
核酸去除可以使用RNAase或DNase酶。
(2)样品的分离样品的分离包括离心分离、柱层析分离、电泳分离、毛细管电泳等步骤。
这些方法根据样品类型和杂质特征进行选择。
离心分离可以分离细胞、血浆等物质。
柱层析分离可以根据物质的大小、电性、化学性等特征进行分离。
电泳分离主要用于分离DNA、RNA、蛋白质等。
生物化学实验操作方法
生物化学实验操作方法
生物化学实验操作方法包括以下步骤:
1. 实验前准备:准确称量实验所需的物质,准备实验器材和试剂,清洗实验用具,确保实验平台和环境干净。
2. 样品制备:根据实验的要求,准确取一定量的样品,并按照指定的步骤进行预处理,例如研磨、离心、分离等。
3. 反应体系建立:按照实验要求,将所需的试剂加入杂交管或反应管中,进行反应所需的混合,注意控制反应体系的pH值、温度和离子浓度等。
4. 测定反应过程:通过光谱法、比色法、电泳法等实验方法对反应过程进行测定,记录测定结果。
5. 结果分析:根据实验结果进行分析,确定实验目的是否达到,并评估实验结果的可信度。
6. 结论阐述:根据实验结果,撰写实验报告,并提出结论和建议。
生物样品前处理方法
组织:脑、心、肝、脾、肺、肾、胃等
头发
二.生物样品处理的目的
药物从缀合物及结合物中释放- 测定药物的总浓度 分离并富集所要测定的成分
目的
去除生物样品中的大分子杂质, 满足测定方法对分析样品的要求 保护仪器性能,改善分析条件
三.前处理过程及方法
药
1.去除蛋白质
内源 性酸
蛋白质
2.缀合物水解
溶剂解 法
生物样品前处理方法contentcontent生物样品处理目的前处理过程及方法分析方法的限度要求生物样品的种类根据药物具体性质选择根据药物具体性质选择血清血清serumserumwholebloodwholeblood血浆血浆plasmaplasma置含有抗凝剂的试管中25003000rpm离心510min淡黄色上清液约为全血的5060药物动力学生物利用度临床治疗药物浓度监测置试管中于37或室温放置30min1h血液凝固后剥去试管壁上的血饼25003000rpm离心510min淡黄色液体约为全血2040血清的获取量小但血清成分更接近于组织液的化学成分测定血清中有关物质的含量比全血更能反映机体的具体情况加入抗凝剂混合防止凝血后影响测定对于与红细胞结合的药物以及血浆浓度低或药物在血浆不红细胞分配比丌恒定的情况下应用生物样品的种类唾液唾液salivasaliva尿液尿液urineurine一般采集时间尿规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量药物浓度高但变化体内药物清除以原形i相及ii相代谢物等多种形式通过尿液排出排出预测药物代谢过程类型计算药物尿清除率生物利用度的研究
ห้องสมุดไป่ตู้
唾液(saliva)
在漱口后15min ,安静状态下采 集口腔内自然流出的唾液;也可 在刺激下快速采样,石蜡片,聚 四氟乙烯块,纱布球,柠檬酸, 维生素C等置于舌尖,弃取初始 部分后采集 血浆游离药物浓度( P)密切 相关,可使用 唾液样品 CS/CP 比 值较恒定时 ,可代替血样进行 TDM 及药代动力学研究
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原理:仪器发出一定频率的超声波产生振 动力破碎细胞壁和细胞器。由超声波发生 器和超声换能器两部分构成。 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑 选不同长短、粗细,以满足0.1~250ml的容 量需要。
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超声波细胞破碎机
应用:用于各种动植物细胞、 病毒细胞、细菌及组织的破碎, 也可用于各类高分子物质的破 碎,同时可用来乳化、分离、 匀化、提取、消泡清洗及加速 化学反应等。
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3.1.3 提高过滤速度的常用方法
1.选择适当的过滤介质 应考虑:①孔径大小应适于截流被分离的固 体颗粒,孔径过大,则滤液不清,过小则 滤速慢。②孔的数目多,孔道短且直,则 滤速快,否则滤速慢。③耐酸碱,化学稳 定性好。④有一定机械强度,易于回收。 ⑤使用寿命长,成本低。 过滤介质的材质: ①棉、麻、丝织品; ②玻璃纤维、垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板、 涤纶等; ③滤纸(工业用和分析用,慢速、中速、快 速),实验室里最常用。 19
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2.2 细胞的破碎 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织, 其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同,如动 物脏器的细胞膜较脆弱,容易破碎,植物和微生物由 于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁,要 采取专门的细胞破碎方法。 2.2.1 细胞破碎方法 (1)机械法 1) 研磨:将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中, 加入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器:这是一种较剧烈的破碎细胞的方法, 通常可先用家用食品加工机将组织打碎,然后再用 10000r/min~20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高 速分散器)将组织的细胞打碎。
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3.1.2 影响滤过的因素
1.液体的粘滞度:粘滞度大,则滤速慢;粘 滞度随温度升高而降低,故升温可加快过 滤速度。 2.滤膜的材料、材质:如滤纸、滤布、玻璃 纤维、石棉板、多孔陶瓷滤板等,其毛细 管越长,管径越小或数目越少,则过滤速 度越慢。 3.压差:压差越大,过滤速度越快。 4.滤渣:滤渣越厚,过滤速度越慢。 5.过滤液性状:过滤液中有沉淀、胶状物或 其它可压缩的物质,均能造成滤膜孔堵塞, 减慢过滤速度。
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3.2 超滤
超过滤即超滤,自20年代问世后, 直至60年代以来发展迅速,很快由实 验室规模的分离手段发展成重要的工 业单元操作技术。超滤现已成为一种 重要的生化实验技术,广泛用于含有 各种小分子溶质的各种生物大分子 (如蛋白质、酶、核酸等)的浓缩、 分离和纯化。
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超滤
原理:超滤是一种加 压膜分离技术,即在 一定的压力下,使小 分子溶质和溶剂穿过 一定孔径的特制的薄 膜,而使大分子溶质 不能透过,留在膜的 一边,从而使大分子 物质得到了部分的纯 化。
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超滤技术的关键是膜
常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者 的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异 性膜,例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。 这种膜在pH 1~14都是稳定的,且能在90℃下 正常工作。超滤膜通常是比较稳定的,能连续用 1~2年。 超滤膜的基本性能指标: 水通量(cm3/(cm2· h)); 截留率(以百分率%表示); 化学物理稳定性(包括机械强度)等。
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3.2 超滤装置
本装置由蠕动泵、超滤器、 压力表、调压阀及相应管 路等组成。 1、试样 2、蠕动泵 3、 超滤器 4、超滤液 5、 调压阀 6、隔膜压力表
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4. 透析
4.1 透析 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已 有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便 最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制 备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小 分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。 透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留 在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”, 袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。 截留分子量MWCO通常为1万左右。
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(2)物理法
1) 反复冻融法:将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃, 然后放于室温(或40℃)迅速融化,如此反复冻融多次, 由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起 细胞溶胀破碎。 2) 超声波处理法:此法是借助超声波的振动力破碎细 胞壁和细胞器。多用于微生物材料,处理时间有数分 钟到数十分钟不等,破碎细菌和酵母菌时,时间要长 一些。 3) 压榨法:这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。 在1000×105Pa~2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通 过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法:从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时 可用此法。在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中 使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎。
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2.2.2细胞破碎相关的器械与器材
1)电动组织捣碎机
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电动组织捣碎机
原理:用可调速电机驱 动捣碎转子(头)在高 速旋转下将组织打碎达 到匀浆目的。 市售仪器多数是可调速 机型,有不同口径、头 端式样的转子供选择, 平头转子适于制备乳浊 液及悬浮液,锯齿状转 子适于制备组织和含纤 维物质的匀浆。
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5. 生物样品的浓缩
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1.2 生物样品的处理制备通常可按以下步骤进行:
①确定要制备的生物样品的目的和要求,是进 行科研、开发还是要发现新的物质。 ②建立相应的可靠的分析测定方法,这是进行 生物样品制备的关键。 ③通过文献调研和预备性实验,掌握生物样品 及产物的物理化学性质。 ④生物材料的破碎和预处理。 ⑤分离纯化方案的选择和探索,这是最困难的 过程。 ⑥产物的浓缩,干燥和保存。
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超滤技术
超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管 式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物 大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质 极易粘附和沉积于膜表面上,造成严重的浓差极 化和堵塞,这是超滤法最关键的问题,要克服浓 差极化,通常可加大液体流量,加强湍流和加强 搅拌。常用有真空透析超滤、离心浓缩超滤、加 压搅拌室超滤、切向流系统超滤。
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Байду номын сангаас
注意事項: *操作时必需戴手套*
1. 取出透析袋要先用蒸餾水清洗乾淨,綁透析 袋前要先試裝蒸餾水,看透析袋有沒有蛀孔, 會不會有水噴出。 綁透析袋不要太用力拉扯, 否則透析袋可能會裂。
2. 一般透析至少要 3 h,至少要換兩次透析液 (100 至 1000 倍樣本體積) 才能完全。 3. 注意離心濃縮管的離心轉速不能太快,否則 薄膜很容易破裂。 4. 每次離心濃縮後,暫時不要丟掉外濾液 (filtrate),收集起來以防薄膜破裂流失。
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3)加压细胞破碎机
原理:利用高压使细胞悬液 通过一个小孔(小于细胞直 径的孔径)致使细胞被挤破、 压碎,特别适用于厚壁细胞、 细菌和较浓样品的破碎,具 有快速、方便、无噪声的特 点。 主要技术参数 电压:380V 最大破碎压力:300Mpa
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3. 过滤及超滤装置
3.1 过滤
原理:利用多孔介质阻留固体或大于多孔 介质孔径的分子而让液体通过,使固体和 液体分离的方法。 目的: 1)去除不溶性杂质得到所需要的清液 以供进一步实验。 2)收集固体中间产物或结晶成品。
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3.1.1 过滤所需器材:
滤膜(滤纸)、漏斗、滤瓶,加压、减压 过滤需外配气泵、蠕动泵、真空泵,并不 涉及复杂的器具。
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(3)化学与生物化学方法
1) 自溶法:将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的 温度下,细胞结构在自身所具有的各种水解酶(如蛋白 酶和酯酶等)的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出 来。 2) 溶胀法:细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓 度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进 入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 3) 酶解法:利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗 牛酶和酯酶等,于37℃,pH8,处理15分钟,可以专一性 地将细胞壁分解。 4) 有机溶剂处理法:利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶 剂或SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞,可 将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与研磨法 联合使用。
2.加助滤剂。如硅藻土、活性炭、细砂等。 3.增加过滤推动力。常压、加压、减压。 加压和减压过滤在过滤介质的下面都必须有 支持滤板,如强度较大的烧瓷滤板等。 4.提高过滤时的温度。以减少溶液粘度,增 大溶质的溶解度,但不适于热敏物质。 5.离心过滤法,利用离心力促使滤液通过过 滤介质,适于分离小量组织样品。
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电动组织捣碎机
应用:一般用于动物组织,植物肉质 种子,柔嫩的叶、芽等材料。国产的 捣碎机最高转速可达1-2万转/分,因 旋转刀刃的机械切力很大,制备较大 分子样品很少使用。动、植物细胞 30-45秒完全破碎,酵母菌和细菌需 加入石英砂加强效果。
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2)超声波细胞破碎机
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超声波细胞破碎机
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2. 生物大分子制备的前处理 2.1 生物材料的选择
(1)制备生物大分子,首先要选择适当的生物材 料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢 产物。 (2)选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺 简单、成本低,尽可能保持新鲜,尽快加工处理。 (3)动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性 部分,绞碎后在适当的溶剂中提取,如果所要求的成 分在细胞内,则要先破碎细胞。 (4)植物要先去壳、除脂。 (5)微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 (6)生物材料如暂不提取,应冰冻保存。动物材 料则需深度冷冻保存。
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透析
透析:膜分离技术的一种, 仅让小分子扩散性的选择 性的通过透过膜,把小分 子从溶液中分离出去而保 留生物大分子的技术。 应用:常用于改换大分子 溶液的盐成分,除去小分 子,改变溶剂成分等。