第6章 酶工程制药
合集下载
【管理资料】生物技术制药——第六章-酶工程制药汇编
➢ 主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶 等。
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
✓酶是生物细胞产生的、具有催化能力的
生物催化剂。
✓催化高效性 ✓专一性：结构专一性；立体异构专一性 ✓酶具有不稳 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅因子
辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
反应检测； c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酸酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
酶的来源
从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术
生物技术制药——第六章-酶工 程制药
酶工程简介
酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指 自然酶制剂在工业上的规模应用。
1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨
基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程
的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的 固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。
通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产 菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物 发酵法来生产。
酶的生产菌
作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而
且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产
生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
✓酶是生物细胞产生的、具有催化能力的
生物催化剂。
✓催化高效性 ✓专一性：结构专一性；立体异构专一性 ✓酶具有不稳 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅因子
辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
反应检测； c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酸酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
酶的来源
从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术
生物技术制药——第六章-酶工 程制药
酶工程简介
酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指 自然酶制剂在工业上的规模应用。
1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨
基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程
的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的 固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。
通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产 菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物 发酵法来生产。
酶的生产菌
作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而
且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产
生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
第6章 酶工程制药(二)
基因工程技术：通过基因工程技术对酶的基因进行改造和优化，提高酶的产量和稳定性
细胞培养技术：通过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞培养技术，在细胞内高效表达酶，提高酶的生产效率
发酵工程技术：利用微生物发酵技术，通过优化发酵条件，提高酶的产量和纯度
蛋白质工程技术：通过蛋白质工程技术，对酶的蛋白质结构进行改造和优化，提高酶的活性 和稳定性
酶的提取：从生物材料中分 离和纯化酶的过程
提取和纯化的方法：沉淀法、 色谱法、电泳法等
提取和纯化的目的：获得高纯 度、高活性的酶，用于药物研
发和生产
微生物发酵法：通过微生物发酵产生酶，是最常用的生产方式 基因工程法：通过基因工程技术生产酶，具有更高的生产效率和特异性 化学合成法：通过化学合成方法生产酶，但成本较高且难以大规模生产 提取法：从动植物或微生物中提取酶，但提取量有限且成本较高
酶的化学修饰：通过化学方法对酶进行修饰，改变酶的性质和功能 单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶的组合生物合成：通过组合生物合成技术，将不同酶的基因组合在一起， 形成具有新功能的酶
单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶工程在疾病诊断中的应用
蛋白质工程：通过基因工程技术对 酶的蛋白质结构进行改造，提高酶 的催化效率和稳定性
蛋白质与小分子结合：通过将小分 子与酶结合，改变酶的活性和选择 性
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
蛋白质进化：利用进化算法对酶进 行优化，提高酶的适应性和催化效 率
蛋白质与蛋白质结合：通过将不同 的酶结合在一起，形成具有协同作 用的复合酶
酶作为药物的诊断工具：酶可以作为药物的诊断工具，通过催化特定的化学反应，产生信号或 标记，用于诊断疾病或监测治疗效果。
酶工程制药
水不溶性载 体
指限制或固定于特定 间位
置的酶，具体来说，是指 经物 理或化学方法处理，
固定化技术
使酶变成不易随水流失即
运动受到限制，而又能发 固定化酶
挥催化作用的酶制剂。
（水不溶性酶）
（细胞固定化、固定化细胞）
⒉固定化酶的特点
具有生物催化剂及固相催化剂的功能。
（1）可以多次使用，酶的稳定性提高； （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产
四、酶在医药领域的应用
1、在疾病诊断方面的应用 葡萄糖氧化酶 ----葡萄糖酸和过氧化氢 ----过
氧化氢酶 ---水和原子氧 -----无色的化合 物氧化成有色的化合物 2、在疾病治疗方面的应用
溶菌酶--分解病原菌的细胞壁--抗菌和消炎 作用；尿激酶；SOD 3、在药物生产方面的应用：青霉素酰化酶 4、在分析检测方面的应用：多酚氧化酶传感器
蛋白质分子。
二.生物酶工程 工程酶（克隆酶） 突变酶 设计新酶基因
三.酶工程的基本过 程可以概括如下
四.生物工程各分支领 域之间的关系如何？
酶工程主要包括内容
① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ③ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ④ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研
第六章
酶工程制药
第一节 概 述
一、酶工程（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发
展而形成一门新的技术学科。它是从应用 的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化 功能对酶的认识和研究历程
1. 人们对酶的认识起源于生产实践，人类几千年 前，都开始制作发酵及食品。
究 ⑤ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑥ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑦ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究 ⑧ 有机介质中酶的反应,新颖酶的发现、研究和应用
酶工程制药课件
2.酶化学修饰的目的：
a.提高生物活性
胰蛋白酶 缬天天天天赖异缬甘
组
46
丝
S S
活性中心 缬天天天天赖 缬 异甘组 丝 S S
18 3
S S
S S
b.增强在不良环境中的稳定性 c.针对异体反应，降低生物识别能力
二、化学修饰的方法
化学修饰方法的几个问题 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条
哈尔滨医科大学 药学院生物制药教研室
第六章 酶工程制药
第五节三、进化酶
四、抗体酶
人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为 制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所 以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要 是为了解决酶的以上缺点。
2.酶分子内部修饰
3.结合定点突变的化学修饰
三、修饰酶的特性
1.热稳定性提高 2.抗各类失活因子能力提高 3.抗原性消除 4.体内半衰期延长 5.最适pH改变 6.酶学性质变化 7.对组织分布能力改变
四、酶化学修饰的应用
酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫 原性； 4.产生新的催化能力；
1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离 得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过 离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解 生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成 DL-乙酰氨基酸．再进行拆分。生产成本仅为用游离 酶生产成本的60％左右。
二硫键的化学修饰
氨基的化学修饰
第六章酶工程制药
13
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
14
24
25
(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
17
18
19
20
21
• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
22
2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
14
24
25
(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
17
18
19
20
21
• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
22
2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
生物技术制药——第六章 酶工程制药
2、酶的提取
3、酶的分离方法
4、酶的组合分离纯化策略
5、酶的浓缩、干燥与结晶
一、酶的分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
25
二、酶的提取
JY92-II D超声波
化学合成：固相合成多肽技术
早期酶的生产多以动植物为主要原料
植物提供的酶主要有： 蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动物组织提供的酶主要有：
胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的
凝乳酶等。
不适合大规模生产：动植物来源有限、生
产周期长，以及地理、气候和季节影响。
目前工业生产一般都以微生物为主要来源
酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测
定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
15
(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病:
一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在
某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于 组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内 的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此， 可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断
和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后， 分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固 定化酶。 郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基 酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用 的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工 程以及整个生物工程中占有的重要作用, 它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子 等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。
酶工程制药
生命科学技术学院酶工程制药蛋白质蛋白质黑色素③①苯丙氨酸酪氨酸多巴儿茶酚胺（3，4二羟苯丙氨酸）苯丙酮酸尿黑酸甲状腺素②苯乳酸苯乙酸苯酮乙酰乙酸CO2+H2O图苯丙氨酸及酪氨酸代谢①苯丙氨酸羟化酶缺乏所导致苯丙酮尿症；②尿黑酸氧化酶缺乏所导致尿黑酸症；③酪氨酸酶缺乏所导致白化病。
一、酶与酶工程研究的重要意义1. 研究酶的理化性质及其作用机理，对于阐明生命现象的本质具有十分重要的意义酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质。
新陈代谢是生命活动的最重要特征。
一切生命活动都是由代谢的正常运转来维持的，而生物体代谢中的各种化学反应都是在酶的作用下进行的。
酶是促进一切代谢反应的物质。
从生物大分子的结构与功能关系来说明生命现象的本质和规律，从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节，疾病、生长发育等的关系，无疑具有重大科学意义。
2. 酶是分子生物学研究的重要工具正是由于某些专一性工具酶的出现，才使核酸一级结构测定有了重要突破。
1970年，美国Smith等从细菌中分离出能识别特定核苷酸序列，且切点专一的限制性内切酶，命名为HindⅡ。
Nathans用该酶降解病毒SV40DNA，排列了酶切图谱，从此，HindⅡ成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶。
限制性内切酶的发现促进了DNA重组技术的诞生，推动了基因工程的发展。
3.酶研究不仅深刻影响整个生物学领域，而且刺激了许多制药的研究，成为灵感的源泉。
20世纪以来，生物技术占据了相当重要的位置，而酶工程是它的一个重要分支。
生物技术已在工业、农业、医药食品等方面得到广泛应用。
作为生物工程的重要组成部分，酶工程研究日益受到医药保健工作者的重视。
二、酶学研究简史1. 酶的发现4 000多年前的夏禹时代酿酒已盛行；公元10世纪左右，我国已能用豆类做酱；约3 000年前，利用麦曲含有的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖，制造了饴糖。
人们认为1833年Payen和Person首先发现了酶。
法国的化学家和微生物学家巴斯德(Pasteur)于1857年在研究酒精发酵时提出了“酵素”的概念，应该说这是人们对酶的真正认识的开始。
第六章 酶工程制药
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
生物制药技术-第六章-酶工程制药(4,5,6,7)
在环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环 糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十 分相似，所以使得环糊精成为深受人们青睐的模型 分子，人们利用环糊精为酶模型已经对多种酶的催 化作用进行了模拟，在水解酶、转氨酶、核糖核酸 酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合 酶等方面都取得了巨大的进展，所模拟的胰凝乳蛋 白酶的催化效率与天然酶在同一数量级，该模拟酶 由β-环糊精和催化侧链组成，根据胰凝乳蛋白酶活 性部位由由Ser195、His57和Asp102组成的特件，在催 化侧链上接上羟基、咪唑基和羧基。β-环糊精具有 束缚底物的能力，而其催化侧链正好含有该酶的活 性部位的羟基、咪唑基和羧基，而且各基团所处的 位臵合适。由于模拟酶不含氨基酸，其热稳定性与 pH稳定性都大大优于天然酶。
--第四节，第五节，第六节，第七节
一、模拟酶的概念 酶是自然界经过长期进化而产生的高效生物催化 剂，它能在温和条件下高效专一地催化某些化学 反应，所以它的应用日趋广泛。但是，酶对热敏 感、稳定性差和来源有限等缺点限制了它 的大规 模开发和利用。设计一种像酶那样的高效催化剂 是科学家们一 直追求的目标之一，于是，新的催 化剂 人工模拟酶就逐渐被研制和开发了。
肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催 化活性的多肽，这是多肽合成的一大热点。 Atassi和Manshollri利用化学和晶体图像数据所提供 的主要活性部位残基的序列位臵和分隔距离，采用 表面刺激合成将构成酶活性部位位臵相邻的残基以 适当的空间位臵和取向 通过肽键相连，而分隔距 离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节，这样 就能模拟酶活性部位残基的空间位臵和构象。他们 所设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了 α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解 蛋白的活性分别与其模拟的酶相同。
酶工程制药
3
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（二）利用微生物生产酶制剂的优点
（1）能够生产酶的微生物种类繁 多，有较大的选择余地。 （2）微生物繁殖快、培养周期短、 培养方法简便，培养过程容易控 制， （3）微生物具有较强的适应性，能 够培育出新的高产菌株。
（三）各种能够生产酶的微生物
1、氧化-还原酶 （1）葡萄糖氧化酶 （2）D氨基酸氧化酶 （3）尿激酶 （4）过氧化氢酶 （5）近氧化物酶 2、转移酶 （1）转氨基酶 （2）核苷磷酸转移酶 3、水解酶 4、裂合酶 5、异构酶 （来源于霉菌） （来源于霉菌、肾脏） （来源于酵母菌、肾脏） （来源于细菌、霉菌、红血球） （来源于植物） （来源于细菌、动物肝脏） （来源于细菌）
C、常 用的吸 附剂
（2）离子结合法
A、离子结合法的优点----操作简单、处理条件温和，酶 的活性中心不容易被破坏。 B、离子结合法的缺点----载体和酶的结合力较弱、常常 发生酶脱落的现象
C、常用的离子结合剂 树脂----阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离 子交换剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸 附50-150mg酶蛋白。 DEAE-纤维素等
稳定性差 难于回收利用 产物分离纯化困难
（一）固定化酶的定义
• 固定化酶是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体 来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易 随水流失的固定化催化剂。 • 制备固定化酶的过程称为酶的固定化。
• 酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体 细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上的酶。
（二）固定化酶的特点
（1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生 物、分子工程手段加以改良。 （2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。 （3）反应以后，产物中不含酶，易于纯化。 （4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。 （5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。 （6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。
四个过程 1.自然酶的开发和应用 2.固定化酶和固定化细胞 3.多酶发应器 4.仿生技术
自然酶的开发和应用
从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶并 加以利用的阶段。
1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得了淀粉 酶，用作消化剂 1908年，德国的罗姆 (Rohm) 制得胰酶，用于皮革的软 化 1908年，法国的波伊登 (Boidin) 制得细菌淀粉酶，用 于纺织品的退浆 1911年，美国的华勒斯坦 (Wallerstein) 制得木瓜蛋白 酶，用于除去啤酒中蛋白质浑浊
大规模生产阶段
1949年，用液体深层培养法进行细菌a-淀粉酶 的发酵生产 50年代以后，酶制剂的生产转向微生物液体深 层发酵的方法 1960年，法国的雅各 (Jacob) 和莫诺德 (Monod) 提出了操纵子学说，阐明了酶生物合成 的调节机制
固定化酶和固定化细胞
固定化酶阶段
酶的不足之处：酶的稳定性差；只能使用一次
四、酶在疾病预防和治疗方面的应用
药用酶的特点 针对性强 疗效显著 副作用小
疾病诊断方面的应用 疾病治疗方面的应用 药物生产方面的应用 分析检测方面的应用
常用酶
蛋白酶 消化剂、消炎剂、治疗高血压 A-淀粉酶 消化药 脂肪酶 消化剂、预防和治疗高血脂
右旋糖酐酶 预防齵齿 溶菌酶 抗菌、消炎、镇痛 超氧化物歧化酶 抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护DNA、蛋白质 和细胞膜等免遭超氧负离子的破坏 L-天冬酰胺酶 预防癌症
1916年，美国的奈尔森 (Nelson) 和格里芬 (Griffin) 发现 吸附在骨炭上的酶仍具有催化活性 1953年，德国的格鲁布霍费(Grubhofer) 和施来斯(Schleith) 首先将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与重氮化聚氨 基苯乙烯树脂结合，制成固定化酶 1969年，日本的千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶 从DL-氨基酸生产L-氨基酸 1971年第一次国际酶工程学术会议在美国召开
•
活性炭 碳酸钙----每克载体能吸附1mg酶蛋白。 纤维素 多孔玻璃 酸性白土 漂白土 高岭石 氧化铝 硅胶 膨润土 羟基磷灰石 磷酸钙 金属氧化物----二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒，直径为 100-200um，每克载体能吸附17mg酶蛋白。 淀粉 谷蛋白 陶瓷 丁基葡聚糖凝胶 已基葡聚糖凝胶 单宁纤维素衍生物
（三）酶固定化的方法
1、载体结合法 2、交联法 3、包埋法 4、选择性热变性法
1、载体结合法
（1）物理吸附法 （2）离子结合法 （3）共价键结合法
（1）物理吸附法
A、物理吸附法的优点： （1）操作简单 （2）可选用不同的吸附剂 （3）酶失活之后，载体可以再生 B、物理吸附法的缺点： （1）酶的最适吸附量无规律可寻 （2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。
（2）交联法的类别和内容
• 类别
酶与酶交联法 酶与辅助蛋白交联法 吸附交联法 载体交联法
• 内容
分子内交联 分子间交联 酶与辅助蛋白分子之间交联 酶与载体之间交联
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子； a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
（3）共价键结合法
酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载 体表面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载 体上的方法。 A、共价键结合法的优点----酶与载体结合牢固，酶 不会发生脱落。 B、共价键结合法的缺点----操作复杂、反应条件苛 刻，酶的活性中心会遭到部分性的破坏。 C、常用的载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、 甲基丙烯醇共聚物
（3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂
• 参与交联的酶蛋白功能团 N-末端的α-氨基 赖氨酸的ε-氨基 酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 • 常用的交联剂 戊二醛 双重氮联苯胺-2、2-二磺酸 1、5-二氟-2、4-二硝基苯 已二酰亚胺二甲酯
双功能试剂： 常用的是戊二醛
O O H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H 戊二醛的两个醛基都能与游离的氨基反应，形成席夫碱 (Schiff) 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间 交联的固定化酶
第六章 酶工程制药
主要内容
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 概 述 酶的来源和生产 酶和细胞的固定化 固定化酶和固定化细胞的反应器 酶的人工模拟 酶的化学修饰 酶工程研究的进展
第一节
概述
一、酶工程简介 二、酶的特性 三、酶工程制药的内容
一、酶工程简介
酶工程的定义：
利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将 相应的原料转化成所需要的产品，它是酶学理论与 化工技术相结合而形成的一种新技术 ，也是利用 酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定功 能，借助于工程学手段来为我们提供产品的一门技 术。
醛糖还原酶的活性中心
酶的分类： 按酶催化反应的类型，可分成六大类：
氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂解酶类 异构酶类 连接酶类
三、酶工程制药的内容
药用酶的生产 药用酶：可用于预防和治疗疾病的酶 相关技术：发酵生产、分离纯化、分子修饰 酶法制药 定义：利用酶催化作用制造出具有药用功效 的物质的技术过程。 相关技术：催化反应、固定化、非水相催化
固定化细胞阶段
固定化菌体 (固定化死细胞)技术 (70年代初) 1973年，日本在工业上成功的利用固定化大肠杆菌菌体中的天 门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化细胞 (固定化活细胞或固定化增殖细胞技术(70年代末) 1978年，日本的铃木等人用固定化细胞生产a-淀粉酶研究成功 固定化原生质体技术 (80年代中期) 1986年开始，用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶、葡萄糖 氧化酶、谷氨酸脱氢酶等的研究相继取得成功
载体活化的方法：
重氮法：含有苯氨基的不溶性载体 叠氮法：含有酰肼基的不溶性载体 溴化氰法：含羟基的载体 烷基化法：含羟基的载体
2、交联法
（1）交联的优缺点 （2）交联法的类别和内容 （3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联 剂
（1）交联的优缺点
• 交联法是采用双功能、或者多功能试剂，使得酶与酶 之间发生交联的固定化方法。基团之间的交联通过共 价键结合。 • 交联法的优点----交联后的酶活性较高 • 交联法的缺点----反应条件剧烈、酶的回收率低。
3、水解酶
• 脂肪酶 5`-磷酸二酯酶 淀粉酶 果胶酶 纤维素酶 半纤维素酶 溶菌酶 蜜二糖酶 乳糖酶 转化酶 透明质酸酶 凝乳酶 天冬酰胺酶 脲酶 青霉素酰化酶 氨基酰化酶 橙皮苷酶 蛋白酶 （来源于细菌、霉菌、胰脏） （来源于霉菌） （来源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽） （来源于细菌、霉菌） （来源于霉菌、蘑菇） （来源于霉菌） （来源于细菌、鸡卵白） （来源于霉菌） （来源于细菌、霉菌） （来源于细菌、酵母） （来源于细菌、动物睾丸） （来源于霉菌、小牛胃、羊胃） （来源于细菌） （来源于豆科植物） （来源于细菌、霉菌） （来源于细菌、霉菌、牛肾脏） （来源于霉菌） （来源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果）
（一）来源类别
1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生 物中，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早 期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。 2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件 的限制。 3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶， 由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。 4、利用微生物生产酶制剂。
乳糖酶 治疗乳糖缺乏症 链激酶 治疗血栓性疾病 尿激酶 治疗血栓、肾病 纳豆激酶 治疗血栓
第三节
酶和细胞的固定化
• 一、固定化酶的制备 • 二、固定化细胞的制备 • 三、固定化方法与载体的选择依据 • 四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 • 五、固定化酶活力的测定方法
一、固定化酶的制备
酶的不足之处：
一、酶工程简介