第六章酶工程制药
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【管理资料】生物技术制药——第六章-酶工程制药汇编
➢ 主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶 等。
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
✓酶是生物细胞产生的、具有催化能力的
生物催化剂。
✓催化高效性 ✓专一性：结构专一性；立体异构专一性 ✓酶具有不稳 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅因子
辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
反应检测； c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酸酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
酶的来源
从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术
生物技术制药——第六章-酶工 程制药
酶工程简介
酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指 自然酶制剂在工业上的规模应用。
1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨
基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程
的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的 固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。
通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产 菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物 发酵法来生产。
酶的生产菌
作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而
且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产
生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
✓酶是生物细胞产生的、具有催化能力的
生物催化剂。
✓催化高效性 ✓专一性：结构专一性；立体异构专一性 ✓酶具有不稳 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅因子
辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
反应检测； c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酸酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
酶的来源
从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术
生物技术制药——第六章-酶工 程制药
酶工程简介
酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指 自然酶制剂在工业上的规模应用。
1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨
基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程
的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的 固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。
通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产 菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物 发酵法来生产。
酶的生产菌
作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而
且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产
生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
第六章酶工程制药
2021/3/12
第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
三、模拟酶的分类
按照模拟酶的属性
主-客体酶模型 胶束酶模型 肽酶 抗体酶 分子印迹酶模型 半合成酶
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
主-客体酶模型
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
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第六章酶工程制药
1
五、固定化方法与载体的选择依据
2、载体的选择
为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量 应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻 胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都 是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物 的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化 酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或粘度大，宜 采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以 便实现转化反应和回收固定化酶。
五、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择
⑴ 固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域 的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和 残留。尽可选择无毒性试剂。
⑵ 固定化酶在操作上中的稳定性：在选择固定化方法 时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反 复使用，在经济上有极强的竞争力。
⑶ 固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包 括水、电、气、设备和劳务投资等。
包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。 固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限 制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了 酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常 用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历 的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即 具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否 则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加 底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。
第6章 酶工程制药(二)
基因工程技术：通过基因工程技术对酶的基因进行改造和优化，提高酶的产量和稳定性
细胞培养技术：通过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞培养技术，在细胞内高效表达酶，提高酶的生产效率
发酵工程技术：利用微生物发酵技术，通过优化发酵条件，提高酶的产量和纯度
蛋白质工程技术：通过蛋白质工程技术，对酶的蛋白质结构进行改造和优化，提高酶的活性 和稳定性
酶的提取：从生物材料中分 离和纯化酶的过程
提取和纯化的方法：沉淀法、 色谱法、电泳法等
提取和纯化的目的：获得高纯 度、高活性的酶，用于药物研
发和生产
微生物发酵法：通过微生物发酵产生酶，是最常用的生产方式 基因工程法：通过基因工程技术生产酶，具有更高的生产效率和特异性 化学合成法：通过化学合成方法生产酶，但成本较高且难以大规模生产 提取法：从动植物或微生物中提取酶，但提取量有限且成本较高
酶的化学修饰：通过化学方法对酶进行修饰，改变酶的性质和功能 单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶的组合生物合成：通过组合生物合成技术，将不同酶的基因组合在一起， 形成具有新功能的酶
单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶工程在疾病诊断中的应用
蛋白质工程：通过基因工程技术对 酶的蛋白质结构进行改造，提高酶 的催化效率和稳定性
蛋白质与小分子结合：通过将小分 子与酶结合，改变酶的活性和选择 性
添加标题
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蛋白质进化：利用进化算法对酶进 行优化，提高酶的适应性和催化效 率
蛋白质与蛋白质结合：通过将不同 的酶结合在一起，形成具有协同作 用的复合酶
酶作为药物的诊断工具：酶可以作为药物的诊断工具，通过催化特定的化学反应，产生信号或 标记，用于诊断疾病或监测治疗效果。
酶工程制药课件
2.酶化学修饰的目的：
a.提高生物活性
胰蛋白酶 缬天天天天赖异缬甘
组
46
丝
S S
活性中心 缬天天天天赖 缬 异甘组 丝 S S
18 3
S S
S S
b.增强在不良环境中的稳定性 c.针对异体反应，降低生物识别能力
二、化学修饰的方法
化学修饰方法的几个问题 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条
哈尔滨医科大学 药学院生物制药教研室
第六章 酶工程制药
第五节三、进化酶
四、抗体酶
人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为 制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所 以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要 是为了解决酶的以上缺点。
2.酶分子内部修饰
3.结合定点突变的化学修饰
三、修饰酶的特性
1.热稳定性提高 2.抗各类失活因子能力提高 3.抗原性消除 4.体内半衰期延长 5.最适pH改变 6.酶学性质变化 7.对组织分布能力改变
四、酶化学修饰的应用
酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫 原性； 4.产生新的催化能力；
1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离 得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过 离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解 生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成 DL-乙酰氨基酸．再进行拆分。生产成本仅为用游离 酶生产成本的60％左右。
二硫键的化学修饰
氨基的化学修饰
生物技术制药——第六章 酶工程制药
2、酶的提取
3、酶的分离方法
4、酶的组合分离纯化策略
5、酶的浓缩、干燥与结晶
一、酶的分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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二、酶的提取
JY92-II D超声波
化学合成：固相合成多肽技术
早期酶的生产多以动植物为主要原料
植物提供的酶主要有： 蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动物组织提供的酶主要有：
胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的
凝乳酶等。
不适合大规模生产：动植物来源有限、生
产周期长，以及地理、气候和季节影响。
目前工业生产一般都以微生物为主要来源
酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测
定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
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(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病:
一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在
某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于 组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内 的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此， 可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断
和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后， 分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固 定化酶。 郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基 酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用 的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工 程以及整个生物工程中占有的重要作用, 它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子 等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。
酶工程制药
生命科学技术学院酶工程制药蛋白质蛋白质黑色素③①苯丙氨酸酪氨酸多巴儿茶酚胺（3，4二羟苯丙氨酸）苯丙酮酸尿黑酸甲状腺素②苯乳酸苯乙酸苯酮乙酰乙酸CO2+H2O图苯丙氨酸及酪氨酸代谢①苯丙氨酸羟化酶缺乏所导致苯丙酮尿症；②尿黑酸氧化酶缺乏所导致尿黑酸症；③酪氨酸酶缺乏所导致白化病。
一、酶与酶工程研究的重要意义1. 研究酶的理化性质及其作用机理，对于阐明生命现象的本质具有十分重要的意义酶是由细胞产生的具有催化能力的蛋白质。
新陈代谢是生命活动的最重要特征。
一切生命活动都是由代谢的正常运转来维持的，而生物体代谢中的各种化学反应都是在酶的作用下进行的。
酶是促进一切代谢反应的物质。
从生物大分子的结构与功能关系来说明生命现象的本质和规律，从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节，疾病、生长发育等的关系，无疑具有重大科学意义。
2. 酶是分子生物学研究的重要工具正是由于某些专一性工具酶的出现，才使核酸一级结构测定有了重要突破。
1970年，美国Smith等从细菌中分离出能识别特定核苷酸序列，且切点专一的限制性内切酶，命名为HindⅡ。
Nathans用该酶降解病毒SV40DNA，排列了酶切图谱，从此，HindⅡ成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶。
限制性内切酶的发现促进了DNA重组技术的诞生，推动了基因工程的发展。
3.酶研究不仅深刻影响整个生物学领域，而且刺激了许多制药的研究，成为灵感的源泉。
20世纪以来，生物技术占据了相当重要的位置，而酶工程是它的一个重要分支。
生物技术已在工业、农业、医药食品等方面得到广泛应用。
作为生物工程的重要组成部分，酶工程研究日益受到医药保健工作者的重视。
二、酶学研究简史1. 酶的发现4 000多年前的夏禹时代酿酒已盛行；公元10世纪左右，我国已能用豆类做酱；约3 000年前，利用麦曲含有的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖，制造了饴糖。
人们认为1833年Payen和Person首先发现了酶。
法国的化学家和微生物学家巴斯德(Pasteur)于1857年在研究酒精发酵时提出了“酵素”的概念，应该说这是人们对酶的真正认识的开始。
第六章 酶工程制药
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
生物技术制药(6)
• 离子结合法：通过离子键结合于具有离子交 换基的水不溶性载体上。多糖类离子交换剂、 合成高分子离子交换树脂。
• 优点：操作简单、处理条件温和、酶的高级 结构及活性中心氨基酸残基不易被破坏、回 收率较高。
• 缺点：载体与酶结合力弱、易受缓冲液种类 及pH影响、离子强度高的条件下酶易脱落。
• 共价结合法：酶（非活性部位：氨基、羧基、羟基、 咪唑基、巯基等）以共价键结合（重氮化、迭氮化、
• 只适合小分子底物和产物的酶。
• 网格型：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂 等，及天然高分子化合物。是固定化细胞最 常用、最有效的方法。
• 微囊型：颗粒比网格型小、利于底物与产物 的扩散、反应条件苛刻、成本高。
4）选择性热变性法 • 在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但酶不
变性，使酶固定于细胞内的方法。 • 专用于细胞固定化。
2、根据底物的物理性质 • 溶解性、浊液性——各种 • 颗粒状、胶状——CSTR、FBR、RCR 3、根据酶反应动力学特性选择 • 填充床式（平推流特性）——产物抑制酶 • 产物对反应抑制——PFR（PBR） • 底物对酶抑制——CSTR • CSTR——随搅拌速度加快而增加 • PFR——随流速加快而增加
• 管状固定化酶（酶管）：机械强度大、切 短用于填充床反应器、组装成列管式反应 器。
2、固定化酶的性质 1）酶活力的变化：下降 2）酶稳定性的变化：增加/降低（少） • 操作稳定性：T1/2＞1个月 • 贮藏稳定性：即用。加底物、产物、抑制剂、
防腐剂等 • 热稳定性：热稳定性高——工业意义大 • 对蛋白酶的稳定性：提高
• 酶的功能基团参与反应致活性中心结构改变、 酶活性降低
• 添加辅助蛋白（牛血清白蛋白）提高稳定性。
生物制药技术-第六章-酶工程制药(4,5,6,7)
在环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环 糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十 分相似，所以使得环糊精成为深受人们青睐的模型 分子，人们利用环糊精为酶模型已经对多种酶的催 化作用进行了模拟，在水解酶、转氨酶、核糖核酸 酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合 酶等方面都取得了巨大的进展，所模拟的胰凝乳蛋 白酶的催化效率与天然酶在同一数量级，该模拟酶 由β-环糊精和催化侧链组成，根据胰凝乳蛋白酶活 性部位由由Ser195、His57和Asp102组成的特件，在催 化侧链上接上羟基、咪唑基和羧基。β-环糊精具有 束缚底物的能力，而其催化侧链正好含有该酶的活 性部位的羟基、咪唑基和羧基，而且各基团所处的 位臵合适。由于模拟酶不含氨基酸，其热稳定性与 pH稳定性都大大优于天然酶。
--第四节，第五节，第六节，第七节
一、模拟酶的概念 酶是自然界经过长期进化而产生的高效生物催化 剂，它能在温和条件下高效专一地催化某些化学 反应，所以它的应用日趋广泛。但是，酶对热敏 感、稳定性差和来源有限等缺点限制了它 的大规 模开发和利用。设计一种像酶那样的高效催化剂 是科学家们一 直追求的目标之一，于是，新的催 化剂 人工模拟酶就逐渐被研制和开发了。
肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催 化活性的多肽，这是多肽合成的一大热点。 Atassi和Manshollri利用化学和晶体图像数据所提供 的主要活性部位残基的序列位臵和分隔距离，采用 表面刺激合成将构成酶活性部位位臵相邻的残基以 适当的空间位臵和取向 通过肽键相连，而分隔距 离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节，这样 就能模拟酶活性部位残基的空间位臵和构象。他们 所设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了 α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解 蛋白的活性分别与其模拟的酶相同。
酶工程制药
3
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
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青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
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6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
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4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
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酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
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许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
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B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
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• 2、特性
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二、酶工程简介
• 通过人工操作获得所需酶并使其发挥催 化功能的技术过程。 • 酶的生产与应用的技术过程。 • 包括生产1.药用酶: 治疗、预防疾病的 功效酶 2.酶法制药: 利用酶的催化功能经底物转化为药物 的过程
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• • 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新 的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。 • 酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工 业上的规模应用。 • • 1953年，Grubhoger 和 Schleith 提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化酶技术技术拆分了DL-氨基酸。
•
1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：
酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和 固定化酶的应用。
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• 现代酶工程的主要内容： • • a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发； b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、 反应检测；
•
• • • • •
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• 2、酶的生产菌 • （1）对菌种的要求： • a、产酶量高，酶的性质符合使用要求， 而且最好是产生胞外酶的菌； • b、不是致病菌，在系统发育上与病原体 无关，也不产生毒素； • c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； • d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易 于培养。
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（2）生产菌的来源：
a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；
b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产 酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都 是菌种采集地。
筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、 复筛和生产性能检定等。 菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、 基因转移和基因克隆。
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• 3）目前常用的产酶 微生物 • A、E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶， 经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、 天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半乳糖苷酶。 • B、枯草杆菌：主要用于生产α-淀粉酶、β-葡萄糖 氧化酶、碱性磷酸脂酶。 • C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包 等。 • D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、 蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶 和脂肪酶。 • E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉 菌等。
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• • • •
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•
4、酶和细胞的固定化载体 （1）吸附载体：无机物和有机物，见表6-1。 （2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶 （3）共价结合载体：纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺 多孔玻璃。 载体应具备的条件： （1）固定化过程中不引起酶变性； （2）对酸碱有一定的耐受性； （3）有一定的机械强度； （4）有一定的亲水性和稳定性； （5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀（6）共价结合时有可活化基 团； （7）有耐受酶和微生物细胞的能力： （8）廉价易得。 5、固定化酶的制备技术 （1）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混 合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。
早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋 白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周 期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余 种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是： A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生 物中得到； B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条 件来提高酶的产量； C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育 出新的高产菌珠。
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缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体 结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。 B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残 基不易被破坏。 缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高 时，酶易脱落。 C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能 团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。 缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失 活和产生空间位阻效应。 （2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交 联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的 交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。 （3）包埋法： A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合 物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、 海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。
c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；
d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
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第二节、酶的来源和生产菌
1、酶的来源： 酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。
（4）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和 聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填 充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。
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2、固定化酶的性质
（1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活 性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合 时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。 （2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程 度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相 互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常用半衰期表示，即酶 的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上 时，即具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。若 需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。 C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反 应温度和反应速度，提高效率。 D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所 提高。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。
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（3）酶学特性的变化
A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化， 其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。
(三)、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择 （1）固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的 检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。 （2）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操 作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。 （3）固定化的成本：：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、 设备和劳务投资等。 2、载体的选择 为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体， 如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等 都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大 分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大， 宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收 固定化酶。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
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• 2、特性
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二、酶工程简介
• 通过人工操作获得所需酶并使其发挥催 化功能的技术过程。 • 酶的生产与应用的技术过程。 • 包括生产1.药用酶: 治疗、预防疾病的 功效酶 2.酶法制药: 利用酶的催化功能经底物转化为药物 的过程
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• • 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新 的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。 • 酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工 业上的规模应用。 • • 1953年，Grubhoger 和 Schleith 提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化酶技术技术拆分了DL-氨基酸。
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1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：
酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和 固定化酶的应用。
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• 现代酶工程的主要内容： • • a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发； b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、 反应检测；
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• 2、酶的生产菌 • （1）对菌种的要求： • a、产酶量高，酶的性质符合使用要求， 而且最好是产生胞外酶的菌； • b、不是致病菌，在系统发育上与病原体 无关，也不产生毒素； • c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； • d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易 于培养。
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（2）生产菌的来源：
a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；
b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产 酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都 是菌种采集地。
筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、 复筛和生产性能检定等。 菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、 基因转移和基因克隆。
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• 3）目前常用的产酶 微生物 • A、E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶， 经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、 天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半乳糖苷酶。 • B、枯草杆菌：主要用于生产α-淀粉酶、β-葡萄糖 氧化酶、碱性磷酸脂酶。 • C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包 等。 • D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、 蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶 和脂肪酶。 • E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉 菌等。
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4、酶和细胞的固定化载体 （1）吸附载体：无机物和有机物，见表6-1。 （2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶 （3）共价结合载体：纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺 多孔玻璃。 载体应具备的条件： （1）固定化过程中不引起酶变性； （2）对酸碱有一定的耐受性； （3）有一定的机械强度； （4）有一定的亲水性和稳定性； （5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀（6）共价结合时有可活化基 团； （7）有耐受酶和微生物细胞的能力： （8）廉价易得。 5、固定化酶的制备技术 （1）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混 合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。
早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋 白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周 期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余 种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是： A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生 物中得到； B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条 件来提高酶的产量； C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育 出新的高产菌珠。
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缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体 结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。 B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残 基不易被破坏。 缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高 时，酶易脱落。 C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能 团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。 缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失 活和产生空间位阻效应。 （2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交 联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的 交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。 （3）包埋法： A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合 物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、 海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。
c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；
d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
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第二节、酶的来源和生产菌
1、酶的来源： 酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。
（4）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和 聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填 充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。
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2、固定化酶的性质
（1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活 性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合 时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。 （2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程 度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相 互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常用半衰期表示，即酶 的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上 时，即具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。若 需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。 C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反 应温度和反应速度，提高效率。 D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所 提高。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。
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（3）酶学特性的变化
A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化， 其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。
(三)、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择 （1）固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的 检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。 （2）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操 作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。 （3）固定化的成本：：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、 设备和劳务投资等。 2、载体的选择 为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体， 如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等 都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大 分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大， 宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收 固定化酶。