使用制备型高效液相色谱的经验之谈之欧阳光明创编
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱使用方法⒈简介⑴色谱技术概述高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于物质在固定相和流动相之间分配行为的色谱分离技术。
它广泛应用于药物分析、食品检测、环境监测等领域。
⑵仪器设备在进行高效液相色谱分析之前，需要准备好以下仪器设备：●高效液相色谱仪●进样器●色谱柱●柱温箱●检测器●数据处理系统⒉样品制备在进行高效液相色谱分析之前，必须进行样品制备。
样品制备的方法根据具体领域和分析目的的不同而有所差异。
常见的样品制备方法包括：●样品浸提：通过浸提操作从固体样品中提取分析物质，并将其溶解到适当的溶剂中。
●样品过滤：将样品中的不溶物或杂质去除，使样品更纯净。
●样品稀释：根据样品的浓度情况，选择合适的溶剂将样品稀释到适当的浓度范围内。
⒊方法优化在进行高效液相色谱分析之前，应对方法进行优化，以获得更准确、灵敏的分析结果。
方法优化的主要步骤包括：●流动相优化：选择合适的流动相组成，使分析物质在色谱柱中得到良好的分离。
●色谱柱优化：选择合适的色谱柱，以满足分析要求，如色谱柱的选择应考虑分析物质的特性和目标分离效果。
●进样量优化：确定适当的进样量，以保证在检测器中能够获得合适的信号。
⒋实验操作步骤⑴仪器准备●打开高效液相色谱仪和相关仪器设备的电源。
●检查仪器连接情况，确保各仪器之间的连接正常。
●准备好所需的溶剂和试剂，并验证其质量。
⑵色谱条件设置●设置流动相的组成和流速。
●选择适当的柱温。
●配置适当的检测器参数，如波长、灵敏度等。
⑶样品进样●将样品溶液注入到进样器中。
●设置进样器的参数，如进样量、进样模式等。
●冲洗进样器，使其准备好下一次进样。
⑷数据采集与处理●打开数据处理系统，并设置合适的参数，如采集时间、信号积分方式等。
●开始进行数据采集。
⒌结果解释与分析根据采集到的数据，进行结果解释和分析。
根据对样品的分析目的，对结果进行合理解释，并得出相应的结论。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和检测化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药学等领域。
它的高效性和精密度使其成为许多实验室中不可或缺的工具。
下面将介绍高效液相色谱的使用方法，希望能为您的实验工作提供帮助。
首先，准备好实验所需的仪器和试剂。
检查色谱柱、流动相、样品溶液等是否符合要求，确保实验的顺利进行。
接下来，进行仪器的预处理和平衡。
打开色谱仪，设置好检测波长和流速等参数，进行系统的平衡和稳定。
然后，进行样品的处理和制备。
将待测样品溶解于适当的溶剂中，过滤去除杂质，使其达到适合进样的状态。
注意样品处理的过程中要保持样品的纯度和稳定性，避免对实验结果产生影响。
接着，进行进样和分离。
将处理好的样品通过自动进样器引入色谱柱中，流动相将样品分离并通过检测器进行检测。
在此过程中，需要注意流速、温度、压力等参数的控制，以保证色谱分离的准确性和重复性。
最后，进行数据的处理和分析。
根据检测器输出的信号，得到样品的色谱图谱，通过峰面积、保留时间等参数进行定量和定性分析。
同时，对实验结果进行统计学处理，评估实验的准确性和可靠性。
在实验操作的过程中，需要注意以下几点，一是要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性；二是要及时记录实验过程中的关键步骤和参数，以备后续分析和总结；三是要及时清洗和维护色谱仪器，延长仪器的使用寿命和保证实验结果的准确性。
总之，高效液相色谱是一种重要的分析技术，掌握其使用方法对于化学、生物、药学等领域的科研工作者来说至关重要。
希望以上介绍的使用方法能够为您的实验工作提供一些帮助，祝您实验顺利取得理想的结果！。
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程高效液相色谱仪操作技巧任何颗粒物进进高效液相色谱仪后都会在柱子进口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力加添并使色谱峰变形。
因此，要实行各种防备措施，包括操纵步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或削减颗粒物进进高效液相色谱仪中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并进步数据的牢靠性。
在高效液相色谱仪中，颗粒物的紧要来源有三个途径：活动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、被测样品使用针筒式过滤器不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会或多或少的丢失。
丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。
2、活动相无论是高效液相色谱仪HPLC级的水还是在试验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2μm微孔滤膜。
任何一种缓冲液中加进了固体物，必定活动相过滤将。
少量杂质颗粒存在于活动相中必定成为残渣。
解决方法：2.1.活动相制备仅接受HPLC级液体时不需要过滤，反之全部活动相构成在使用前必需过滤。
2.2.在连接储液瓶和泵的输液管的末端进口接受下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很紧要的。
这个过滤器的规格为≥10μm的微孔物质，所以它不能取代活动相过滤步骤，但是它能除往系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的牢靠性。
2.3.推举在HPLC系统中接受一个0.45或0.5μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。
这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如接受一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又便利（几分钟就可更换）。
若接受在线过滤，高效液相色谱仪检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升确定值，例如25%或加添500psi，应当更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。
3、仪器系统部件的磨损物最后，在高效液相色谱仪HPLC系统中颗粒物的另一个紧要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。
高效液相色谱法2篇
高效液相色谱法2篇高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，缩写为HPLC）是一种分离、检测和定量分析化合物的重要技术和方法。
它在药物分析、环境检测、食品安全等领域都得到广泛应用。
本文将分为两篇，分别介绍HPLC的原理以及其在药物分析和食品安全中的应用。
第一篇：HPLC的原理及应用1. HPLC的原理HPLC是一种基于液相的色谱技术，与气相色谱（GC）相对应。
它利用在固定相上的流动相将混合物分离成各个组分，并通过检测器进行检测和定量。
HPLC主要由液相色谱柱、流动相、检测器和数据处理系统组成。
在HPLC中，液相色谱柱是分离混合物的重要组件。
常用的液相色谱柱包括反相柱、离子交换柱、氢键柱等。
流动相则是指在色谱柱上流动的溶液，常见的流动相为水、有机溶剂和缓冲液。
检测器根据化合物的性质通过吸光、荧光、电化学等方法进行检测和定量。
数据处理系统负责信号的处理和结果的分析。
2. HPLC在药物分析中的应用HPLC在药物分析领域中具有广泛的应用。
它可以用于药物中杂质的分离和定量，药物的纯度和含量测定等。
例如，通过HPLC可以对药物中的有害杂质、不纯物等进行分离和定量分析，确保药物的质量安全。
同时，HPLC还可以用于药物动力学研究和药代动力学研究，了解药物在体内的代谢和排泄过程。
3. HPLC在食品安全中的应用HPLC在食品安全领域也具有重要意义。
它可以用于检测食品中的农药残留、添加剂、重金属和有害物质等。
通过HPLC可以对食品中的这些成分进行分离和定量分析，判断食品是否合格和安全。
同时，HPLC还可以用于食品中的添加剂的含量测定，如防腐剂、甜味剂等。
第二篇：HPLC在环境监测中的应用及发展趋势1. HPLC在环境监测中的应用HPLC在环境监测中具有重要的应用价值。
它可以用于水质、大气、土壤等环境中有机污染物的检测和分析。
通过HPLC可以对环境中的有害物质进行分离和定量，判断环境污染的程度和来源。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种常用的分离和分析技术，被广泛应用于化学、生物、环境、医药等领域。
本文将介绍高效液相色谱的使用方法，包括仪器设备的设置、样品制备与处理、流动相的选择、色谱柱的选择和优化、检测器的选择和优化等方面内容。
1. 仪器设备的设置在使用高效液相色谱进行分析之前，首先需要合理设置仪器设备。
这包括设置流速、保持恒温、校准检测器并进行柱平衡等步骤。
流速的选择应根据样品的特性、分离目标和柱子的要求来确定；保持恒温是为了保证分析的准确性和可重复性；校准检测器是为了确保信号的准确和精确；柱平衡是为了使样品充分与固定相发生相互作用，提高分离效果。
2. 样品制备与处理样品制备与处理是高效液相色谱分析的前提工作。
样品的制备包括样品的采集、提取、浓缩等步骤，样品处理包括样品的过滤、稀释、净化等步骤。
样品采集需要注意样品的代表性和采样方法的选择，提取和浓缩则需要根据需要选择相应的方法，例如固相萃取、萃取液-液分配等。
3. 流动相的选择流动相是高效液相色谱分析的核心。
合理选择流动相有助于提高分析效率和分离效果。
流动相的选择应根据待分析物的性质、柱子的要求和分析目标来确定。
常用的流动相可以是水、有机溶剂、缓冲液等，其组成和比例可以根据需要进行调整。
4. 色谱柱的选择和优化色谱柱是高效液相色谱分析的关键。
选择合适的色谱柱能够提高分离效果和分析速度。
色谱柱的选择应根据待分析物的性质、分析目标和预期的分离效果来确定。
常用的色谱柱包括反相色谱柱、离子交换色谱柱、凝胶色谱柱等，其性能和尺寸也可以根据需要进行优化。
5. 检测器的选择和优化检测器是高效液相色谱分析的最后一步。
不同的检测器适用于不同的分析目标和需求。
常用的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
选择合适的检测器能够提高分析的灵敏度和选择性，优化检测器的参数能够进一步提高定量和定性分析的准确性和可靠性。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告引言：高效液相色谱(HPLC)是一种基于溶液动力学的分析方法，广泛应用于药学、化学、生物学等领域。
本实验旨在通过HPLC技术，分离和鉴定复杂混合物中的化合物，并探究其分离机制。
实验方法：1. 样品制备：取一定比例的复杂混合物样品，将其溶解于合适的溶剂中，得到均匀的样品溶液。
2. 色谱柱选择：根据样品性质和分离目标，选择合适的色谱柱和填料。
3. 流动相选择：根据样品溶解度和分离效果，选择合适的流动相组成和pH值。
4. 色谱条件设置：设置适当的进样量、流速和温度等参数，优化分析条件。
5. 样品进样：通过自动进样器将样品溶液注入色谱柱。
6. 梯度洗脱：通过调节流动相组成或浓度梯度，实现目标化合物的分离。
7. 检测器选择：根据样品性质和目标化合物的特征，选择合适的检测器。
8. 数据分析：利用色谱软件分析检测到的信号，得到峰面积和保留时间等参数。
实验结果：本实验以植物提取物为样品，以色谱柱A为分离柱，以甲醇-水（70:30）为流动相，在室温下进行HPLC分析。
优化的分析条件为：进样量为10 μL、流速为1 mL/min、检测波长为254 nm。
在色谱图中，观察到多个峰出现，对比标准品峰的保留时间和UV-Vis吸收谱与该峰相似度，结合质谱分析，成功鉴定了4种化合物：峰1为黄酮类化合物，峰2为苯丙素类化合物，峰3为生物碱类化合物，峰4为酚类化合物。
讨论：通过本实验，我们可以看到HPLC技术的优势和应用价值。
首先，HPLC可以对复杂混合物进行高效、准确的分离和定量分析，为后续鉴定提供了重要数据。
其次，HPLC操作简便，结果可靠，且可适用于不同种类的样品。
此外，优化实验条件对提高分析效果至关重要，需要通过不断试验和调整，找到最佳条件。
然而，HPLC仍存在一些局限性。
首先，HPLC分析所需的仪器设备和耗材相对昂贵，需要较高的投资成本。
其次，样品制备和前处理过程可能引入误差，影响分析结果的准确性。
安捷伦高效液相色谱仪操作说明之欧阳治创编
安捷伦高效液相色谱仪操作说明一、校枪及样品处理1. 校枪仪器：两个小烧杯、分析天平、移液枪1000μL、100μL步骤：打开分析天平预热，一只烧杯放到称量盘上调零，一只装入纯水。
将移液枪1000μL、100μL调至950μL、50μL，分别吸取纯水称质量，如偏大或偏小，调节移液枪直至准确到0.001g。
（如枪使用过久或气密性不好，可以准备一个小烧杯装入纯水，每次先轻轻沾湿枪口，甩掉水或在用卫生纸吸取口上的水，再插上枪头使用。
）注意慢吸慢放，不要挂珠。
2. 样品处理：用1.5mL离心管取0.5mL发酵液，取出样品后，首现在离心机上离心（13000rap/min 3min）。
然后将样品稀释20倍，取950μL纯水、50μL发酵液于离心管中。
混匀后在离心机上离心（13000rap/min 3min）。
准备自动进样瓶（瓶中放上内衬管），取200μL待测液盖紧盖子。
按顺序放到自动进样盘中。
二、开机1、仪器各组件将在线脱气器、泵：四元、进样器：自动进样器（六通阀）、柱温箱、检测器：示差折光检测器开关打开。
打开计算机,进入Windows XP 画面,并运行CAC Server程序，打开色谱仪各组件电源，待显示已联上各组件的信息及各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online ，图标打开工作站。
化学工作站自动与1200LC通讯。
流动相:将流动相（一般不主张使用偏酸、偏碱的流动相）放入溶剂瓶中，打开冲洗阀，设流速为2ml/min，单击确定，再依次单击泵→控制，选中启动，单击确定，则系统开始冲洗，至管路无气泡为止，切换管路反复操作至所需管路均无气泡。
在“控制”选项中选“关闭”，关闭泵，关闭冲洗阀。
单击泵下面瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。
每次四元泵开始前，要打开冲洗阀阀门以5ml/min的流速冲洗10分钟，使脱气机与泵之间的流动相从冲洗阀流出，以免隔夜的流动相损伤色谱柱。
每次进样检测前，要用流动相冲洗色谱柱30分钟，达到柱温前20min流速设为0.2ml/min，达柱温后再改为0.6ml/min。
高效液相色谱技术分析
高效液相色谱技术分析一、概述高效液相色谱技术是目前分析化学中非常重要的一种分离、检测方法，其应用范围广泛，可以用于药物研究、食品安全、环境污染、生物化学等多个领域。
本文将对高效液相色谱技术进行详细解析，包括其基本原理、仪器设备、应用实例等方面的内容。
二、高效液相色谱技术的基本原理高效液相色谱技术本质上是一种液相色谱技术，其最大的特点是加入了固定化液相。
在传统的液相色谱技术中，液相是直接涂覆在固定相上的，但在高效液相色谱技术中，为了提高色谱分析的效率，常常采用小粒径、高孔径的固相材料作为载体，然后用一定的方法将液相固定在上面。
这种固相材料具有很好的化学稳定性、较大的表面积，可以大大提高分离的精度和速度。
高效液相色谱技术的基本原理是：将样品（物质混合物）经过预处理后，加入到经过固定化液相的柱子中，然后进行溶剂梯度洗脱。
不同成分会根据吸附力、分配系数等量而移动到固相柱某个位置处，从而完成分离和检测的过程。
三、高效液相色谱技术的主要仪器设备1. 高效液相色谱柱高效液相色谱柱是高效液相色谱仪的核心器件，其主要作用是分离洗脱样品中的组分。
市面上常见的柱子材料主要有C18、C8、C4等不同类型，根据分析需要选择不同类型的柱子可以获得更好的分离效果。
同时，考虑柱子长度、直径等因素也是仪器的主要参数。
2. 色谱系统高效液相色谱系统由进样器、泵、检测器、色谱柱等多个部分组成，其中，泵的作用是将流动相压力输送到柱子中，进样器用于自动或手动进样，检测器用于检测分离的组分及其浓度。
同时，为了避免进样到色谱柱之前的样品混合和体积效应，需加滤器、混合器等附件。
3. 检测器高效液相色谱检测器常见的有UV-Vis分光光度计、荧光检测器、光散射检测器等多种类型，这些检测器可以用于分析化学、生物化学等领域。
四、高效液相色谱技术的应用实例1. 分析药物高效液相色谱技术可以用于药物分析，如对丙磺舒钠等药物分析可采用该技术，可获得极好的分离效果和灵敏度。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
本文将介绍高效液相色谱的基本原理、操作步骤以及一些常见的注意事项。
一、高效液相色谱的基本原理高效液相色谱是基于溶液通过固定相的柱子进行分离的原理。
通过控制溶液的流动速度，样品中的化合物将根据其化学特性在固定相上产生不同的保留时间，进而实现分离和定量分析。
在高效液相色谱中，离子交换、尺寸排除、亲和力、反相等不同的柱填料被广泛应用。
根据不同的样品性质和需要分离的化合物，选择合适的柱填料是非常重要的。
此外，流动相的选择也是影响分离效果的重要因素。
二、高效液相色谱的操作步骤1. 样品准备：样品应经过适当的前处理，如过滤、稀释等，以确保样品中的杂质不会影响分析结果。
需要注意的是，样品的pH值也会对分析结果产生影响，因此在样品准备过程中可根据需要进行调整。
2. 样品进样：将经过适当处理的样品注入进样器中，控制进样量和进样速度。
可以选择自动进样或手动进样的方式，保证样品的稳定和准确性。
3. 流动相的配制：根据分析需要，选择适当的溶剂组合并按照一定比例进行配制。
流动相的配制既要保证溶剂的纯度，又要考虑溶剂对柱填料的影响。
4. 柱温和流速的选择：根据柱填料的要求，选择合适的柱温和流速。
在进行分析前，需要对柱温和流速进行优化和调试，以获得较好的分离效果。
5. 检测器的选择和参数设置：根据需要分析的化合物特性，选择合适的检测器，并设置相应的参数。
常见的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
6. 数据分析与结果解释：根据检测器输出的信号，利用计算机软件对数据进行处理和分析。
根据不同的化合物特性，可以采用不同的数据分析方法和曲线拟合技术来定量分析目标化合物。
三、常见的注意事项1. 制备和使用流动相前，需仔细检查溶剂纯度，避免杂质对结果产生干扰。
2. 柱子的保养和维护非常重要，定期进行柱子的清洗和再生，以保证分离效果和柱寿命。
杜雾晨--高效液相色谱法在合成多肽分离与纯化中的应用之欧阳引擎创编
HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用欧阳引擎（2021.01.01）杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。
近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。
本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。
关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。
多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。
蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。
研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。
多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。
化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。
杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。
由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难[1]。
因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。
高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。
而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术范围内一有力高效的分离工具[2]。
浅析高效液相色谱仪的使用要点 液相色谱操作规程
浅析高效液相色谱仪的使用要点液相色谱操作规程高效液相色谱仪广发应用于各种科研、生产领域中。
下面我们来简单介绍下它的使用要点。
1.高效液相色谱仪色谱柱它包括空柱和填料。
空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。
按气相高效液相色谱仪广发应用于各种科研、生产领域中。
下面我们来简单介绍下它的使用要点。
1.高效液相色谱仪色谱柱它包括空柱和填料。
空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。
按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净，用匀浆法填充固定相。
将此柱装入仪器的管路中，用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。
等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液，用正己烷（含 0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）为流动相测定柱效及分别度塔板数在2～3万/ml以上及分别度在1.5以上者，柱效好。
为防止柱污染，常用1个 50mm长，4～5mm内径，装有硅胶（40—50mm）或立柱相同填料的保护柱（预柱）接在主柱之前，以延长色谱柱的寿命。
反相键合相柱用毕。
必需用水充分流经，以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚，再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。
2. 高效液相色谱仪流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中，经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱，最后自检测器流出或收集或作废液回收。
用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法（isocratic dlution），即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。
另一类为梯度洗脱法（gradicnt clution）,即使溶剂的极性强度在色谱过程中渐渐加添。
须按确定程序不断更改流动相的浓度配比，从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分别，而整个高效液相色谱仪色谱过程缩短。
必需注意，梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。
3. 高效液相色谱仪检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸取，荧光发射和电化学三种。
制备型高效液相色谱的实验方法
制备型高效液相色谱的实验方法
高效液相色谱法是一种以高效液相色谱仪（HPLC）作为检测仪器的分析技术。
它是一种常规分离技术，在化学、生物和其他领域中被广泛应用，有助于提高分离精度，增强检测灵敏度。
本文主要介绍高效液相色谱法的制备实验步骤。
1.准备仪器。
用于进行高效液相色谱分析所需的仪器包括：高效液相色谱仪（HPLC）、上样系统和样品管等。
在进行实验前，需要先检查仪器并完成校准。
2.准备样品。
根据实验要求从样品容器中取出适量的样品，然后按照标准浓度进行配置，实验者有必要采用准确的体积来取样。
3.设置实验条件。
对实验中所需的参数进行设置，包括柱型、柱温、检出器模式、流动相构成、流速等，并按需要定义实验的时间。
提前进行后台校准。
4.进行实验。
将样品配好的溶液输入HPLC，维持实验的参数，然后开始实验。
实验结束后，自动保存实验结果。
5.结果分析。
根据实验结果，对分析结果进行分析，计算实验所需的一些指标，分析实验结果。
以上就是高效液相色谱法的制备实验步骤，实验者在执行实验时应重视仪器仪表的使用与维护，以确保实验数据的准确性。
高效液相色谱仪(个人总结,浅显易懂)
高效液相色谱仪（hplc）的操作经验（对外版）本人从事药品质检工作经验一段时间，将自己对仪器操作的一些感悟写出来，力求让那些初学者能够轻松掌握。
因为本人刚开始也是很茫然的，看着一大堆文字资料无从下手，所以也能体会做为一个新手遇到的困难。
现在这个操作流程与以往教科书中繁琐的讲解不同，力求以最简洁的语言让出学者学到东西，从一个新手开始出发学习hplc的操作。
好的那么我们就以这台岛津lc-20at为例，给大家讲讲具体的操作流程。
一台完整的色谱分析仪应包含：进样系统（泵），输液系统，分离系统，检测系统，数据处理系统。
先介绍下这台色谱仪的主要部件：上部为检测器spd-20a，通常为紫外检测器，下部为泵，为排气，冲洗色谱柱之用途；右面的环状物是进样器(六通阀)，将溶液注入其中；再右边的柱状成为注温箱，控制温度的作用（15~25C。
）注温箱的内部便是心脏部分—色谱柱，用于分离各组分。
此图为数据处理系统。
需要在计算机上安装lcsolution软件，便可进行积分等操作，对峰进行处理，控制整个流程。
以此计算含量，相关物制等。
介绍完基本部件，那么我们开始讲讲操作的流程。
1配置流动相。
通常用甲醇和水80：20，75：25，或者乙腈配址流动相（不同物质流动相不同）。
抽滤，超声使溶解。
2开启计算机，泵，和检测器。
用大针管冲洗进样口，待走一段基线后，准备进样。
3流动相配置好后，将滤器换入该流动相中，盖好塞子，开泵，冲洗。
4冲洗完毕后，点击[单词运行]打开方法文件，先进一针空白。
然后用流动相润洗几次，进样。
（样品溶液取1mg至10ml容量瓶，超声），进样量应为进样环体积5倍。
数据保存在相应文件夹下。
5等待峰走完后，开始积分。
出去空白的峰不积分之外，其他都需积分。
打印报告，可以看到峰面积，含量等数据。
6清洗。
同样用大针管注入纯水。
半小时后可关机。
注意保存数据。
以备查验。
高效液相色谱法的使用方法与优化策略
高效液相色谱法的使用方法与优化策略高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、食品等领域的分析技术。
它具有高分离效率、分析速度快、重复性好等优点，因此在科学研究和实际应用中得到了广泛的应用。
本文将介绍高效液相色谱法的使用方法以及一些常用的优化策略，以帮助读者更好地理解和应用这一分析技术。
高效液相色谱法使用方法：1. 样品制备：样品制备是高效液相色谱法的第一步。
样品应根据分析目标进行合适的前处理，如提取、浓缩、衍生化等，以便在色谱柱上得到较好的分离效果。
2. 色谱柱选择：根据需要分离的物质属性和分析目的，选择合适的色谱柱进行分析。
常用的色谱柱包括反相色谱柱、离子交换色谱柱、正相色谱柱等。
3. 流动相选择：流动相的选择与色谱柱相互作用密切相关。
选择合适的流动相可以提高分析效果。
常用的流动相包括水溶液、有机溶剂、酸碱溶液等。
4. 进样方式：高效液相色谱法有多种进样方式，如定量进样、微体积进样、在线进样等。
根据分析需要选择合适的进样方式，以获得准确的分析结果。
5. 色谱条件优化：色谱条件的优化是达到高效分离和准确分析的关键。
通过调节流速、溶剂成分、温度等参数，可以优化分离效果和分析速度。
高效液相色谱法的优化策略：1. 直达性优化：研究药物、食品添加剂等复杂样品时，为了提高分离效果和信号强度，可以通过剖面优化和梯度优化来改进直达性。
剖面优化是指沿色谱柱的某一方向逐渐调整梯度的浓度和组成，以寻找最佳的分离条件。
梯度优化是在剖面优化的基础上，进一步调整流动相梯度的斜率和时间，以获得更好的分离效果。
2. 分离优化：对于分离较为困难的物质，可以通过优化色谱柱类型、流动相pH值、溶剂比例、柱温等参数来改进分离效果。
其中，色谱柱类型的选择是非常重要的一步，常用的色谱柱有C18、C8、C4等反相柱，离子交换柱和正相柱等。
3. 检测器选择和优化：检测器的选择和优化对于分析结果的准确性和灵敏度具有重要影响。
高效液相色谱使用详细操作步骤之欧阳化创编
高效液相色谱使用操作步骤一、泵操作面板PUMP：运行键 START：梯度运行键 PURGE：快冲键RESET：复位键 HOLD：程序暂停键 STOP：泵停止键TIME：程序开启键 FLOW：流速： RSVR： A B C PROG：程序 DEL：删除程序 PMAX：最大压力PMIN：最小压力 ENTER：确定TIME 0 FLOW ENTER （设置流速）TIME 0 RSVR ABC ENTER （设置溶剂）TIME 0 PROG ENTER （设置程序）TIME 0 % A 30 ENTER （设置比例）TIME 0 % B 30 ENTER （设置比例）TIME 0 % C 40 ENTER （设置比例）DEL PROG 1 ENTER （删除程序）1.对于梯度泵设定举例如下：(人参皂苷的梯度)TIME 0 PROG 1 ENTERTIME 0 % A 81 ENTERTIME 15 % A 81 ENTERTIME 60 % A 65 ENTERTIME 65 % A 0 ENTERTIME 80 % A 0 ENTERTIME 81 % A 81 ENTERTIME 100 % A 81 ENTER因为A+B之和始终是100%，所以B相就不用设了。
7．对于对照品在这种条件下只要对照品的峰全部出完后按下RESET键等20分钟即可进第二针进完针后按START 键运行梯度程序。
但是对样品来说一定要等峰出完后再按下RESET键等基线基走直才可进下一针。
二、检测器操作面板RESET：复位键 A/Z：调零键 WL：调波长 ENTER：确定三、实验前的准备工作1、实验前流动相提前配好过滤脱气。
2、置换流动相时把泵的滤头从原来的流动相中换到新的流动相中滤头要轻拿轻放。
3、液路排气顺序：首先打开排气阀—按PURGE键进行排气结束后—按STOP键停止—再拧紧排气阀—按PUMP键让泵运行。
4、打开检测器首先观察右上角氘灯指示灯确认氘灯是否点亮，按WL键调好实验波长后按A/Z键调零。
采用高效液相色谱建立分析方法的思路和流程
采用高效液相色谱建立分析方法的思路和流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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高效液相色谱原理和操作详解之欧阳与创编
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论3一、液相色谱理论发展简况3二、HPLC的特点和优点4三、色谱法分类5四、色谱分离原理6II．基本概念和理论10一、基本概念和术语10二、塔板理论19三、速率理论（又称随机模型理论）21III．HPLC系统26一、输液泵27二、进样器33三、色谱柱35四、检测器42五、数据处理和计算机控制系统50六、恒温装置51IV．固定相和流动相52一、基质（担体）52二、化学键合固定相56三、流动相601．流动相的性质要求602．流动相的选择613．流动相的pH值634．流动相的脱气645．流动相的滤过666．流动相的贮存667．卤代有机溶剂应特别注意的问题67 8．HPLC用水68V．HPLC应用69一、样品测定69二、方法研究71附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则71一、对起草单位的要求：72二、对复核单位的要求：73I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
高效液相色谱法(HPLC)的概述之欧阳体创编
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
高效液相色谱法习题答案之欧阳体创编
第二十章高效液相色谱法思考题和习题1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点：2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。
优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。
①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。
用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。
反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。
用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。
固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。
非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。
硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。
对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
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案例一:某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
欧阳光明（2021.03.07）
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型.
高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC
Method→4.优化Preparative HPLC 条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC 之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV 光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS 检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC 之前是否须经flash column
粗分）；
样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；
建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC 相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；
优化Preparative HPLC 条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC 的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS 测分子量）；
检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！
曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中
溶解度都相当地小，analytical HPLC 虽然分离得很漂亮，但还是没
法做。
最后是通过
结构修饰，在某活性基团上上个保护基，纯化，再脱保护，曲径通幽，绕了个圈才搞定！再比如，样品的酸碱稳定性、热稳定性，这涉及到分离后，如何除去流动相问题。
若样品在酸性、碱性、加热等条件下，会变坏，那得万分谨慎了。
虽困难，到从合成的角度来讲，也容
易判断，合成过程中是否耐受过酸、碱、高温等剧烈条件，很多时候，可从这儿推测出样品的稳定性。
同时，也可以回到出发点——了解样品结构信息，是否含氰基-CN、活性酯键、游离氨基、游离羧基等，以防去除流动相过程中发生氰基变酰胺、酯水解、酸催化酯化等等
情况，基础有机化学方面的知识可以派上用场。
回收纯化的物质——万里长征最后一步，但极其需要走稳，否则就前功尽弃、徒劳无益了。
可以先低温旋蒸掉乙腈（甲醇）后，再溶剂萃取或者沉淀出目标化合物；若热稳定性好的话，也可以直接旋蒸干水，或者用油泵拉干，量少的话。
冷冻干燥也可以派上用场。
具体情况具体分析吧。
需要留心的是，虽然挥发性添加剂会旋蒸掉，但也不可能一蹴而就，在旋蒸过程中，梨形瓶里面的收集液酸碱性会越来越强的，相当于浓缩了酸碱，需要注意这个过程中目标化合物的稳定性，是否顶得住。
案例二：某强极性、含氮碱性化合物的分离纯化
上面简单陈述了反相制备型高效液相色谱法分离纯化的基本流程及
方法建立过程中的注意事项，下面，聊一个自己的亲身经历，在这次分离纯化过程中，该发生和不该发生的状况都遇到了，痛定思痛，与大家分享一下，前事不忘后事之师！
对该强极性、含氮碱性化合物，先在analytical HPLC 上摸索分离条件，初次尝试乙腈-水体系，流动相中不添加任何改性剂，结果，分离效果极不理想，出峰偏早且色谱峰形差，拖尾严重！考虑在流动相中添加Formic Acid，调pH 2.0，抑制色谱柱残留硅羟基的解离，从而降低硅羟基效应。
这么一试，效果立竿见影，再微调梯度洗脱强度，就这样在analytical HPLC 的条件模式好了，下一步，转移到preparative HPLC 上。
制备分离之前，在溶解样品的时候，又遇到麻烦了，该化合物在纯甲醇、纯水中溶解度都不怎么好，甲醇-水混合溶剂，还是不咋的——成了乳浊液了，跟牛奶似的，考虑到流动相里添加了酸，而该化合物又是碱，于是乎，滴加甲酸助溶，边滴加边振摇，样品终究给溶清了，0.45um滤过，备用，待分离。