真核细胞常用几种基因表达检测方法比较论文

关于真核细胞常用几种基因表达检测方法的比较【摘要】目前国际上对真核细胞基因的表达调控机制研究的已经相当深入了，相对应得对基因表达的产物的检测也逐渐多了起来。

首先基因表达的最终产物分为rna和蛋白质。

所以所有的检测方法都是以此为基础进行的。

其中以rna为检测底物的方法有：rt-pcr，northern blot等。

以蛋白质为检测的底物的方法有：elesa，western blot，免疫组化等。

各种方法有其适用范围及优缺点，本文就其最新进展及常用方法作一个阐述及总结。

【关键词】rt-pcr；northern blot；elisa；western blot；免疫组化真核细胞比原核细胞复杂的多，基因表达调控机制也不一样。

以介绍常用的真核细胞基因表达的检测方法来引导读者更深层次的理解真核细胞基因表达的复杂性。

更加全面得理解真核细胞的复杂隔室结构与其基因表达的关系。

及解决一些实验过程中常见的错误。

1.以rna为底物的检测方法1.1 rt-pcrrt-pcr为反转录rcr（reverse transcription pcr）的缩写。

逆转录pcr，或者称反转录pcr（reverse transcription-pcr，rt-pcr），是聚合酶链式反应（pcr）的一种广泛应用的变形。

在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。

由一条rna单链转录为互补dna（cdna）称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。

原先的rna模板被rna 酶h降解，留下互补dna。

rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。

rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。

试剂为：oligo多聚体，相当于mrna引物，amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸，rnase：rna酶抑制剂，pcr buffer：rt-pcr缓冲液，mgcl2：2价镁离子。

高志强等用荧光rt2pcr快速检测狂犬病病毒，得到方便实用的检测狂犬病病毒的方法。

姚立等运用rt-pcr检测一种香菇病毒，并为香菇快速脱毒提供技术支持，是的香菇人工栽培更加周期减短，产量增加，更加有利于抢占国内国际市场。

黄一等建立起了用rt-pcr检测食品中的骨髓灰质炎病毒的体系，为食品出入境检测提供了现实可行的检测体系。

董雅凤等通过rt-pcr建立起了检测苹果茎痘病毒的方法。

以上通过rt-pcr在真核生物检测病毒基因的表达都有很明显的检测结果，对其研究的深入，必将带来更加方便实用的检测方法。

但rt-pcr过程中的引物要特异的合成，rna易被无处不在的rnaase水解。

而且操作时酶易因反复冻融而变性所以此项检测方法有一定的难度。

但因其敏感度高所以也使得其使用率相当高。

1.2 northern blotnorthern blot是在变性条件下将待检的rna样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同southern blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mrna）及其含量。

需要的贵重仪器为：电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，uv交联仪，杂交炉，分光光度计。

而且还需要特意的探针模板dna（25ng），尼龙膜等。

还要x光底片，底片暗盒等特异的装置。

在进行northern blot之前要用rnazap去除梳子，电泳槽，刀片等表面的rnase酶以防污染。

基本步骤为：（1）制胶；（2）探针的制备；（3）rna样品的制备；（4）电泳；（5）转膜；（6）杂交；（7）洗膜；（8）曝光，即成。

汪吉宝等运用northern blot检测喉鳞状细胞癌中表皮生长因子受体mrna的表达。

辅助阐明鳞状细胞癌发病机制。

叶铃等创造性的运用多寡核苷酸探针同步标记应用于northern blot多基因分析，从而简化了实验过程，缩减了实验时间，节省了实验试剂，并使各基因表达丰度之间的比较具有更高的准确性，提高了northern blot的检测效率和成功率。

廖和荣等报道了运用northern blot分析绵羊皮肤mrna差异，一定程度上探讨了与绵羊毛性状相关基因的表达调控机制，从而进一步加快对绵羊羊毛品质改良和提高方面的研究。

刘红等创造性的运用反向northern blot技术快速筛选阳性克隆，可用于各种分离差异片段的方法中差异片段的初步筛选，也可用于基因诊断中的目的基因的多个位点突变的检测，不仅快速而且简便又经济。

以上对northern blot的灵活运用，既达到了检测的目的又简便经济。

但在具体操作过程中应注意：用于rna电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去rnase酶，以免样品的降解。

由于rna 分子都比较小，一般不酶切，可以直接将提出的rna样本点样，转印杂交。

应该尽可能使用严谨的杂交条件，比如高的退火温度或高甲酰胺含量。

转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡.只有细胞内表达量有一定高时才能检测的到，所以灵敏度没有rt-pcr 强，并且易污染，因而使用频率不如rt-pcr。

2.以蛋白质为底物的检测方法2.1 elisaelisa（enzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附剂测定）这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

elisa可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体。

（2）酶标记的抗原或抗体。

（3）酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

具体有：①双抗体夹心法；②间接法测抗体是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法；③竞争法。

王立军等通过检测海岛地区幼儿抗-hbs得出elisa由于灵敏度不如eclia而使得推广eclia成为当务之急。

胡学肖等运用elisa 法检测禽组织中的盐酸克伦特罗残留量，从而开创了灵敏度高，快速有效，适合大批量样品的定性和半定量检测的技术。

沈昊宇等运用酶联免疫吸附法检测水产品中的呋喃唑酮残留量，从而为水产品的质量保证提供了一把利剑，为中国水产品的出口提供了坚实的保障。

王日平报道elisa法测定血清甲状腺激素得出的值更接近靶值，效果更好。

以上的报道都是对elisa法的改造及改进，以使其运用于特定的对象。

elisa的所有步骤都有据可依，但具体操作过程中易污染，而且必须要有相应的抗体。

除此之外，新手做elesa没有经过专门的培训不易成功。

而且国内很少有几个研究机构有专业的洗板器，因为其性价比太低，全靠经验洗板。

所以成功率不是很高，但因其灵敏度高，所以使用率还是很高的。

而欧美大部分使用洗板器，效果要理想一些。

2.2 western blotwestern blot中文一般称为蛋白质印迹。

它是分子生物学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

其通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

western blot与southern blot或northern杂交方法类似，但western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

其基本步骤为：（1）收集蛋白样品；（2）电泳；（3）转膜；（4）封闭；（5）一抗孵育；（6）二抗孵育；（7）蛋白检测。

邓子牛等运用westren blot分析了溃疡病ptha，表明与柑橘溃疡病有关的ptha蛋白质在转ptha-nls基因糖橙和在转ptha-nls 基因冰糖橙中成功表达，为ptha抗病机理的研究提供理论基础。

杨焕明等运用western blot检测分析冷刺激不同时间仔猪3种组织hsp70的表达，得出冷应激反应中代谢最旺盛的器官肝脏中的物质代谢可能与hsp70的表达量有关。

对western blot的灵活运用，与各种检测技术结合更趋完美。

但因为进行wb检测需要有一定的蛋白表达量，所以灵敏度不如elesa，但污染指数没有elesa高，因此也是检测蛋白质的常规方法，国内外进程差不多，唯一的区别是欧美国家的试剂相对精确些。

值得提出的是wb流程简单，但操作难度相当大，而且价格也不菲。

2.3 免疫组化免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

单克隆抗体是一个b淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。

多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个b淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

以用于不同的用处。

卜宪敏等报道了83例肾活检标本免疫组化分析，强调了免疫组化在基层医院肾活检病理诊断所起的作用。

杨晓凤等对假肥大型营养不良肌细胞抗肌萎缩蛋白进行免疫组化研究，得出了其在dmd和bmd确诊及鉴别诊断中起了重要作用。

汪洋等报道了胃肠道间质瘤的免疫组化特征，有助于积累临床经验，提高诊治率。

葛仕豪等运用免疫组化系统分析了禽类消化道内分泌细胞的分布特征，得出了消化道内分泌细胞除了存在于鸡的胃肠道，也存在于其他组织器官。

潘绍新等报道了运用免疫组化研究了年龄相关性白内障晶状体前囊膜中核因子κb，进一步阐明了nf-κb在龄相关性白内障发病机制中的作用。