蛋白质分离纯化和表征
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第七章蛋白质的分离纯化与表征
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
2020/3/1
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
2020/3/1
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。
蛋白质的分离纯化和表征
2.盐溶和盐析
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
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三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
第三章蛋白质分离纯化与表征
超滤
• 超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对 称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大 分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分 子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂 交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理 分离方法。
超滤离心管
切向流超滤器
离心技术
• 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物 样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用， 使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等） 以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速 度取决于颗粒的质量、大小和密度。 • 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自 身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白 质在离心管中被分离成各自的区带。 • 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。
1. 抗体
• 抗体的制备
免疫荧光技术
• 免疫荧光技术是是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏 感性和直观性结合起来的一种方法。其基本原理为： • 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待 检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一 定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助 荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或 抗体。
原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间 的相互作用来分离。配体通常指的是能与另一 个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分 子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配 体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶 结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别 靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器 等。 亲和层析是分离效率最高的分离方法。
高效液相层析（HPLC）
• 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏 度高，分析速度快，重复性好，定量精度高， 应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强 极性、热稳定性差的化合物。 • 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量 小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相 消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向 生物化学和药物分析及制备型倾斜。
4蛋白质的分离纯化和表征
超过滤（ultrafiltration）
滤膜 抽气 离心 滤膜ensity gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
多肽链主链骨架中的若干肽段，通过氢键，形成有规则 的构象，这称为二级结构。
α-螺旋 β-折叠 无规线团
在二级结构的基础上，多肽链间通过氨基酸残基侧链的 相互作用而进行盘旋和折叠，因而产生的特定的三维空间结 构，这称为三级结构，也称为蛋白质的亚基。 各个亚基在低聚蛋白中的空间排布及相互作用，称为蛋 白质的四级结构。
（一）根据分子大小不同的纯化方法
• ◇ 1.透析和超滤 • ◇ 2.密度梯度离心 • ◇ 3.凝胶过滤
1.透析和超滤
透析是利用蛋白质等大分子 不能通过半透膜的性质，使蛋白 质和其它小分子物质如无机盐单 糖等分开。常用的半透膜： 半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒
玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane
3.有机溶剂分级分离
• （1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀
酮、乙酸乙酯等。 • （2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 • （3）有分级分离现象 • （4）要求对有机溶剂低温预冷。
主要有乙醇、丙
4.温度对蛋白质溶解度的影响
• 在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状 蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，
滴加样品
离 心 管
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
第7章蛋白质的分离纯化和表征
第7章蛋白质的分离纯化和表征第七章蛋白质的分离、纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质每个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。
等电点应通过等电点聚焦和其他方法来确定。
第二节蛋白质分子的大小和形状首先，根据化学成分确定最低相对分子质量假设只有一种微量组分，在测量其百分含量后，可以用比例公式计算出最低相对分子质量。
如果测量两种痕量组分的百分比含量，并且通过比例公式计算的最低相对分子质量不同，则可以计算两种最低相对分子质量的近似值的最小公倍数。
实施例:纯酶含有1.65%亮氨酸(MR 131)和2.48%异亮氨酸(MR 131), 以找到最低的相对分子质量。
解决方案:根据Leu 的百分比，最低Mr x1: x1 = (100'131)/1.65 = 7939.4。
最低X2先生:X2 = (100 ' 131)/2.48 = 528是3艮据lie的百分比含量计算的。
由于X1 和X2 数之间的巨大差异，建议该酶包含一个以上的Leu 和l i e 。
为了估计Leu 和lie 的数量，首先计算:X1/X2=7939.4/5282.3 〜1.5 .该酶含有的任何氨基酸的数量应为整数，表明该酶至少含有2个Leu 和3个Ile ,其最小相对分子质量为7939.4 ‘2=15878.8或5282.3 3=15846.9二、渗透压法测定相对分子质量三、沉降分析法测定相对分子质量基本原则:(a)离心力(Fc)当粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力时，离心力“ FC由以下公式定义:f = m a = m w 2ra-粒子旋转加速度，m-沉降粒子的有效质量，w粒子旋转角速度，r- 粒子旋转半径(cm)。
②相对离心力(RCF) 由于各种离心机转子的半径或离心管到转轴中心的距离不同，离心力也不同。
因此，文献中常用相对离心力”或数X g来表示离心力。
只要RCF 值不变，样品在不同的离心机上可以获得相同的结果。
蛋白质化学蛋白质的分离纯化和表征标准版PPT
蛋白质的纯化是基于其结构和功能的研究需求，旨在获得高度纯化且具有生物活性的蛋白质。纯化过程中需考虑蛋白质的酸碱性质，特别是等电点，此时蛋白质溶解度最低，有利于沉淀分离。根据蛋白质的分子大小和形状，可采用渗透压法、沉降分析法、凝胶过滤法及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法测定其分子量，进而指导纯化策略。蛋白质的胶体性质使其在溶液中稳定分散，而通过破坏这一稳定性，如盐析法、有机溶剂沉淀法、重金Байду номын сангаас沉淀法等，可实现蛋白质的沉淀分离。纯化时还应结合结晶分析、溶解度分析和光吸收等手段，综合评估纯化效果。最终，通过一系列分离纯化步骤，获得满足研究需求的纯蛋白质。
第七章蛋白质的分离纯化和表征
第二节 蛋白质的分子大小与形状 （略）
第三节
蛋白质的胶体性质与沉淀、变性
一、蛋白质的胶体性质
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性
蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水
有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面 形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋 白质溶液是相当稳定的亲水胶体。
2、引起蛋白质变性的因素有：
①.物理因素 热（60~100℃）、紫外线、X射线、超声波、 高压、表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌 等；
②.化学因素
化学因素又称为变性剂，包括：酸、碱、有 机溶剂（如乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重 金属盐、三氯醋酸、苦味酸、磷钨酸以及去污剂 等。
3、变性表现及变性机理
pI是蛋白质的一个特征常数。
蛋白质两性解离性质和等电点
Pr
NH3
+
+ +
OHH+
Pr
NH3 COO-
+
+ OH+ H+
Pr
NH2 COO-
COOH
pH< pI
净电荷为正
pH = pI
净电荷=0
pH > pI
净电荷为负
当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负
电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此
去除上述变性剂 可使蛋白质回复 原态而恢复活性 是为复性
并非所有蛋白质 均可顺利复性 恢复原来活性
5、变性的利用和预防
在医疗上，高温高压蒸煮手术器械，紫外线照 射手术室，75％酒精消毒手术部位的皮肤，使病菌、 病毒的蛋白质发生变性，失去致病作用，达到消毒 杀菌，防止伤口被感染的目的。
蛋白质分分离纯化和表征
沉降平衡法
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。
蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
03
根据电荷不同的纯化方法 电泳 ： 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为：
自由界面电
区带电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。
CH2=CH
C=O
NH2
丙烯酰胺
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
抗原和抗体
激素和受体蛋白
3
凝集素和糖蛋白
4
（六） 亲和层析
配体
蛋白质
蛋白质和配体复合物
交联试剂
载体
配体
载体与配体交联体
杂质
杂质
游离配体
测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。
溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。
பைடு நூலகம்
叁
若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。
贰
若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。
离子交换：
亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。
（四）凝胶过滤法测定Mr
凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。
蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:
先测得几种标准蛋白质的 Ve （Ve为洗脱体积） ，并 以其分子量对数对Ve作图得 一直线，再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即可确定分 子量，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出待 测样品的Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
03
根据电荷不同的纯化方法 电泳 ： 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 原则上按电泳的原理来分，可分为：
自由界面电
区带电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。
CH2=CH
C=O
NH2
丙烯酰胺
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
抗原和抗体
激素和受体蛋白
3
凝集素和糖蛋白
4
（六） 亲和层析
配体
蛋白质
蛋白质和配体复合物
交联试剂
载体
配体
载体与配体交联体
杂质
杂质
游离配体
测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。
溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林－酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。
பைடு நூலகம்
叁
若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。
贰
若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。
离子交换：
亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的 。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征.
第七章蛋白质的分离、纯化和表征7.1 本章主要内容1）蛋白质的酸碱性质2）蛋白质分子的大小和形状3）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀4）蛋白质分离纯化方法7.2 教学目的和要求：通过本章学习，使学生掌握蛋白质的物理化学性质，在此基础上对现实生活中的现象给出合理的解释，同时为后续知识的学习打下基础。
7.3 重点难点1.蛋白质分离纯化方法2.蛋白质物理化学性质及应用7.4 教学方法与手段讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。
7.5 授课内容一、蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。
在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。
1.等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）等电点：以兼性离子形式存在的蛋白质的pH 值。
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。
等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。
2.蛋白质的电泳分离3.离子交换层析分离蛋白质二、蛋白质的大小与形状测分子量的方法：1.化学组成法2.凝胶过滤法3.SDS-PAGE法4.沉降分析法5.渗透压法三、胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
1.稳定蛋白质胶体溶液的主要因素（1）蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。
第6章 蛋白质的分离、纯化和表征
蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两 方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相 对稳定的。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质化学蛋白质分离、纯化和表征
第7章 蛋白质的分离、纯化和表征 p290
蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子的大小与形状 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离的α-氨基和α-羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化学性质有些与氨基酸相同。 蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些基团能解离为带电基团，从而使蛋白质带电荷。
1
2
加热变性沉淀
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全最迅速。 加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层。
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五、蛋白质的分离纯化方法
10%
根据分子大小不同的纯化方法
根据电荷不同的纯化方法
利用溶解度差别的纯化方法
利用选择性吸附的纯化方法
蛋白质的分离纯化依据
蛋白质的分离纯化依据
分子大小 吸附 特异亲和力
电荷
其它
溶解度
（一）根据分子大小不同的纯化方法
透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离。 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 凝胶过滤
蛋白质溶液是胶体溶液（如血清、蛋清）
胶体条件： 大小：1-100nm 有水膜：表面有许多极性、亲水基团 (-NH3、-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）。 带相同的电荷（同性相斥）
第7章蛋白质的分离、纯化和表征
独用来确定Mr。
7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量
蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果 蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。
沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分 子形状、溶液的密度和粘度有关。
沉降速率法 沉降平衡法
沉降分析法测定相对分子质量
In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first.
Rf = K1-K2 lg M
Electrophoresis of Protein
In polyacrylamide(聚丙烯酰胺) gel electrophoresis (PAGE) proteins are applied to a porous polyacrylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size.
渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高， 直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的 静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压 （osmotic pressure)。
渗透压是单位体积内溶质质点数的函数，而与 溶质的性质和形状无关。
渗透压法测定相对分子质量
在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的 关系为：
7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量 Gel filtration chromatography 凝胶过滤法的原理
7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量
蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果 蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。
沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分 子形状、溶液的密度和粘度有关。
沉降速率法 沉降平衡法
沉降分析法测定相对分子质量
In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first.
Rf = K1-K2 lg M
Electrophoresis of Protein
In polyacrylamide(聚丙烯酰胺) gel electrophoresis (PAGE) proteins are applied to a porous polyacrylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size.
渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高， 直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的 静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压 （osmotic pressure)。
渗透压是单位体积内溶质质点数的函数，而与 溶质的性质和形状无关。
渗透压法测定相对分子质量
在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的 关系为：
7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量 Gel filtration chromatography 凝胶过滤法的原理
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(二)利用渗透压测定分子量：
当用一种半透膜将蛋白 质溶液与纯水隔开时，只有 水分子能自由地通过半透膜 进入蛋白质溶液,而蛋白质 分子却不能透过它进入纯水 中。这种溶剂分子向溶液单 方向的扩散现象称为渗透。 由于渗透的结果，溶液内的 体积增加，液面升高，直至 达到一定的静水压力时维持 平衡。这时的静水压力就是 溶液在平衡浓度时的渗透压。
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。 缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他 杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
五、蛋白质的分离纯化方法
(一)根据分子大小不同的分离方法
1、透析和超过滤
透析和超过滤就是利用蛋白质分子不能通过半透膜 的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐，单糖、 水等分开。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他合成 材料。
透析： 是将待提 纯的蛋白质溶 液装在半透膜 的透析袋里放 在缓冲液中进 行，使透析袋 内无机盐等小 分子物质降低 到最小值。
第七章：蛋白质的分离、纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子由氨基酸组成，因此蛋白质的化 学和物理化学性质有些与氨基酸相同，如： 1、游离的末端α -氨基和α -羧基； 2、侧链上的各种功能基团的化学反应； 3、分子的两性电解质性质，能和酸或碱发生作用。
蛋白质可解离基团可以用滴定法滴定
注意：1、某些天然蛋白质中有一部分可解离基团由于埋在分 子内部或参与氢键形成而不能被滴定。 2、如果蛋白质变性后可解离基团全部可被滴定。
举 例
载脂蛋白A-IV的分离纯化
分 子 量 计 算
用聚丙烯酰胺凝胶法分离纯化蛋白质
(七)蛋白质分子的形状分析
1、X-射线晶体结构分析： 此法测定蛋白质分子的形状或构象最精确， 但只能给出晶体状态的蛋白质立体结构信息。 而不能给出在溶液中的蛋白质形状或构象。 2、摩擦比分析蛋白质形状： 蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可通过实 验测得，通过摩擦系数计算摩擦比。摩擦比越 大，反映蛋白质分子的不对称性越高，可衡量 蛋白质分子形状偏离真正球体的程度。
四、蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质提纯的总目标 1、增加纯度或比活性(生物活性)。 2、设法除去变性的和不要的蛋白质。 3、希望所得蛋白质的产量达到最高值(得率)。
分离纯化蛋白质的一般程序可分三步
1、前处理： 破碎组织和细胞，提取组织或细胞内的蛋白质，并保 持天然状态，不丢失生物活性。
破碎组织和细胞
4、生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣 酸(单宁酸)，苦味酸(2，4，6—三硝基酚)，钨酸和碘化钾 等。 某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水扬酸和硝酸等。当 溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物 碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。 5、加热变性沉淀法： 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类能 促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固 最完全和最迅速。加热变性可能是由于热变性使蛋白质天 然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层而致。
提取组织或细胞内的蛋白质
1)如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分， 如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆 等，可用差速离心方法将它们分开。
2)如果所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合 的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚， 然后用适当的介质提取。
2、粗分级：
一般采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶 剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处 理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶 液。 3、细分级： 进一步提纯，一般使用层析法(包括凝胶过滤， 离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等)。必 要时还可选择电泳法(包括区带电泳、等电聚焦 等)作为最后的提纯步骤。
凝胶过滤的介质（填料）
1、葡聚糖凝胶：(Sephadex)
Sephadex G-25 1000-5000
Pharmacia公司(瑞典)
G-75 3000—80000
G-100 4000—150000
Bio-Rad公司(美国)
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel)
Bio-gel P-4 500-4000
2、相对离心力(RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转 轴中心的距离不同，离心力随之变化，因此常用 “相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要 RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得 相同的结果。 相对离心力（RCF）和每分钟的转数（rpm） 之间相互转换的计算方法。 RCF=1.119 * 10-5 * r * (rpm）2 式中r为离心转子的半径距离， rpm为转子每 分钟的转数。
(六) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶板状电泳
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳
SDS应用原理
蛋白质颗粒在PAGE电泳时，它的迁移率取决于它所带 的净电荷以及分子大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝 胶系统中加入SDS和少量的巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳 迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带的电荷和分子 形状无关。 第一，由于SDS是阴离子，使多肽链复盖上负电荷，该 电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差别，结果，所有的SDS-蛋白质复 合物电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动。 第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合 物在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不 同蛋白质的SDS复合物的直径都是一样的约为1.8nm，而长 轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。
引起蛋白质沉淀的原因
1、加入脱水剂以除去它的水化层。 2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带 相同净电荷。 3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大 的质点而沉淀。
沉淀蛋白质的几种方法
1、盐析法： 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(硫酸铵、硫酸 钠或氯化钠等)，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐 析沉淀一般不引起蛋白质变性。 2、有机溶剂沉淀法： 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇， 乙醇或丙酮等)，因引起蛋白质脱去水化层以及降低介 电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗 粒容易凝集而沉淀。 3、重金属盐沉淀法： 当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷， 容易与重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+，Ag+等)结成不 溶性盐而沉淀。
结晶蛋白质的制备
一定纯度的蛋白质才能形成结晶，结晶过程 也能使蛋白质纯度进一步提高，重结晶可除去少 量夹杂的蛋白质。一般结晶状蛋白质具有天然活 性。 蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，要 得到适度的过饱和溶液，可借控制温度、加盐盐 析，加有机溶剂或调节pH等方法来达到。接入 晶种常能加速结晶过程。
2B 7-4000万
P-10 5000-17000
4B 6-2000万
P-150 50000-150000
6B 1-400万
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose)
Sepharose
pharmacia公司(瑞典)
凝胶珠是多孔的网状结构，凝胶的交联度或孔度决定 了凝胶的分级范围。
举
例
实验中只要 测得几种标准蛋 白质的Ve，并以 它们的分子量对 数(logM)对Ve作 图得一直线，用 待测样品的Ve即 可从图中确定它 的分子量。
什么叫等电点？
对某一种蛋白质来说，在某一pH值，它所带的正电荷与 负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH值称为蛋白质的 等电点。
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性 氨基酸的数量比例有关。
二、蛋白质的大小与形状 (蛋白质分子量测定)
(一)பைடு நூலகம்据化学组成测定分子量：
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假 设蛋白质分子中只含有一个被测的元素原子，则可以由此计 算出蛋白质的最低分子量。 例如: 肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量可按下式算出： 最低分子量 = 铁的原子数 55.8 铁的百分含量 X 100 = 0.335 X 100 = 16700 有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，也可以用 这一氨基酸含量的分析结果，计算蛋白质的最低分子量。
分析性超速离心结构及用途
用途：1．测定生物大分子的相对分子量 2、生物大分子的纯度估计
3、分析生物大分子中的构象变化
超速离心机工作原理
密度梯度离心法超速离心操作方法
不同的离心转子
(五)凝胶过滤法测定分子量
(凝胶层析、分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析)
原
理
分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质， 则不能用此方法测定分子量。
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (一)蛋白质的胶体性质
三种溶液的区分：(以分散相质点的直径来衡量) 1、真溶液：分散相质点小于1nm。 2、悬浊液：分散相质点大于100nm。 3、胶体溶液：分散相质点介于1-100nm。 蛋白质溶液属于胶体系统。
蛋白质在胶体系统中保持稳定所 具备的三个条件
1、分散相的质点大小1-100nm，这样大小的质点在动力学上是 稳定的，介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能 在介质中作不断的布朗运动；
2、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒 而沉淀；
3、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化层， 质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。
(二)、蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如 果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质 就会从溶液中沉淀出来。
离心分离方法
1、差速离心法：(分级超速离心法) 不同的粒子在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不 断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不 同的粒子分部沉淀。 2、速率区带离心法： 在离心前于离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘 油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心 管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。 3、等密度离心法： (密度梯度离心法) 是在离心前预先配制介质的密度梯度，待分离的样品铺 在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由 于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同 时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。常用的梯度液是 CsCl。