第6章 酶工程制药

（三）酶固定化的方法
1、载体结合法 2、交联法 3、包埋法 4、选择性热变性法
1、载体结合法
（1）物理吸附法 （2）离子结合法 （3）共价键结合法
（1）物理吸附法
A、物理吸附法的优点： （1）操作简单 （2）可选用不同的吸附剂 （3）酶失活之后，载体可以再生 B、物理吸附法的缺点： （1）酶的最适吸附量无规律可寻 （2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。
（3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂
• 参与交联的酶蛋白功能团 N-末端的α-氨基 赖氨酸的ε-氨基 酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 • 常用的交联剂 戊二醛 双重氮联苯胺-2、2-二磺酸 1、5-二氟-2、4-二硝基苯 已二酰亚胺二甲酯
双功能试剂： 常用的是戊二醛
O O H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H 戊二醛的两个醛基都能与游离的氨基反应，形成席夫碱 (Schiff) 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间 交联的固定化酶
载体活化的方法：
重氮法：含有苯氨基的不溶性载体 叠氮法：含有酰肼基的不溶性载体 溴化氰法：含羟基的载体 烷基化法：含羟基的载体
2、交联法
（1）交联的优缺点 （2）交联法的类别和内容 （3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联 剂
（1）交联的优缺点
• 交联法是采用双wenku.baidu.com能、或者多功能试剂，使得酶与酶 之间发生交联的固定化方法。基团之间的交联通过共 价键结合。 • 交联法的优点----交联后的酶活性较高 • 交联法的缺点----反应条件剧烈、酶的回收率低。
第六章 酶工程制药
主要内容
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 概 述 酶的来源和生产 酶和细胞的固定化 固定化酶和固定化细胞的反应器 酶的人工模拟 酶的化学修饰 酶工程研究的进展
第一节
概述
一、酶工程简介 二、酶的特性 三、酶工程制药的内容
一、酶工程简介
酶工程的定义：
利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将 相应的原料转化成所需要的产品，它是酶学理论与 化工技术相结合而形成的一种新技术 ，也是利用 酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定功 能，借助于工程学手段来为我们提供产品的一门技 术。
（一）来源类别
1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生 物中，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早 期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。 2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件 的限制。 3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶， 由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。 4、利用微生物生产酶制剂。
1、对生产菌种的要求
（1）产酶量高 （2）不是致病菌 （3）性能稳定，不容易变异、退化、不易感染噬菌体。 （4）能够利用廉价的原料，发酵周期短、易于培养。
2、目前常用的产酶微生物
大肠杆菌---用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β半乳糖苷酶。 曲霉（黑曲霉、黄曲霉）---用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。 枯草杆菌---用于生产a-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。 啤酒酵母---用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。 青霉菌---用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5`-磷酸二酯酶、脂肪 酶。 木霉菌---用于生产纤维素酶。 根霉菌---用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。 链霉菌---用来生产葡萄糖异构酶。
（3）共价键结合法
酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载 体表面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载 体上的方法。 A、共价键结合法的优点----酶与载体结合牢固，酶 不会发生脱落。 B、共价键结合法的缺点----操作复杂、反应条件苛 刻，酶的活性中心会遭到部分性的破坏。 C、常用的载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、 甲基丙烯醇共聚物
乳糖酶 治疗乳糖缺乏症 链激酶 治疗血栓性疾病 尿激酶 治疗血栓、肾病 纳豆激酶 治疗血栓
第三节
酶和细胞的固定化
• 一、固定化酶的制备 • 二、固定化细胞的制备 • 三、固定化方法与载体的选择依据 • 四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 • 五、固定化酶活力的测定方法
一、固定化酶的制备
酶的不足之处：
（二）利用微生物生产酶制剂的优点
（1）能够生产酶的微生物种类繁 多，有较大的选择余地。 （2）微生物繁殖快、培养周期短、 培养方法简便，培养过程容易控 制， （3）微生物具有较强的适应性，能 够培育出新的高产菌株。
（三）各种能够生产酶的微生物
1、氧化-还原酶 （1）葡萄糖氧化酶 （2）D氨基酸氧化酶 （3）尿激酶 （4）过氧化氢酶 （5）近氧化物酶 2、转移酶 （1）转氨基酶 （2）核苷磷酸转移酶 3、水解酶 4、裂合酶 5、异构酶 （来源于霉菌） （来源于霉菌、肾脏） （来源于酵母菌、肾脏） （来源于细菌、霉菌、红血球） （来源于植物） （来源于细菌、动物肝脏） （来源于细菌）
醛糖还原酶的活性中心
酶的分类： 按酶催化反应的类型，可分成六大类：
氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂解酶类 异构酶类 连接酶类
三、酶工程制药的内容
药用酶的生产 药用酶：可用于预防和治疗疾病的酶 相关技术：发酵生产、分离纯化、分子修饰 酶法制药 定义：利用酶催化作用制造出具有药用功效 的物质的技术过程。 相关技术：催化反应、固定化、非水相催化
•
活性炭 碳酸钙----每克载体能吸附1mg酶蛋白。 纤维素 多孔玻璃 酸性白土 漂白土 高岭石 氧化铝 硅胶 膨润土 羟基磷灰石 磷酸钙 金属氧化物----二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒，直径为 100-200um，每克载体能吸附17mg酶蛋白。 淀粉 谷蛋白 陶瓷 丁基葡聚糖凝胶 已基葡聚糖凝胶 单宁纤维素衍生物
固定化细胞阶段
固定化菌体 (固定化死细胞)技术 (70年代初) 1973年，日本在工业上成功的利用固定化大肠杆菌菌体中的天 门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化细胞 (固定化活细胞或固定化增殖细胞技术(70年代末) 1978年，日本的铃木等人用固定化细胞生产a-淀粉酶研究成功 固定化原生质体技术 (80年代中期) 1986年开始，用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶、葡萄糖 氧化酶、谷氨酸脱氢酶等的研究相继取得成功
四、酶在疾病预防和治疗方面的应用
药用酶的特点 针对性强 疗效显著 副作用小
疾病诊断方面的应用 疾病治疗方面的应用 药物生产方面的应用 分析检测方面的应用
常用酶
蛋白酶 消化剂、消炎剂、治疗高血压 A-淀粉酶 消化药 脂肪酶 消化剂、预防和治疗高血脂
右旋糖酐酶 预防齵齿 溶菌酶 抗菌、消炎、镇痛 超氧化物歧化酶 抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护DNA、蛋白质 和细胞膜等免遭超氧负离子的破坏 L-天冬酰胺酶 预防癌症
四个过程 1.自然酶的开发和应用 2.固定化酶和固定化细胞 3.多酶发应器 4.仿生技术
自然酶的开发和应用
从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶并 加以利用的阶段。
1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得了淀粉 酶，用作消化剂 1908年，德国的罗姆 (Rohm) 制得胰酶，用于皮革的软 化 1908年，法国的波伊登 (Boidin) 制得细菌淀粉酶，用 于纺织品的退浆 1911年，美国的华勒斯坦 (Wallerstein) 制得木瓜蛋白 酶，用于除去啤酒中蛋白质浑浊
3、水解酶
• 脂肪酶 5`-磷酸二酯酶 淀粉酶 果胶酶 纤维素酶 半纤维素酶 溶菌酶 蜜二糖酶 乳糖酶 转化酶 透明质酸酶 凝乳酶 天冬酰胺酶 脲酶 青霉素酰化酶 氨基酰化酶 橙皮苷酶 蛋白酶 （来源于细菌、霉菌、胰脏） （来源于霉菌） （来源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽） （来源于细菌、霉菌） （来源于霉菌、蘑菇） （来源于霉菌） （来源于细菌、鸡卵白） （来源于霉菌） （来源于细菌、霉菌） （来源于细菌、酵母） （来源于细菌、动物睾丸） （来源于霉菌、小牛胃、羊胃） （来源于细菌） （来源于豆科植物） （来源于细菌、霉菌） （来源于细菌、霉菌、牛肾脏） （来源于霉菌） （来源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果）
大规模生产阶段
1949年，用液体深层培养法进行细菌a-淀粉酶 的发酵生产 50年代以后，酶制剂的生产转向微生物液体深 层发酵的方法 1960年，法国的雅各 (Jacob) 和莫诺德 (Monod) 提出了操纵子学说，阐明了酶生物合成 的调节机制
固定化酶和固定化细胞
固定化酶阶段
酶的不足之处：酶的稳定性差；只能使用一次
（2）交联法的类别和内容
• 类别
酶与酶交联法 酶与辅助蛋白交联法 吸附交联法 载体交联法
• 内容
分子内交联 分子间交联 酶与辅助蛋白分子之间交联 酶与载体之间交联
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子； a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
1916年，美国的奈尔森 (Nelson) 和格里芬 (Griffin) 发现 吸附在骨炭上的酶仍具有催化活性 1953年，德国的格鲁布霍费(Grubhofer) 和施来斯(Schleith) 首先将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与重氮化聚氨 基苯乙烯树脂结合，制成固定化酶 1969年，日本的千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶 从DL-氨基酸生产L-氨基酸 1971年第一次国际酶工程学术会议在美国召开
（二）固定化酶的特点
（1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生 物、分子工程手段加以改良。 （2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。 （3）反应以后，产物中不含酶，易于纯化。 （4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。 （5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。 （6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。
C、常 用的吸 附剂
（2）离子结合法
A、离子结合法的优点----操作简单、处理条件温和，酶 的活性中心不容易被破坏。 B、离子结合法的缺点----载体和酶的结合力较弱、常常 发生酶脱落的现象
C、常用的离子结合剂 树脂----阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离 子交换剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸 附50-150mg酶蛋白。 DEAE-纤维素等
第二节
酶的来源和生产
• 一、药用酶的生产方法 • 二、酶的来源 • 三、酶的生产菌种 • 四、酶在疾病预防和治疗方面的应用
一、药用酶的生产方法
提取法 从含酶细胞、组织或器官中提取、分离和 纯化 生物合成法 利用细胞生命活动而获得人们所需要的酶 化学合成法
二、酶的来源
（一）来源类别 （二）利用微生物生产酶制剂的优点 （三）各种能够生产酶的微生物
裂合酶和异构酶
4、裂合酶 天冬氨酸-β-脱羧酶 β-酪氨酸酶 延胡索酸酶 谷氨酸脱羧酶 5、异构酶 氨基酸消旋酶 葡萄糖异构酶 （来源于细菌） （来源于细菌） （来源于细菌） （来源于细菌）
（来源于细菌、霉菌、酵母） （来源于细菌、放线菌）
三、酶的生产菌种
1、对生产菌种的要求 2、目前常用的产酶微生物
多酶反应器
酶反应器：
以酶作为催化剂进行反应所需的设备
多酶反应器：
多种酶固定化后，制成多酶反应器，模拟微生物 细胞的多酶系统，进行多种酶的顺序反应，来合 成各种产物 此技术还处于实验室研究阶段
仿生技术
定义：模仿生物系统的原理以建造技术系统，或 者使人造技术系统建造具有生物系统特征或类似 特征的技术。 模拟酶：根据酶的作用原理，用人工的方法合成 的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化 合物。
一、酶工程简介
酶工程研究内容：
酶的分离、提纯、应用开发 固定化技术及酶反应器的研究 酶的修饰与改造 有机相中酶反应的研究 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 抗体酶、核酸酶的研究 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究
二、酶的特性
1、专一性强 2、催化效率高 3、反应条件温和 4、酶活性的调控机制复杂
稳定性差 难于回收利用 产物分离纯化困难
（一）固定化酶的定义
• 固定化酶是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体 来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易 随水流失的固定化催化剂。 • 制备固定化酶的过程称为酶的固定化。
• 酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体 细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上的酶。