生物样品前处理
干湿结合生物学研究方法
干湿结合生物学研究方法在生物学研究领域，干湿结合的方法已经成为一种高效、全面的研究策略，涵盖了从生物样品的前处理到测序与表达分析等多个步骤。
干湿结合生物学研究方法结合了湿法和干法两种技术，下面将详细介绍这些内容。
1、湿法生物样品前处理湿法生物样品前处理是一种常用的样品处理方法，主要利用液体介质进行样品破碎、细胞裂解和蛋白质、核酸等生物分子的提取。
湿法处理具有高效、温和的优点，适用于大部分生物样品的处理。
湿法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、蛋白质变性、核酸提取等。
在操作过程中，需要注意保持无菌条件，避免样品污染，同时要尽量减少对生物分子的破坏，保持其天然活性。
2、干法生物样品前处理干法生物样品前处理主要利用干粉试剂或干式生化试剂进行样品破碎、细胞裂解和生物分子的提取。
干法处理具有简便、快速、无需特殊设备的优点，适用于一些不易获得的生物样品或需要快速处理的紧急样品。
干法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、干燥、试剂添加等。
在操作过程中，需要注意避免样品污染，保证细胞的充分破碎和裂解，同时要保证生物分子的完整性。
3、蛋白质生物样品分离与纯化蛋白质生物样品分离与纯化是生物学研究中的重要步骤，其主要目的是将目标蛋白质与其他生物分子（如核酸、脂质等）进行有效分离，从而对其进行深入研究和应用。
蛋白质生物样品分离与纯化的主要方法包括：离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳等。
这些方法各有特点，适用范围也不同，需要根据具体研究需求进行选择。
在操作过程中，需要注意保证样品的均一性和回收率，同时要尽量避免非特异性吸附和样品损失。
4、DNA生物样品提取与纯化DNA生物样品提取与纯化的目的是从生物样品中提取出高质量的DNA，去除其中的杂质和干扰物质，以便进行后续的基因组学研究。
DNA生物样品提取与纯化的主要方法包括：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法、磁珠法等。
这些方法都能够高效地提取和纯化DNA，但操作过程和适用范围略有不同。
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品前处理
[5]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学.2006,(34)7: 1035-1041
[6]张丽华，肖国平，宋游.微波技术在生物样品预处理中的应用[J].基础和应用基础研究与放射化学与核化学:133
2.对于在常温下需要长时间反应的样品，可将准备好的样品放置过夜，第2天再放进消解炉消解。
3.对于预处理时间长的难处理样品，也可采用放过夜的方法，第2天再进行消解处理。样品经过处理后，若溶液体积小于5ml时，则必须补加水或酸，使其体积不小于5ml，然后再进行微波消解。
总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。
[1]周婷婷,范国荣,吴玉田.超临界流体萃取法在生物样品前处理中的应用[J].药学学报.2004 ,39(4) :317 – 320
[2]张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006, 18(1):56-58
[3]李向阳，杨梅，彭宝珠.固相微萃取在生物药物分析中的应用[J].2002,23(4):69-71
目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛[5]。
分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。
生物样品前处理
Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
基质效应评价方法
柱后灌注法 提取后加入法（相对基质效应评价）
•MF：基质效应因子 •MF=Set 2/Set 1 •IS-normalized MF : 内标归一化基质效应因子
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。
药物分析中的生物样品前处理方法研究
药物分析中的生物样品前处理方法研究近年来，随着生物医药领域的快速发展，药物分析在疾病的诊断和治疗中扮演着至关重要的角色。
为了获得准确可靠的分析结果，生物样品的前处理方法显得尤为重要。
本文将探讨药物分析中常用的生物样品前处理方法的研究进展。
一、血液样品的前处理方法研究血液样品作为一种常见的生物样品，在药物分析中扮演着重要的角色。
然而，血液样品中存在着各种成分的干扰，如蛋白质、血红蛋白等。
因此，研究人员提出了多种前处理方法来解决这些问题。
1. 血浆/血清的蛋白质沉淀方法血浆/血清中的蛋白质是最常见的干扰物之一。
为了降低蛋白质对分析结果的影响，研究人员开发了各种蛋白质沉淀方法。
例如，酸沉淀法可以通过改变pH值使蛋白质凝聚沉淀，从而去除蛋白质干扰。
此外，还有醇沉淀法、有机溶剂沉淀法等。
2. 血浆/血清的固相萃取方法固相萃取方法是血液样品前处理中常用的技术之一。
其原理是利用吸附剂对目标化合物进行特异性吸附，从而去除干扰物。
通过选择合适的吸附剂，可以实现对特定成分的富集。
例如，固相萃取柱常用于血浆/血清样品中药物的富集与净化。
二、尿液样品的前处理方法研究尿液样品常用于药物代谢和排泄的研究，但由于其复杂的成分和高度变异性，前处理方法显得尤为重要。
1. 尿液样品的前处理方法选择尿液样品前处理的关键是选择合适的方法。
常见的前处理方法包括尿液蛋白质去除、有机溶剂浓缩、尿液稀释等。
根据具体的分析需求和目标物质的特性，选择恰当的前处理方法可以显著提高分析结果的准确性和灵敏度。
2. 尿液样品的固相萃取方法研究固相萃取也是尿液样品前处理中常用的技术之一。
通过选择适当的吸附剂和前处理条件，可以有效地去除尿液中的杂质，提高目标物质的测量灵敏度。
例如，固相萃取柱结合气相色谱-质谱联用技术可以用于尿液样品中药物代谢产物的研究。
三、其他生物样品的前处理方法研究除了血液和尿液样品，还有其他生物样品在药物分析中的应用。
例如，头发样品被广泛用于毒品滥用的检测。
化学分析方法的生物样品前处理技术
化学分析方法的生物样品前处理技术化学分析是现代科学研究和工业生产中不可或缺的一环。
为了获得准确和可靠的化学分析结果，对于生物样品的前处理技术至关重要。
本文将介绍几种常用的生物样品前处理技术，包括固相萃取、液液萃取、溶剂萃取和分离提纯技术。
一、固相萃取技术固相萃取（Solid-phase Extraction，简称SPE）是一种用于生物样品前处理的重要技术。
其原理是将待检样品与吸附剂接触或通过吸附剂时，目标分析物被吸附到吸附剂上，达到样品的富集和净化。
固相萃取技术具有以下优点：操作简单、灵敏度高、富集效果好、耗时短等。
在化学分析领域中被广泛应用。
二、液液萃取技术液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，简称LLE）是一种通过溶剂与待检样品中目标分析物的选择性溶解度差异而发生分离的技术。
其原理是将待检样品与萃取溶剂进行充分混合搅拌后，静置，根据目标分析物在两种溶剂中的分配系数，使其转移到相应的溶剂层中。
液液萃取技术适用范围广泛，操作简单。
但其溶剂消耗大，使用过程中易产生有机溶剂挥发、环境危害等问题，因此在实际应用中需要加以控制和优化。
三、溶剂萃取技术溶剂萃取技术（Solvent Extraction）是指通过非挥发性溶剂将目标分析物从待测样品中提取出来。
它是一种在液液界面上基于物质间相互作用力原理进行的分离技术。
该技术广泛应用于生物样品的前处理中。
溶剂萃取技术不仅可以提取有机物，还能用于提取无机物，同时能实现溶液的浓缩和纯化。
在生物样品前处理中，该技术常与其他技术，如SPE技术结合使用，以实现样品更好的富集和净化效果。
四、分离提纯技术分离提纯技术在生物样品前处理过程中起到了至关重要的作用。
常见的分离提纯技术包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等。
薄层色谱技术（Thin Layer Chromatography，简称TLC）是一种常用的分离化合物的方法。
它通过将待测样品在薄层色谱板上作用，根据各种成分的溶解度差异和物理化学性质等特点进行分离。
生物样本样品前处理
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常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷
乙醚 戊烷 环己烷 正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
分子量 84.9 88.1 92.6 74.1 72.2 84.2 86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
注：“*”表示与水互溶
沸点（℃） 40
5、固相萃取法：可实现自动化，基质效应降低，同时完成样品的富
集与净化；但成本较高
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液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中。
➢两相的分离需借助两相的密度差来实现
➢原理：相似相溶
➢分配系数：kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率
常见表面活性剂：Triton-X-100，吐温等
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集，考虑将待测物从容器中解离出来。
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讨论和问题
Thank you!
15
0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
5
固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
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固相提取法
7
固相提取法
8
固相提取法
改变化合物PH，酸性 保留，碱性洗脱
77.1 77
34.5 36.1 80.7
69 110.6 82.4
66 81.6 117 100
密度（g/mL) 1.33 0.90 0.89 0.71 0.63 0.78 0.66 0.87 0.79 0.89 0.78 1.00 1.00
透射电镜生物样品前处理步骤
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
生物制药技术中的生物样品处理与分析方法
生物制药技术中的生物样品处理与分析方法生物制药技术在医药领域的应用日益广泛，其关键环节之一是生物样品的处理与分析。
生物样品处理与分析方法的选择和优化对于保证生物制药产品的质量和效力至关重要。
本文将介绍生物制药技术中常用的生物样品处理与分析方法，包括样品采集、样品前处理、样品分析等，以及其所涉及的原理和应用。
一、样品采集在生物制药技术中，样品采集是第一步，直接影响后续的样品处理与分析结果。
常见的生物样品包括血液、尿液、组织等。
对于血液样品，最常用的采集方法是采用针头抽血，然后将血液转移到适当的采样管中。
对于尿液样品，通常采用尿杯收集新鲜尿液，然后进行必要的保存和处理。
对于组织样品，常用的方法是通过手术或穿刺获取组织样本，并将其保存在适当的容器中。
二、样品前处理生物样品经过采集后，需要进行前处理来去除干扰物和提取目标分析物。
常见的前处理方法包括离心、过滤、沉淀等。
离心是通过旋转离心机使样品分离成上清液和沉淀物，用于去除离心后产生的沉淀物。
过滤是通过使用合适孔径的过滤器去除样品中的固体颗粒和杂质，例如细胞碎块和蛋白质等。
沉淀是通过加入特定试剂使样品中的目标分析物凝聚成沉淀物，然后通过离心或过滤的方式将其分离出来。
这些前处理方法能够有效地去除样品中的干扰物，提高后续分析的准确性和灵敏度。
三、样品分析生物制药技术中的样品分析是通过对样品中的目标分析物进行定量或定性分析，来评估生物制药产品的质量和效力。
常见的样品分析方法包括免疫学分析、核酸分析、代谢物分析等。
1. 免疫学分析免疫学分析是通过检测样品中的特定抗原或抗体来定量或定性样品中的分析物。
免疫学分析常见的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析、免疫电泳等。
通过这些方法，可以检测生物制药产品中的特定蛋白质、抗体等成分，评估产品的纯度和含量。
2. 核酸分析核酸分析是通过检测样品中的DNA或RNA来定量或定性样品中的分析物。
常见的核酸分析方法包括聚合酶链反应（PCR）、核酸杂交、基因测序等。
生物样品前处理技术的应用
生物样品前处理技术的应用生物样品前处理技术在生命科学领域中占有重要地位。
生物样品前处理是一项重要的工作，可以去除样本中的杂质和干扰物，提高样本的质量，使后续的实验更加准确、可靠和有针对性。
在生物学研究中，生物样品前处理技术的应用范围很广，例如DNA/RNA提取、蛋白质分离和检测、细胞的培养和分离等。
一、生物样品前处理技术的概述生物样品前处理技术与生物学实验密切相关。
它主要是通过分离、纯化或者精细加工样品，去掉不同程度的杂质和干扰物，使之达到所需的纯度和浓度。
样品前处理可以将样品提纯、改进或者整合样品中的各种成分。
有效的样品前处理可以显著增加实验的准确性和重复性。
生物样品前处理技术包括样品采集、样品处理、样品保存等等。
二、生物样品前处理技术在实验室中的应用DNA/RNA提取DNA/RNA提取是分子生物学研究中常见的基础技术之一。
提取纯度高、浓度高的DNA/RNA样品，是后续的PCR、RT-PCR、基因克隆、基因编辑、测序等实验的关键步骤。
生物样品前处理技术在DNA/RNA提取中发挥着非常重要的作用。
DNA/RNA的提取要求样品的纯度必须非常高，并且要去除不同程度的污染物，样品处理要保证其免受其他生化反应或腐败率影响，防止它们在样品中随时间的推移而产生的降解、氧化等现象。
此外，为了保持提取的DNA/RNA的纯度高，必须选择恰当的DNA/RNA提取试剂和操作方式，以确保提取的DNA/RNA是实验所需的纯度和浓度。
蛋白质分离和检测蛋白质是生命体内的重要组成部分，它们的功能和结构决定了生物体的特性。
蛋白质在实验中的研究调查可以帮助我们了解生物学和医学现象，以及判断新药物开发的可行性。
在蛋白质分离和检测过程中，使用生物样品前处理技术可以帮助我们有效分离不同种类的蛋白质。
生物样品前处理技术可以包括样品的裂解、蛋白质的分离和检测。
相应地，应选择合适的裂解技术，如超声波、球磨法和化学裂解等，以破坏细胞壁，使蛋白质充分裂解。
生物样本样品前处理
包括抗凝、分离血清或血浆等步骤，为血液学实验提 供合格的样本。
THANKS
感谢观看
对于光敏感的样品，在处理和 保存过程中应避免直接光照， 采用避光容器或包装材料。
添加稳定剂
根据样品的性质，可以添加适量 的稳定剂，如抗氧化剂、防腐剂 等，以保持样品的稳定性。
减少处理时间
尽量缩短样品前处理的时间，减 少样品暴露在不利环境中的机会
，从而降低样品变质的风险。
05
样品前处理中的质量控制
质量控制标准制定
稳定性和可重复性。
前处理流程简介
样本收集与保存
根据研究目的和实验设计，选择合适的生物样本（如血液、尿液、组织等），并进行适当的保存和处理，以避免样本 变质或目标分析物的损失。
样本预处理
对收集到的生物样本进行初步处理，如离心、过滤、稀释等，以去除杂质和干扰因素，为后续的分析步骤提供纯净的 样本。
目标分析物的提取与富集
03
代谢物衍生化
利用色谱、质谱等技术对代谢物 进行分离和纯化，去除干扰物质。
对于某些难以检测或不稳定的代 谢物，可以通过衍生化反应提高 其检测灵敏度和稳定性。
其他生物样本前处理技术
组织样本前处理
包括组织固定、脱水、包埋、切片等步骤，为后续组 织学观察和实验提供基础。
细胞样本前处理
包括细胞培养、传代、冻存等步骤，为细胞实验提供 充足的细胞来源。
03
样品分离与纯化
分离技术介绍
01
02
03Leabharlann 色谱分离技术利用不同物质在固定相和 流动相之间的分配系数差 异，实现样品的分离，如 液相色谱、气相色谱等。
电泳分离技术
利用物质在电场作用下的 迁移速度差异，实现样品 的分离，如凝胶电泳、毛 细管电泳等。
生物样品分析前处理技术
生物样品分析前处理技术生物样品的前处理涉及很多方面,但主要应考虑生物样品的种类,被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题;1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型;例如,血浆或血清需除蛋白,使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出,当原型药物排泄在尿中时,可简单地用水稀释一定倍数后进行测定;2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等,采取相应的前处理方法;例如,药物的酸碱性pka、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性;药物在样品中的浓度相差很大,浓度大的样品,对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高;此外,药物在体内常产生许多代谢产物,其中一些代谢物仍具有药理活性,需要与原型药分别测定,因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性;3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同;即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关;一般说来,放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性,因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法,分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法,为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上,上柱前需对生物样品进行去蛋白,有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理;样品处理步骤与分析方法的选择一去除蛋白质在测定血样时,首先应去除蛋白质;去除蛋白质可使结合型的药物均出来,以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡,减少乳化的形成,以及可以保护仪器性能如保护HPLC柱不被沾污,延长使用期限;去除蛋白法有以下几种;1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚,使与蛋白质结合的药物释放出来;常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等;含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：1～3时,就可以将90％以上的蛋白质除去;水溶性有机溶剂的种类不同时,析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别,如用乙腈或甲醇时,上清液pH为～,用乙醇或丙酮时,上清液pH为9～10;操作时,将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离,取上清液作为样品;通常分离血浆或血清用的离心机3000r/min不能将蛋白质沉淀完全,而采用超速离心机10000r／min离心1～2min便可将析出的蛋白质完全沉淀;离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管,可使析出的蛋白质牢固地粘在管底,便于上清液的吸取;2.加入中性盐加入中性盐,使溶液的离子强度发生变化;中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来,从而使蛋白质脱水而沉淀;常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等;操作时,如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2,混合,离心10000r/min1～2min,即可除去90％以上的蛋白质;所得上清液的pH为～这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时,药物的回收率高,因而常常被采用;3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形式存在;此时加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀;常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等;含药物血清与强酸的比例为1：混合,离心〈10000r／min1～2min,就可以除去90％以上的蛋白质;取上清液作为样品;因加入了强酸,上清液呈酸性pH0～4,在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白;过量的三氯醋酸可经煮沸,分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法;过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和,然后加乙醇使产生的高氯酸钾钠沉淀而被除去;偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去;4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时,金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀;常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等;离心分离后所得的上清液pH 分别为～和～;5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时,常需用酶解法;最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素;它不仅可使组织酶,并可使药物析出;枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶,可在较宽的pH活圈～内使蛋白质的肽键降解,在50～60℃具有最大活力;酶解法操作简便;先将待测组织加Tris-缓冲液pH 10·5及酶,60℃培育1h,用玻璃棉过滤,得澄清滤液,即可供药物提取用;酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物如保泰松、苯妥英纳,可显着改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成,当采用HPLC法检测时,无需再进行过多的净化操作;酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物;二缀合物的水解尿中药物多数呈缀合状态;一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物,可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物;由于缀合物较原型药物具有较大的极性,不易被有机溶剂提取;为了测定尿液中药物总量,无论是直接测定或萃取分离之前,都需要将缀合物中的药物释出;有些药物仅需较温和条件即可使药物游离,有些则需较剧烈的方法,常用酸水解或酶水解的方法;酸水解时,可加入适量的盐酸液;至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件,随药物的不同而异,这些条件应通过实验来确定;对于遇酸及受热不稳定的药物,可以用酶水解法;常用葡萄糖醛酸甙酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸甙硫酸酯酶的混合酶;酶水解很少使被测药物或共存物发生降解;虽然酶水解的时间较常,以及由酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及色谱柱顶部阻塞的缺点,但仍被优先选用;三分离、纯化与浓集不管分析目的是什么,其选择性是相当重要的;这是因为内源性物质、代谢物或其它药物的干扰能影响分析结果;对于大多数药物而言,生物样品的分析通常由两步组成：样品的前处理分离、纯化、浓集和对最终提取物的仪器分析;前处理是为了除去介质中含有的大量内源性物质等杂质,提取出低浓度的被测药物,同时浓集药物或代谢物的浓度,使其在所用分析技术的检测范围之内；分析的专属性也有部分取决于仪器分析这一步骤,但主要仍是样品的前处理;提取法是应用最多的分离、纯化方法;提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物,并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集;提取法包括液-液提取法和液-固提取法;1.液-液提取法liquid-liquid extraction,LLE多数药物是亲脂性的,在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度,而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质;因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质,从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品; 应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等; 对所选用的有机溶剂,要求对被测组分的溶解度大：沸点低,易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等;最常用的溶剂是乙醚和氯仿等;提取时所用的有机溶剂要适量;一般有机相与水相体液样品容积比为1：1或2：1;根据被测药物的性质及方法需要,可从实验中考察其用量与测定响应之间的关系,来确定有机溶剂的最佳用量;PH的影响在溶剂提取中十分重要;水相的pH随药物的理化性质的不同而异,但生物样品一般多在碱性下提取;这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质,而生物样品中的内源性物质多是酸性的,一般不含脂溶性碱性物质,所以在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来;曾有人将空白血清分别与pH2、pH7、及PH13的缓冲液混后用乙醚提取,提取液用RP-HPLCUV-220nm检测测定色谱图时图,发现在碱性pH13下提取液的杂质峰最少,而在中性及酸性下杂质峰显着多而强;当一些碱性药物在碱性pH不稳定时,则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取;而中性药物则在pH7附近提取愚然它可在任一pH被提取;提取时于水相体液样品中加入有机溶剂后,一般只提取一次;个别情况下如杂质不易除去,则须将第二次提取分离出的含药有机相,再用一定pH的水溶液反提取back extraction,然后再从水相将药物提取到有机相;液-液提取法的优点在于它的选择性,这是依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离；而且在使用非专属性的光谱法分析时,这是一个很大的优点;例如,如果一个亲脂性药物的代谢程度很大,它的代谢物与母体化合物具有同样的发色团,这些代谢物将极大地干扰测试;但如果采用一亲脂性溶剂进行提取,该药物能被选择性地提取,而将相对极性大的代谢物留在生物体液中;如果是色谱法,则可利用亲水性溶剂提取药物和代谢物,从而达到分离并共同测定的目的;但是,液-液提取法并不是适用于所有化合物;例如,极性大的药物通常不能用该法提取,但使用离子对试剂,ion pair reagent的离子对提取法impair extraction method,能够将液-液提取法的应用扩展到这类药物中;液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生;乳化作用能引起药物的损失,从而导致较低的回收率;,通常采用较大体积的提取用溶剂或温和的混合方法能克服乳化现象;如果采用相对于样品体积较大体积的溶剂进行提取,在后续步骤中,需将被测组分浓集;２.液-固提取法liquid-solid extration,LES液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法;也可以认为是规模缩小的柱色谱法;这种方法是应用液相色谱法原理处理样品;将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱,以溶剂淋洗后,将生物样品通过,使其药物或杂质保留在担体上,用适当溶剂洗去杂质,再用适当溶剂将药物洗脱下来;与LLE相比较,LES具有如下优点：LES较少引入杂质；消除了LIE的主要缺陷――乳化现象；提取效率高；可用少量生物样品进行分析如50~100ul的血浆样品；柱为可弃型,废弃物易从实验室移走；再最后洗脱中多采用以水为主的溶剂系统,大大增加了安全型；最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作,尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物;常用于填充柱的担体大致分为两类：第一类为亲水性的硅藻土等,它可以捕集全部样品,即样品全部吸附在担体颗粒表面,形成一薄层,然后采用一种与水不相混溶的有机溶剂倾入柱中,即可分离药物;第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ18化学键硅胶等,它们可从样品中吸附亲脂性药物,然后用有机溶剂分离药物;如填充离子交换树脂,可用于高极性、能电离药物的分离;在过去的十多年中,HPLC法色谱柱填充物的种类与数目迅速扩大,这给生物样品的液－固提取前处理法的发展带来了契机,各生产厂家制备出各种微型柱已在广泛地用作固体提取剂;其中有的供手工操作,也有供自动化设备的;１液－固提取法的手工操作法：从市场上可得到含不同吸附剂的微型柱;如由美国Analytichem International公司生产的 Bond Elut和由美国 Waters公司生产的 Sep-pak微型柱等,目前应用最广泛;将样品溶解在适当的溶剂中,加到微型柱上端,在下端通过负压使溶剂流动,商品生产者已生产出“真空集合管”“自动离心式样品萃取器”等,能同时分析操作8～10个微型柱;也可以通过在微型柱的上端利用注射器达到正压或用离心的方法使溶剂流动;洗脱出的分析样品在每一微型柱的正下方用试管收集;微型柱使用的一般步骤：１：用有机溶剂如甲醇,预先湿润微型柱,使增加填料与待测物相互作用的表面积,并可除去可能干扰分析的填料残留物;２：用色谱纯的水或合适的溶剂冲洗,除去过多的甲醇,并为样品提供表面积;３：进样,通过微型柱废液弃去;４：用水或合适溶剂洗柱,选择性地除去将会干扰后面色谱分析的内源性杂质步骤用合适的溶剂洗脱样品,收集,洗脱液用于后面的分析测定或进一步研究;Bond Elut微型柱采用各种极性、非极性硅胶键合填料,Sep－pak系列有C18硅胶、硅酸镁、氧化铝等四种填料;２自动化液固提取法：1983年出现了半自动样品制备系统advanced automated sample processer,AASP,高级自动化样品处理机,Varian公司,使液－固提取法更加简便、快速;这种半自动样品制备系统能使被分析物从固定相洗脱;其制备方法包括：样品经过10个固定填充微柱的离线萃取后,填充微柱被转移到自动进样器作为预柱,其流动相可将被分析物洗脱至分析柱;此法分析物损失小且分析快速;但样品的制备和分析仍然是两个分开的过程;AASP经过两条途径进行了进一步的自动化：一种是采用机器手,另一种是采用带有探头的自动进样器;机器手主要使人工的样品必理过程自动化;因为AASP的填充微柱必须被人工转移到也谱系统,故此法仍是离钱分析;第二种方法是自动进样器与AASＰ阀门的清洗接头处连接,从而实现了被分析物被自动洗脱到分析柱前、固相活化样品添加和填充微柱清洗的在线联用;3.被测组分的浓集样品在提取过程中,虽然被测组分得到了纯化,但因微量的组分分布在较大体积数毫升的提取溶剂中,提取液往往还不能直接进行分析;一些分析方法如GC法和HPLC法等都受到进样量的限制,若将提取液直接注入仪器,被测组分量可能达不到检测灵敏度,因此,常需要使组分浓集后再进行测定;浓集的方法主要有两种：一种方法是在末次提取时加入的提取液尽量少,使被测组分提取到小体积溶剂中,然后直接吸出适量供测定;另一种方法是挥去溶剂时应避免直接加热,防止被测组分破坏或挥失;挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物,可采用减压法挥去溶剂;溶剂蒸发所用的试管,底部应为尖锥型,这样可使最后数毫升溶剂集中在管尖,便于量取;近年来,许多学者在研究工作中利用了柱切换技术,生物样品不用溶剂而直接进行分析;这时HPLC仪用来进行样品的制备前处理和分析,其色谱系统由一个预柱和一个分析柱组成;采用柱切换技术,在样品进入分析柱进行分离分析之前,将样品在预柱土进行痕量富集;样品进入预柱,预柱保留被测组分,而将杂质冲入废池,进一步冲洗预柱使样品更洁净,被测组分被反冲出预柱进入分析柱,用ＵＶ法、荧光法或电化学法进行最终定量;整个过程是自动化进行的,从开始进样直到数据、报告都由微处理器控制这是一种连接柱的应用技术;即将液－固提取微型柱作为预柱与HPLC仪连接,增加一个泵,先将样品流经预柱,使起到纯化与富集作用,再经分析柱,能提高分析的灵敏度;采用此系列,预柱可被多次利用如每次100ul血浆可注射150次四化学衍生化分离前将药物进行化学衍生化的目的是：１使药物变成具有能被分离的性质；２提高检测灵敏度；３增强药物的稳定性；４提高对光学异构体分离的能力等;药物分子中含有活泼Ｈ者均可被化学衍生化,如含有－COOH、－OH、NH２、－NH－、－SH等官能团的药物都可被衍生化;化学衍生化对GC和HPLC尤为重要;１.ＧＣ中化学衍生化法：药物的化学衍生化前处理对GC十分必要,衍生化可使药物分子中的极性基团,如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物,从而使ＧＣ的温度不必很高即可适合GC 的分析要求;主要的衍生化反应有烷基化alkylations、酰化acrylations、硅烷化silylations等;其中已硅烷化用得最广泛; 常用的烷基化试剂有碘甲烷CH1、叠氮甲烷CHN2、氢氧化三甲基苯胺TMAH等；常用得酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷TMCS、双－三甲基硅烷乙酰胺BSA、双－三甲基硅烷三氟乙酰胺BSTFA、三甲基硅烷咪唑IMTS等;具有光学异构体的药物,由于R-与S ＋构型不同,使之具有不同的药效和药动学特性,因此,异构体的分离也是十分重要的;分离光学异构体的方法之一,就是采用不对称试剂,使其生成非对映异构体衍生物,然后用GC法或HPLC法进行分析测定;常用的称试剂有：Ｓ－Ｎ－三氟乙酰脯胺酰氯、Ｓ－Ｎ－五氟乙酰脯胺酰氯等;２.ＨＰＬＣ中化学衍生化法当采用HPLC法时,其衍生化的目的是为了提高药物的检测灵敏度;一些在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的药物,可以使其与衍生成对可见－紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物;化学衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法;由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应,故与药物具有相同官能团的杂质也会同样生成衍生,这样就有可能妨碍药物的检测;同时,如果杂质含量多时,药物与衍生化试剂的反应率降低,因此,应尽可能将药物进行精制后再衍生化;柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的,所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物,从而提高了选择性;ＨＰＬＣ常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等;在测定生物样品中药物及其代谢物时,样品的前处理是十分重要的;除了少数情况,将体液经简单处理后进行直接测定外,一般要在测定之前进行样品的前处理,即进行分离、纯化、浓集,必要时还需对待测组分进行化学衍生化,从而为测定创造良好的条件;生物样品进行前处理的目的在于：①药物进入体内后,经吸收、分布、代谢,然后排出体外;在体液、组织和排泄物中除了游离型原型药物之外,还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质,如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙gl uronides、硫酸酯sulphates缀合物等多种形式存在,需要分离后测定药物及代谢物；②生物样品的介质组成比较复杂;如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物,也含有Na＋、K＋、X-等无机化合物;其中影响最大的是蛋白质,若用HPLC法测定药物浓度时,蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞,严重影响分离效果;因此,为了保护仪器,提高测定的灵敏度,必须进行除蛋白等前处理;常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织,但实际上最常用的是比较容易得到的血液血浆、血清、金血、尿液、唾液;在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等;下面仅介绍常用的血样、尿样及唾液;一血样血浆plasma和血清serum是最常用的生物样品;测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度,而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度;一般认为,当药物在体内达到稳定状态时,血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关,即血浆中的药物浓度反映了药物在体内靶器官的状况,因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标;供测定的血样应能代表整个血药浓度,因而应待药物在血液中分布均匀后取样;动物实验时,可直接从动脉或心脏取血;对于病人,通常采取静脉血,有时根据血药浓度和分析方法灵敏度,也可用毛细管采血;由采集的血液制取血浆或血清;血浆的制备将采取的血液置含有抗凝剂如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等的试管中,混合后,以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离,分取上清液即为血浆;血清的制备将采取的血样在室温下至少放置30min到1h,待凝结出血饼后,用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼,然后以2000～3000rpm离心分离5～10min,分取上清液．即为血清;血浆比血清分离快,而且制取的量多,其量约为全血的一半;但由于所用抗凝剂的种类不同,用血浆测定药物浓度有时不一致；血清的获取量小,但血清成分更接近于组织液的化学成分,测定血清中有关物质的含量,比全血更能反映机体的具体情况；同时,药物与纤维蛋白几乎不结合,因此,血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的;基于上述原因,现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度;对大多数药物来说,血浆浓度与红细胞中的浓度成正比,所以测定全血也不能提供更多的数据,而全血的净化较血浆和血清更为麻烦,尤其是溶血后,血色素会给测定带来干扰;但在个别情况下也有采用全血测定药物浓度的;例如氯噻酮可与红细胞结合,其动力学行为与在血浆中不同,在血细胞的药物浓度比血浆药物浓度大50～100倍；又如一些三环降压药物,对个别患者来说,在血浆和红细胞的分配比率不是一个常数,因此宜采用全血进行测定;全血Whole blood也应加入抗凝剂混合,防止凝血后影响测定;血样的采取量受到一定限制,特别是间隔比较短的多次取样,患者不易配合;过去一般取1～2ml;随着高灵敏度测定方法的建立,取量可减少到1ml以下;采取静脉血时,目前通行的方法是用注射器直接从静脉抽取,然后置试管中：采取毛细管取血时,应用毛细管或特殊的微量采血管采取;采取血样时,应由从事医疗工作的医生、护士或者临床检查技师实施,药剂师等不能进行采血工作;血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异;例如：进行药物动力学参数的测定时,需给出药物在体内的药物浓度．时间曲线;应根据动力学曲线模型〈单室还是双室、给药方式来确定取样间隔和次数,主要应在曲线首尾及峰值附近或浓度变化较大处取祥;采样次数示意图见如进行治疗药物浓度监测therapeutic drug monitoring,TDM时,则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义;但每种药物的半衰期不同,因此达到稳态的时间也不间,取样时间也随之不同;药物进入体内后,大多数很快与血浆中的蛋白质白蛋白、球蛋白结合成结合型,并与未结合的游离型药物处于平衡状态而存在;结合型药物bound型不能通过血管壁,而游离型药物free型能够到达药物作用部位,因此可以说药物疗效与游离型药物浓度有着比较密切的关系,当然最理想的是测定游离型药物;由于测定游离型药物必须经过“超速离心”或“超滤法”等复杂的分离操作,又因药物的蛋白结合率没有很大的个体差异,通常血药总浓度结合型与游离的总和可以有效表示游离药物的浓度,因此,大多数的检验室不测定游离型药物,而是测定药物的总浓度;但某些疾病可改变药物与血浆蛋白的结合率,如肝硬化病人奎尼丁的游离型药物分数几乎增加三倍；肾病时,苯妥英、水杨酸、安妥明等的血浆蛋白结合卒明显下降;有些药物血浆蛋白结合率存在着很大的个体差异,如奎尼丁的血浆蛋白结合率的范围为50％～90％,不同个体问游离药物浓度差达10倍;也就是说在肝硬化、肾功能不全、肾病变、低营养等状态下,血中白蛋白浓度显着减少,药物的蛋白结合率下降,游离型药物浓度上升,此时应测定游离型药物浓度;采取血样后,应及时分离血浆或血清,并最好立即进行分析;如不能立即测定时,应妥善储存;血浆或血清样品不经蒸发、浓缩,必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存;短期保存时置冰箱4℃中,长期保存时要在冷冻橱库－20℃中冷冻保存;要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存;若不预先分离,血凝后冰冻保存,则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化;二唾液唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的,平时所说的唾液就是指此混合液;一般成人每天分泌1～,但个体差异大,即使是同－个人每日之内、每日之间也有变动；各腺体分泌的唾液组成也会有很大差别;对口腔粘膜给予机械的或化学的剌激时,会影响各唾液腺。
生物样品前处理技术及其应用
生物样品前处理技术及其应用生物样品前处理技术是生物医学研究中不可避免的一部分，同时也是保证实验结果准确性的关键。
因此，研究生物样品前处理技术及其应用对于生物医学研究具有非常重要的意义。
一、生物样品前处理技术的定义生物样品前处理技术是指在功能分析前对生物样品进行分离、富集、净化、转化、分解、修饰等处理操作的方法。
它对于提高样品的分析精度和敏感度、减少干扰物的影响、清除样品中的杂质和提高分析效率具有非常重要的作用。
二、生物样品前处理技术的类型（一）样品分离技术样品分离技术是将混合的样品物质按特定的属性进行分离的一种技术。
常见的样品分离技术包括离心分离、过滤分离、电泳分离、毛细管电泳等。
其中最为常见的是离心分离和过滤分离。
（二）样品富集技术样品富集技术是将样品中需要分析的目标物质从大量的杂质和干扰物中富集出来的一种技术。
常见的样品富集技术包括固相萃取、液相萃取、直接萃取等。
其中固相萃取技术是最常用的样品富集技术之一。
（三）样品净化技术样品净化技术是将样品中不需要分析的组分或杂质去除的一种技术。
常见的样品净化技术包括超滤、离子交换、凝胶过滤等。
其中超滤技术被广泛应用于蛋白质和核酸等生物样品的净化和分离中。
（四）样品转化技术样品转化技术是将样品进行化学变化以实现对目标物质的分析的一种技术。
常见的样品转化技术包括水解、酶促反应、化学修饰等。
其中，水解技术常用于生物高分子的降解和分析。
三、生物样品前处理技术的应用（一）样品前处理技术在蛋白质质谱分析中的应用蛋白质质谱分析是一种非常重要的生物医学研究方法，但受到样品制备的影响而产生误差。
因此，样品前处理技术在蛋白质质谱分析中起到了非常重要的作用。
常用的技术包括蛋白质SOAP清洗、胶拍/台拍，PTM富集，等。
（二）样品前处理技术在DNA测序中的应用DNA测序是基因工程和分子生物学研究的重要代表。
在进行DNA测序前，通常需要对DNA样品进行前处理，以去除杂质和细胞碎片等非必要成分。
生物样品前处理
生物样品前处理第四节生物样品分析的前处理技术一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。
生物样品进行前处理的目的在于：1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。
在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（glucuronides）、硫酸酯（sulphates）缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物；2．生物样品的介质组成比较复杂。
如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na ＋、K＋、X-等无机化合物］。
其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。
因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。
一、常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、金血）、尿液、唾液。
在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。
（一）血样血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。
血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。
供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。
由采集的血液制取血浆或血清。
血浆的制备将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中，混合后，以2500～3000rpm 离心5min使与血细胞分离，分取上清液即为血浆。
血清的制备将采取的血样在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后以2000～3000rpm离心分离5～10min，分取上清液．即为血清。
血浆比血清分离快，而且制取的量多，其量约为全血的一半。
生物样品的前处理质量控制
生物样品的前处理质量控制生物样品作为一种重要的实验物质，其前处理质量控制是影响实验结果准确性和可重复性的主要因素之一。
在实验前，对生物样品的前处理过程进行质量控制可以有效地保证实验结果的可信度和稳定性。
本文将从样品的选取、提取、纯化、保存等方面，探讨生物样品前处理质量控制的方法和注意事项。
一、样品的选取在进行生物样品前处理时，首先需要对样品进行选择。
合适的样品选择可以有效减少实验误差和提高实验数据的可靠性。
在选择样品时，需要考虑以下几点：1. 样品的来源：样品的来源应该是可靠的，选取的样品需要与实验目的相符。
2. 样品的数量：样品的数量应当根据实验需要进行合理选择，过少的样品可能会导致数据的可靠性下降，过多的样品会增加实验成本和实验时间。
3. 样品的质量：样品的质量是影响实验结果准确性的重要因素。
为了确保样品的质量，需要对样品进行质量检测和评价。
例如，对于蛋白质样品，需要检测样品的纯度、完整性等指标。
二、样品的提取和纯化样品的提取和纯化过程是影响实验结果的重要环节，因为这个过程可能导致样品的损失、杂质的混入以及样品的分子结构改变等。
在这个过程中需要进行如下的质量控制：1. 选择最适合的提取和纯化方法：不同的生物样品需要不同的提取和纯化方法，为了确保提取和纯化过程的准确性和清洁度，需要选择最适合的方法和试剂组合。
2. 加入内部标准物质：内部标准物质可以在样品中加入，用于消除实验操作中的误差和扰动。
内标物质选择要谨慎，需要确保内标不会与样品成分相互干扰和交叉反应。
3. 质量检测：在样品提取和纯化后需要进行质量检测，如电泳、质谱和吸收光谱等。
这些质量检测可以判断样品是否完整、纯度是否够、杂质是否少等指标。
三、样品的储存生物样品的储存也是影响实验结果的重要因素之一。
在样品储存过程中，可能会因为存放条件和操作不当，导致样品的分子结构改变、氧化、降解、失活等问题。
为了确保样品的质量，需要进行如下的质量控制：1. 选择合适的样品储存条件：不同的样品需要不同的储存条件。
生物样本前处理技术
【讨论】生物样本前处理技术样本前处理技术在分析方法中占有极其重要的地位，很多分析问题都可以通过样本前处理解决，本文将对样本前处理过程中遇到的问题和样本前处理方法进行综述，以期形成一个系统。
本文将分为1.样本分类及采集2.初步处理3.游离药物分离4.萃取技术5.萃取后过程五个部分进行分别阐述。
其中有不少为个人观点，希望各位战友能不吝指正（纠正错字，纠正观点，进行讨论都欢迎），希望和园内战友共同学习。
-------------------------------------------------------------------------------- 楼主快点介绍吧。
-------------------------------------------------------------------------------- 1.1 生物样本分类生物样本多种多样，有血浆、血清、全血、淋巴、唾液、各种组织、毛发、尿液、胆汁、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便以及呼出的气体。
（以下文字主要摘自《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年）生物样品可大致分为①均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液、乳汁和性腺分泌液等体液；②非均匀样品：心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、生殖器官、脑、体脂、胸腺肾上腺和骨骼肌等11种器官、组织。
Ruth Endacott[1]总结了临床样本采集时需要注意的问题以使采样够用和适用。
[1]:Endacott R, Botti M. Clinical research 3: sample selection. Intensive Crit Care Nurs. 2005 Feb;21(1):51-5.1.2 生物样品采集1.2.1 血样1.2.1.1 组成血样包括血浆、血清和全血，其中最常用的是血浆。
一般认为，药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的，即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况，而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。
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LLE方法操作实例
操作实例
萃取剂
LLE方法操作实例
待测药物：氯雷他定
内标：地西泮
LLE方法总结
优点
➢选择性高，可除去大部分杂质 ➢对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩 ➢样品较干净，对仪器污染小 ➢不同PH体系中与不同的萃取剂组合，可控制回收率，并降 低基质效应
缺点
➢操作繁琐，不能自动化 ➢易乳化 ➢一般提取回收率较低 ➢不适用于极性大或者易挥发的化合物的提取 ➢由于需要挥发有机溶剂，对于热不稳定的化合物也不太适合， 容器吸附的化合物也有一定的困难
生物样品的储存
一、冷藏或冷冻
➢采样后除了立即分析外，为防止药物发生变化，应： 短期保存，可4℃冷藏 长期保存，可-20℃冷冻，不要反复冻融（大部分药物） -80℃，阿莫西林等抗生素
二、有时，还应考虑加入稳定剂
➢酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受 血浆酯酶作用而发生水解，而应在采样后立即加入酶抑制剂 如氟化钠。 ➢抗氧化剂：一些易氧化的物质，可加入VC或其它氧化剂。 如血浆中的儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量的VC， 则能保存10周。
常用中性盐种类
•饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐
操作实例
•血清和饱和硫酸铵的比例为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min， 即可除去90%以上蛋白质
生物样品常用的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取技术基本原理和方法
基本原理
➢采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、 纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近 似地看作一种简单的色谱过程
基本方法
➢较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物 质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被 测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的 ➢也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出
吸附型萃取
➢采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂
固相萃取和HPLC相比的特点
➢ SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相 和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多 相似之处。
➢ 但是SPE柱的填料粒径（>40µm）要比HPLC填料 （3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效 比HPLC色谱柱低得多。
生物样品的储存和预处理 (添加酶抑制剂)
体内胆碱酯酶的 作用下缓慢代谢
盐酸班布特罗（前药）
阻断水解 特布他林（代谢产物）
毒扁豆碱 (胆碱酯酶抑制剂）
生物样品的储存和预处理(避光）
生物样品的储存和预处理 (PH值和温度）
生物样品预处理目的
1
2
3
➢将药物从缀 合物（尿）或 结合物中释放 出来，以测定 药物浓度
缺点
➢只适用于样品中浓度较高的药物测定； ➢样品处理后仍然存在很多干扰物质，对结果产生干扰； ➢残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器
加入强酸
原理
➢当PH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸， 可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。
常用有机溶剂种类
•10%三氯醋酸， 10%高氯酸等
经验总结
➢血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心，就可除去蛋白质 ➢在酸性条件下分解的药物不宜本法除蛋白
Oasis HLB柱（聚合物基质）
Oasis HLB柱（聚合物基质）
➢亲水亲脂柱的优点
•亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二 乙烯基苯）,对极性化合物和非极性化合物均 有较好的保留，具有亲水亲脂平衡的特性 •具有水可润湿性，填料经活化后，即使柱床 干涸，吸附剂对目标物的保留也不会发生变化 •有机聚合物而非硅胶，在pH 0-14 的范围内 表现稳定 •有机聚合物基质的吸附剂，不存在次级相互 作用，用于碱性化合物能够得到满意的结果
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
平衡
上样
淋洗
洗脱
基质 杂质 目标化合物
常见的固相萃取柱
➢普通C18固相萃取 •固相萃取材料耐受PH范围窄（2-7.5） •硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基，对碱性化合 物的保留较强，用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物，回收率 通常较低 •对极性化合物保留差
➢HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer) •PH1-14范围内稳定 •无裸露的硅醇羟基 •亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力，覆盖了非极性、 弱极性、极性化合物
Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
➢将微量药物 从复杂介质中 纯化、富集起 来
➢防止分析仪 器的污染，提 高测定灵敏度 和选择性
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
沉淀蛋白
通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分的 提纯和纯化
奥氮平
有机溶剂沉淀法
经验总结
➢血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:1~3，就可以将90%以上的蛋白质 除去，采用低温低速3500r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。
优点
➢操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用的，特别在 LC-MS方法中 ➢几乎使用于所有小分子化合物，无论其极性大小 ➢化合物回收率接近100%，几乎所有小分子化合物都被提取，尤其适用 于代谢产物鉴定
基质效应及其影响
基质效应（martix effect）：
➢定义：样品测试过程中，由于待测物以外的的其它 物质存在，直接或间接影响待测物相应的现象 ➢如测定血液中的红霉素浓度为例，除了红霉素之外 的蛋白、磷脂、及其它内源性物质为基质 ➢共流成分会改变待测化合物的离子化效率，引起对 待测化合物监测信号的抑制或提高
生物样品种类
均匀生物样品
血液（全血、血浆、血清） 尿液、唾液、胆汁、乳汁、 脑脊液、淋巴液、汗液等
非均匀生物样品
心、肝、肾、脾、肺、脑、 胃、肠、子宫、肌肉、皮 肤等组织、器官
全血
全血
➢全血包括液体成分的血浆和分 散悬浮于其中的血细胞 ➢全血不易保存，且血细胞中含 有很多干扰物质，影响测定， 故较少用全血测定药物浓度。 ➢仅用于血浆药物浓度太低或者 血浆药物浓度波动较大，且难 以控制的药物，如环抱霉素A。
有机溶剂 沉淀法
加入中 性盐
有机酸
加入锌盐 或铜盐沉
淀剂
酶解法
有机溶剂沉淀法
原理
➢加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化
常用有机溶剂种类
•乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等
操作实例
50μl 血浆+150μl甲醇 取上清液进样分析
涡旋1min
3500rpm离心10min
有机溶剂沉淀法实例
生物样品前处理
制作人：叶超
目录
1 生物样品种类 2 生物样品储存 3 生物样品预处理 4 克服基质效应方法
Distribution Metabolism
Absorption Excretion
生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、 获得药代参数的重要手段之一
体内生物样品分析特点
体内生物样 品分析特点
固相萃取 (SPE)
液-液提取方法（LLE）
原理 ➢药物在体内吸收，需经跨膜转运，所 以多数药物具有一定脂溶性 ➢生物样品中大多数内源性杂质是强极 性的水溶性物质
可以根据药物分子与基质之间的极性差异，使用适 当的有机溶剂提取药物，可一次性除去大部分杂质
LLE方法需是考虑的问题
一、溶剂的选择原则
常用液-液萃取溶剂
固相萃取分离类型
反相固相萃取
➢硅胶上键合C18，C8，C2，苯基，腈基 ➢流动相极性大于固定相，适合分离中小极性的化合物的萃取 ➢疏水性相互作用
正相固相萃取
➢无键合硅胶、或硅胶上键合氰基、NH2、二醇基 ➢流动相极性小于固定相，适合于极性的化合物的萃取 ➢亲水性相互作用
离子交换萃取
➢硅胶基质的离子交换官能团，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基 ➢带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。