蛋白质分离纯化和表征

(四) 沉降分析法测定分子量
(超速离心机的使用) 在强大的离心力作用时，蛋白质分子就会沉降。 沉降的速度：1)与蛋白质的分子大小和密度有关； 2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度 和粘度有关。
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理 1、离心力(Fc) 离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω 2X与颗粒质量m的乘积，即： FC＝mω 2X 其中ω 是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
2B 7-4000万
P-10 5000-17000
4B 6-2000万
P-150 50000-150000
6B 1-400万
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose)
Sepharose
pharmacia公司(瑞典)
凝胶珠是多孔的网状结构，凝胶的交联度或孔度决定 了凝胶的分级范围。
举
例
实验中只要 测得几种标准蛋 白质的Ve，并以 它们的分子量对 数(logM)对Ve作 图得一直线，用 待测样品的Ve即 可从图中确定它 的分子量。
五、蛋白质的分离纯化方法
(一)根据分子大小不同的分离方法
1、透析和超过滤
透析和超过滤就是利用蛋白质分子不能通过半透膜 的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐，单糖、 水等分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他合成 材料。
透析： 是将待提 纯的蛋白质溶 液装在半透膜 的透析袋里放 在缓冲液中进 行，使透析袋 内无机盐等小 分子物质降低 到最小值。
分析性超速离心结构及用途
用途：1．测定生物大分子的相对分子量 2、生物大分子的纯度估计
3、分析生物大分子中的构象变化
超速离心机工作原理
密度梯度离心法超速离心操作方法
不同的离心转子
(五)凝胶过滤法测定分子量
(凝胶层析、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析)
原
理
分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质， 则不能用此方法测定分子量。
离心分离方法
1、差速离心法：(分级超速离心法) 不同的粒子在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不 断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不 同的粒子分部沉淀。 2、速率区带离心法： 在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘 油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心 管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。 3、等密度离心法： (密度梯度离心法) 是在离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺 在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由 于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同 时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。常用的梯度液是 CsCl。
4、生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣 酸(单宁酸)，苦味酸(2，4，6—三硝基酚)，钨酸和碘化钾 等。 某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水扬酸和硝酸等。当 溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物 碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。 5、加热变性沉淀法： 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类能 促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固 最完全和最迅速。加热变性可能是由于热变性使蛋白质天 然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层而致。
2、相对离心力(RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转 轴中心的距离不同，离心力随之变化，因此常用 “相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要 RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得 相同的结果。 相对离心力（RCF）和每分钟的转数（rpm） 之间相互转换的计算方法。 RCF=1.119 * 10-5 * r * (rpm）2 式中r为离心转子的半径距离， rpm为转子每 分钟的转数。
提取组织或细胞内的蛋白质
1)如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分， 如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆 等，可用差速离心方法将它们分开。
2)如果所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合 的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚， 然后用适当的介质提取。
2、粗分级：
一般采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶 剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处 理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶 液。 3、细分级： 进一步提纯，一般使用层析法(包括凝胶过滤， 离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等)。必 要时还可选择电泳法(包括区带电泳、等电聚焦 等)作为最后的提纯步骤。
凝胶过滤的介质（填料）
1、葡聚糖凝胶：(Sephadex)
Sephadex G-25 1000-5000
Pharmacia公司(瑞典)
G-75 3000—80000
G-100 4000—150000
Bio-Rad公司(美国)
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel)
Bio-gel P-4 500-4000
引起蛋白质沉淀Biblioteka Baidu原因
1、加入脱水剂以除去它的水化层。 2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带 相同净电荷。 3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大 的质点而沉淀。
沉淀蛋白质的几种方法
1、盐析法： 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸铵、硫酸 钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐 析沉淀一般不引起蛋白质变性。 2、有机溶剂沉淀法： 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇， 乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介 电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗 粒容易凝集而沉淀。 3、重金属盐沉淀法： 当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷， 容易与重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+，Ag+等)结成不 溶性盐而沉淀。
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。 缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他 杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (一)蛋白质的胶体性质
三种溶液的区分：(以分散相质点的直径来衡量) 1、真溶液：分散相质点小于1nm。 2、悬浊液：分散相质点大于100nm。 3、胶体溶液：分散相质点介于1-100nm。 蛋白质溶液属于胶体系统。
蛋白质在胶体系统中保持稳定所 具备的三个条件
1、分散相的质点大小1-100nm，这样大小的质点在动力学上是 稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能 在介质中作不断的布朗运动；
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
1、什么叫扩散？ 如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数 它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量 3、影响扩散系数的因素 1)与蛋白质的分子大小和形状有关，扩散 系数随分子量的增加而降低。 2)与溶剂的粘度有关，扩散系数随溶剂的 粘度增加而降低。 扩散系数一般不单独用来决定分子量，但 与沉降系数结合可精确测量蛋白质分子量。
第七章：蛋白质的分离、纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子由氨基酸组成，因此蛋白质的化 学和物理化学性质有些与氨基酸相同，如： 1、游离的末端α -氨基和α -羧基； 2、侧链上的各种功能基团的化学反应； 3、分子的两性电解质性质，能和酸或碱发生作用。
蛋白质可解离基团可以用滴定法滴定
注意：1、某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋在分 子内部或参与氢键形成而不能被滴定。 2、如果蛋白质变性后可解离基团全部可被滴定。
什么叫等电点？
对某一种蛋白质来说，在某一pH值，它所带的正电荷与 负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH值称为蛋白质的 等电点。
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性 氨基酸的数量比例有关。
二、蛋白质的大小与形状 (蛋白质分子量测定)
(一)根据化学组成测定分子量：
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假 设蛋白质分子中只含有一个被测的元素原子，则可以由此计 算出蛋白质的最低分子量。 例如: 肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量可按下式算出： 最低分子量 = 铁的原子数 55.8 铁的百分含量 X 100 = 0.335 X 100 = 16700 有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，也可以用 这一氨基酸含量的分析结果，计算蛋白质的最低分子量。
(二)利用渗透压测定分子量：
当用一种半透膜将蛋白 质溶液与纯水隔开时，只有 水分子能自由地通过半透膜 进入蛋白质溶液,而蛋白质 分子却不能透过它进入纯水 中。这种溶剂分子向溶液单 方向的扩散现象称为渗透。 由于渗透的结果，溶液内的 体积增加，液面升高，直至 达到一定的静水压力时维持 平衡。这时的静水压力就是 溶液在平衡浓度时的渗透压。
动物组织和细胞：用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎； 植物组织和细胞：由于细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等 组成，用石英砂和适当的提取液一起研磨 的方法破碎或用纤维素酶处理； 细菌细胞的破碎：细菌细胞壁由共价键连接而成的称为肽聚 糖的囊状分子组成，非常坚韧。常用超声 波振荡、与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处 理等。
四、蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质提纯的总目标 1、增加纯度或比活性(生物活性)。 2、设法除去变性的和不要的蛋白质。 3、希望所得蛋白质的产量达到最高值(得率)。
分离纯化蛋白质的一般程序可分三步
1、前处理： 破碎组织和细胞，提取组织或细胞内的蛋白质，并保 持天然状态，不丢失生物活性。
破碎组织和细胞
(六) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶板状电泳
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳
SDS应用原理
蛋白质颗粒在PAGE电泳时，它的迁移率取决于它所带 的净电荷以及分子大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝 胶系统中加入SDS和少量的巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳 迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带的电荷和分子 形状无关。 第一，由于SDS是阴离子，使多肽链复盖上负电荷，该 电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差别，结果，所有的SDS-蛋白质复 合物电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动。 第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合 物在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不 同蛋白质的SDS复合物的直径都是一样的约为1.8nm，而长 轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。
举 例
载脂蛋白A-IV的分离纯化
分 子 量 计 算
用聚丙烯酰胺凝胶法分离纯化蛋白质
(七)蛋白质分子的形状分析
1、X-射线晶体结构分析： 此法测定蛋白质分子的形状或构象最精确， 但只能给出晶体状态的蛋白质立体结构信息。 而不能给出在溶液中的蛋白质形状或构象。 2、摩擦比分析蛋白质形状： 蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可通过实 验测得，通过摩擦系数计算摩擦比。摩擦比越 大，反映蛋白质分子的不对称性越高，可衡量 蛋白质分子形状偏离真正球体的程度。
2、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒 而沉淀；
3、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层， 质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。
(二)、蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如 果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质 就会从溶液中沉淀出来。
结晶蛋白质的制备
一定纯度的蛋白质才能形成结晶，结晶过程 也能使蛋白质纯度进一步提高，重结晶可除去少 量夹杂的蛋白质。一般结晶状蛋白质具有天然活 性。 蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，要 得到适度的过饱和溶液，可借控制温度、加盐盐 析，加有机溶剂或调节pH等方法来达到。接入 晶种常能加速结晶过程。