RTPCR和realtimePCR原理及步骤
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
简述RT-PCR的原理及应用
简述RT-PCR的原理及应用1. RT-PCR的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成DNA并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增的技术。
它结合了逆转录反应（RT）和PCR技术，能够从RNA分子中扩增出目标序列的DNA片段。
RT-PCR的原理可以分为以下几个步骤： - 逆转录反应：在逆转录酶（RT酶）的作用下，将RNA模板反转录成单链cDNA（互补DNA）。
- 第一链合成：通过加入一条适配器序列，形成一条新的DNA链，并使其保持单链状态。
- 第二链合成：加入第二个引物，依靠DNA聚合酶进行DNA链的合成。
此时，所得到的双链cDNA与原始RNA分子完全互补。
这样，通过逆转录和扩增两个步骤，我们可以从RNA模板中获得目标序列的DNA片断。
接下来，这些DNA片段可以通过PCR技术进一步扩增，以获取更多目标DNA。
2. RT-PCR的应用RT-PCR技术具有广泛的应用范围，包括以下几个方面：2.1 基因表达分析RT-PCR广泛应用于基因表达分析领域，其敏感性、特异性和快速性使其成为研究基因表达的重要工具。
通过从细胞中提取RNA，然后经过逆转录反应合成cDNA，最后通过扩增PCR得到目标基因的片段，可以定量分析目标基因在不同条件或组织中的表达水平。
2.2 病毒检测与诊断RT-PCR技术在病毒检测和诊断方面具有重要的应用价值。
病毒RNA是RT-PCR的理想模板，通过逆转录和扩增，可以检测病毒的存在和数量。
例如，在COVID-19大流行期间，RT-PCR被广泛用于检测冠状病毒的RNA，以诊断感染者和筛查潜在的传播者。
2.3 遗传疾病筛查RT-PCR也被广泛用于遗传疾病的筛查，特别是单基因遗传病的检测。
通过RT-PCR扩增目标基因的DNA片段，可以鉴定致病基因的突变。
这对于帮助家族中可能患有遗传病的个体进行早期诊断和咨询是非常重要的。
RT-PCR_原理介绍
Real-time PCR(RT-PCR) 原理介绍实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一.实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1.Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定2.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2. 荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
RTPCR和realtimePCR原理及步骤
绝对定量与相对定量的定义
绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究
相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
绝对定量通过标准品定量
绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域 值时所经历的循环数被称为 CT 值 （ threshold value ）。
定量PCR的数学原理
斜率与扩增效率
标准品
标准品梯度稀释方法
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
SYBR Green法优缺点
优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA������ 使用方便--不必设计复杂探针������ 非常灵敏������ 便宜
其他荧光标记方法
Taqman 的优点 对目标序列有很高的特异性 特别适合于SNP检测 与Molecular Beacons 相比设 计相 对简单 Taqman 的缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析
分子信标的优点 对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试 剂之一 荧光背景低 分子信标的缺点 设计困难 无终点分析功能 只能用于一个特定的目标 价格较高
RT-PCR和real-time PCR 原理及步骤
PCR定义
聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时 间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子 生物学技术。
多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有 活性，因此反应体系自动往复多次地进 行对所需的DNA的片段的酶促合成，使 反应产物按指数增长，所以命名为聚合 酶链式反应。
RT PCR的原理和操作
Real-time PCR概論Introduction自從聚合酶連鎖反應(PCR)技術開發至今，幾乎是分子生物學中最被普遍使用的技術。
PCR主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環，連續擴增目標DNA片段。
在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上，以PCR 為基礎的技術都被廣泛的應用，例如多重聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)、逢機增幅多態型-聚合酶連鎖反應(RAPD-PCR)、序列特徵化增幅區域(SCARs)、聚合酶連鎖反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)以及即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)等。
其中以Real-time PCR近年被使用的頻率逐漸被提高，除了反應時間大量的縮短之外，儀器及技術亦不斷的創新進步，真正可以做到兼顧到準確度、敏感度及高效率的多項優點。
What is Real-time PCRReal-time PCR，顧名思義可以視為兩個部份，”Real-time”和PCR。
藉由PCR擴增的原理，使極微量的DNA放大，再經由光學系統達到即時偵測(Real-time)的效果。
每一次PCR擴增循環後，將其生成反應產物之數量記錄下來，待反應全部完成之後，以cycle number和生成產物做圖，可得到一反應曲線圖形，完整的呈現PCR反應中每一個cycle產物的生成情形，所以稱為即時定量PCR。
PCR vs. Real-time PCR一般的PCR反應，利用熱循環步驟，使目標基因以2n進行擴增，將微量的DNA目標片段放大。
最後，再利用洋菜膠電泳(agarose gel electrophoresis)進行結果分析。
我們可以經由產物的片段大小、擴增後產物生成量等等條件來判斷實驗結果是否成功。
必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析，對於反應過程並沒有做任何分析、記錄，故一般PCR反應又可稱為End-point PCR。
rt pcr原理
Real-time PCR（实时荧光定量PCR）原理解析1. 什么是PCR？PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
PCR的发明者是美国生物化学家基里尔·米隆尼斯（Kary Mullis），于1983年提出了这一方法。
PCR通过不断重复三个步骤来扩增目标DNA片段：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Elongation）。
这些步骤在PCR仪中由多个温度循环来控制，因此PCR也被称为“温度循环扩增”。
PCR技术为科学家提供了一种快速、敏感、特异性极高的扩增目标DNA的方法。
然而，传统的PCR只能在反应结束后进行结果的检测，无法实时监测反应的过程。
为了解决这个问题，Real-time PCR技术应运而生。
2. 实时PCR概述实时PCR是在PCR扩增过程中，使用荧光信号实时监测反应的进行。
与传统PCR相比，实时PCR能够提供实时的、连续的照片剖析PCR的进展。
实时PCR有两种常用的检测方法：荧光染料法和探针法。
其中，探针法又分为TaqMan探针法和Molecular Beacon探针法。
这些探针和染料能够与PCR反应中的产物结合，并产生荧光信号，根据信号的增长情况可以推断目标DNA的含量。
实时PCR广泛应用于分子生物学、医学诊断、检测病原体等领域。
接下来，我们将重点介绍实时PCR的基本原理以及常用的探针法和荧光染料法。
3. 实时PCR基本原理实时PCR的基本原理和传统PCR类似，也是通过变性、退火和延伸三个步骤来扩增DNA片段。
然而，在实时PCR中，PCR反应是在热循环PCR仪中进行，并且扩增过程中的结果可以实时检测。
实时PCR一般需要使用一种独特的仪器，称为实时荧光PCR仪或荧光定量PCR仪。
这种仪器能够在不破坏试管密封的情况下，通过荧光信号实时检测PCR反应体系中的增长程度。
在实时PCR中，荧光信号通过专门的探测器（Detector）收集，并且荧光信号的强度会随着PCR反应进行的次数递增。
rt-pcr的原理实验步骤及应用
RT-PCR的原理、实验步骤及应用1. 原理RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的原理，用于检测和定量RNA的表达水平。
下面是RT-PCR的基本原理：•首先，通过逆转录作用，将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
逆转录酶会在反应中合成cDNA互补链，其中DNA聚合酶将dNTPs部分替换为对应的ddNTPs（荧光标记的核苷酸）用于标记合成的cDNA。
•然后，在PCR反应中使用特定的引物（primers）来扩增目标cDNA。
引物是两个短的DNA序列，它们能够与cDNA互补的序列部分结合，从而指导DNA聚合酶合成新的DNA链。
•最后，通过荧光检测仪读取PCR反应体系中的信号，从而定量检测目标RNA的表达水平。
2. 实验步骤RT-PCR实验通常包括以下步骤：2.1 样品准备•收集所需的细胞或组织样品，并保存在RNA保护液中以保护RNA的完整性。
•如果需要，使用RNA提取试剂盒从细胞或组织中提取RNA。
2.2 逆转录反应•准备RT-PCR反应体系，包括逆转录酶、随机引物、RNA样品和其他反应组分。
•混合反应液，然后进行逆转录反应。
此步骤通常在反应器中以特定温度下进行。
2.3 PCR反应•将逆转录反应产生的cDNA用作PCR反应的模板。
•准备PCR反应体系，包括DNA聚合酶、引物和其他反应组分。
•将PCR反应液混合均匀，然后进行PCR反应。
PCR反应通常包括一系列的循环，在每个循环中，温度会发生变化以使DNA链合成和扩增。
2.4 结果分析•将PCR反应体系中的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
•根据PCR反应产物大小，使用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。
•使用紫外线透射仪观察琼脂糖凝胶中的DNA带，以便分析目标基因的扩增效果。
3. 应用RT-PCR广泛应用于分子生物学和医学领域，具有以下应用方面：•基因表达分析：通过测量RNA的表达水平，可以了解目标基因在不同样品中的表达情况，从而研究基因调控、识别潜在的生物标记物等。
RT-PCR与realtime pcr
Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。
Real-time PCR 所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
Real time RT-PCR是将Real time-PCR的方法用于RT-PCR中，目的也是为了对样品浓度进行精确控制。
RT-PCR和Real time-PCR是没有必然联系的，两种技术可以一起使用，就是Real time RT-PCR；也可以单独使用。
就是名称有点绕，逆转录PCR先出现，所以占用了RT-PCR这个简写，等Real time-PCR技术出现后，本来按照惯例，简写也是RT-PCR，但为了与逆转录PCR相区别，还是写成Real time-PCR。
realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点
real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
实时定量RTPCR的原理及方法
实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。
该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。
本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。
二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。
这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。
实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。
反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。
这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。
然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。
在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。
实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。
这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。