第六章酶工程制药
合集下载
【管理资料】生物技术制药——第六章-酶工程制药汇编
➢ 主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶 等。
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
✓酶是生物细胞产生的、具有催化能力的
生物催化剂。
✓催化高效性 ✓专一性：结构专一性；立体异构专一性 ✓酶具有不稳 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅因子
辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
反应检测； c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酸酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
酶的来源
从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术
生物技术制药——第六章-酶工 程制药
酶工程简介
酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指 自然酶制剂在工业上的规模应用。
1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨
基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程
的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的 固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。
通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产 菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物 发酵法来生产。
酶的生产菌
作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而
且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产
生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
✓酶是生物细胞产生的、具有催化能力的
生物催化剂。
✓催化高效性 ✓专一性：结构专一性；立体异构专一性 ✓酶具有不稳 酶
结合酶
（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。
辅因子
辅基 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂 金属离子作为辅助因子。
反应检测； c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究； d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究； e、有机相中酶反应的研究； f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； g、抗体酶、核酸酶的研究； h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。
酶的来源
从生物体中提取分离 化学合成：固相合成多肽技术
生物技术制药——第六章-酶工 程制药
酶工程简介
酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指 自然酶制剂在工业上的规模应用。
1953年，德国人提出了酶固定化技术 。 1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨
基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程
的主要内容： 酶的生产、分离纯化、酶的 固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。
通过各种遗传变异的手段，培育出新的高产 菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物 发酵法来生产。
酶的生产菌
作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而
且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产
生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
第六章酶工程制药
2021/3/12
第六章酶工程制药
14
第三节 酶的人工模拟
三、模拟酶的分类
按照模拟酶的属性
主-客体酶模型 胶束酶模型 肽酶 抗体酶 分子印迹酶模型 半合成酶
2021/3/12
第六章酶工程制药
15
第三节 酶的人工模拟
主-客体酶模型
2021/3/12
第六章酶工程制药
16
第三节 酶的人工模拟
2021/3/12
第六章酶工程制药
1
五、固定化方法与载体的选择依据
2、载体的选择
为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量 应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻 胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都 是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物 的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化 酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或粘度大，宜 采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以 便实现转化反应和回收固定化酶。
五、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择
⑴ 固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域 的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和 残留。尽可选择无毒性试剂。
⑵ 固定化酶在操作上中的稳定性：在选择固定化方法 时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反 复使用，在经济上有极强的竞争力。
⑶ 固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包 括水、电、气、设备和劳务投资等。
包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。 固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限 制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了 酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常 用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历 的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即 具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否 则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加 底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。
第六章酶工程制药
酶的生产菌
• 对菌种的要求： 1、产酶量、酶的性质、最好是胞外酶； 2、不是致病菌； 3、稳定，不易产生变异退化，不易感染 噬菌体； 4、能利用廉价的原料，发酵周期短，易 于培养。
生产菌的来源
• 菌种保藏机构、有关研究部门获得； • 从自然界中分离筛选（土壤、深海、
温泉、火山、森林都是菌种采集地）， 筛选包括菌样采集、菌种分离、初筛、 纯化、复筛、生产性能鉴定。 • 生产菌的改良，基因突变、基因转移、 基因克隆。
植物生长周期长、来源有限、受地理、气 候和季节等因素的影响，不适于大规模生 产。 • 目前工业化生产一般以微生物为主要来源。
微生物生产酶的优点
• 微生物种类繁多，动植物体内的酶在 微生物中几乎都可以找到；
• 繁殖快、生产周期短、培养简便、并 可以通过控制培养条件来提高产量；
• 微生物具有较强的适应性，通过各种 遗传变异手段能培育出新的高产菌株。
酶工程学的发展历程
• 20世纪20年代初：酶工程名称出现于自然 酶制剂在工业上的大规模应用；
• 1953年，羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶 和核糖核酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯 树脂进行固定。
• 1969年，固定化酶技术拆分DL-氨基酸 • 1971年，1st国际酶工程会议：酶的生产、
分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的 反应器、酶及固定化酶的应用等。
包埋法
• 网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙 烯醇和光敏树脂等合成高分子和淀粉、明 胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然高分 子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最 多、最有效的方法。
• 由包埋法制得的微囊型固定化酶通常为直 径几微米到几百微米的球状体，颗粒比网 格型要小得多，比较有利于底物与产物的 扩散，但是反应条件要求高，制备成本也 高。
第6章 酶工程制药(二)
基因工程技术：通过基因工程技术对酶的基因进行改造和优化，提高酶的产量和稳定性
细胞培养技术：通过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞培养技术，在细胞内高效表达酶，提高酶的生产效率
发酵工程技术：利用微生物发酵技术，通过优化发酵条件，提高酶的产量和纯度
蛋白质工程技术：通过蛋白质工程技术，对酶的蛋白质结构进行改造和优化，提高酶的活性 和稳定性
酶的提取：从生物材料中分 离和纯化酶的过程
提取和纯化的方法：沉淀法、 色谱法、电泳法等
提取和纯化的目的：获得高纯 度、高活性的酶，用于药物研
发和生产
微生物发酵法：通过微生物发酵产生酶，是最常用的生产方式 基因工程法：通过基因工程技术生产酶，具有更高的生产效率和特异性 化学合成法：通过化学合成方法生产酶，但成本较高且难以大规模生产 提取法：从动植物或微生物中提取酶，但提取量有限且成本较高
酶的化学修饰：通过化学方法对酶进行修饰，改变酶的性质和功能 单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶的组合生物合成：通过组合生物合成技术，将不同酶的基因组合在一起， 形成具有新功能的酶
单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶工程在疾病诊断中的应用
蛋白质工程：通过基因工程技术对 酶的蛋白质结构进行改造，提高酶 的催化效率和稳定性
蛋白质与小分子结合：通过将小分 子与酶结合，改变酶的活性和选择 性
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
蛋白质进化：利用进化算法对酶进 行优化，提高酶的适应性和催化效 率
蛋白质与蛋白质结合：通过将不同 的酶结合在一起，形成具有协同作 用的复合酶
酶作为药物的诊断工具：酶可以作为药物的诊断工具，通过催化特定的化学反应，产生信号或 标记，用于诊断疾病或监测治疗效果。
酶工程制药课件
2.酶化学修饰的目的：
a.提高生物活性
胰蛋白酶 缬天天天天赖异缬甘
组
46
丝
S S
活性中心 缬天天天天赖 缬 异甘组 丝 S S
18 3
S S
S S
b.增强在不良环境中的稳定性 c.针对异体反应，降低生物识别能力
二、化学修饰的方法
化学修饰方法的几个问题 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条
哈尔滨医科大学 药学院生物制药教研室
第六章 酶工程制药
第五节三、进化酶
四、抗体酶
人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为 制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所 以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要 是为了解决酶的以上缺点。
2.酶分子内部修饰
3.结合定点突变的化学修饰
三、修饰酶的特性
1.热稳定性提高 2.抗各类失活因子能力提高 3.抗原性消除 4.体内半衰期延长 5.最适pH改变 6.酶学性质变化 7.对组织分布能力改变
四、酶化学修饰的应用
酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫 原性； 4.产生新的催化能力；
1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离 得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过 离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解 生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成 DL-乙酰氨基酸．再进行拆分。生产成本仅为用游离 酶生产成本的60％左右。
二硫键的化学修饰
氨基的化学修饰
第六章酶工程制药
13
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
14
24
25
(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
17
18
19
20
21
• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
22
2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
14
24
25
(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
17
18
19
20
21
• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
22
2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
生物技术制药——第六章 酶工程制药
2、酶的提取
3、酶的分离方法
4、酶的组合分离纯化策略
5、酶的浓缩、干燥与结晶
一、酶的分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
25
二、酶的提取
JY92-II D超声波
化学合成：固相合成多肽技术
早期酶的生产多以动植物为主要原料
植物提供的酶主要有： 蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动物组织提供的酶主要有：
胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的
凝乳酶等。
不适合大规模生产：动植物来源有限、生
产周期长，以及地理、气候和季节影响。
目前工业生产一般都以微生物为主要来源
酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测
定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
15
(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病:
一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在
某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于 组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内 的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此， 可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断
和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后， 分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固 定化酶。 郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基 酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用 的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工 程以及整个生物工程中占有的重要作用, 它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子 等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。
第六章 酶工程制药
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
生物技术制药(6)
• 离子结合法：通过离子键结合于具有离子交 换基的水不溶性载体上。多糖类离子交换剂、 合成高分子离子交换树脂。
• 优点：操作简单、处理条件温和、酶的高级 结构及活性中心氨基酸残基不易被破坏、回 收率较高。
• 缺点：载体与酶结合力弱、易受缓冲液种类 及pH影响、离子强度高的条件下酶易脱落。
• 共价结合法：酶（非活性部位：氨基、羧基、羟基、 咪唑基、巯基等）以共价键结合（重氮化、迭氮化、
• 只适合小分子底物和产物的酶。
• 网格型：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂 等，及天然高分子化合物。是固定化细胞最 常用、最有效的方法。
• 微囊型：颗粒比网格型小、利于底物与产物 的扩散、反应条件苛刻、成本高。
4）选择性热变性法 • 在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但酶不
变性，使酶固定于细胞内的方法。 • 专用于细胞固定化。
2、根据底物的物理性质 • 溶解性、浊液性——各种 • 颗粒状、胶状——CSTR、FBR、RCR 3、根据酶反应动力学特性选择 • 填充床式（平推流特性）——产物抑制酶 • 产物对反应抑制——PFR（PBR） • 底物对酶抑制——CSTR • CSTR——随搅拌速度加快而增加 • PFR——随流速加快而增加
• 管状固定化酶（酶管）：机械强度大、切 短用于填充床反应器、组装成列管式反应 器。
2、固定化酶的性质 1）酶活力的变化：下降 2）酶稳定性的变化：增加/降低（少） • 操作稳定性：T1/2＞1个月 • 贮藏稳定性：即用。加底物、产物、抑制剂、
防腐剂等 • 热稳定性：热稳定性高——工业意义大 • 对蛋白酶的稳定性：提高
• 酶的功能基团参与反应致活性中心结构改变、 酶活性降低
• 添加辅助蛋白（牛血清白蛋白）提高稳定性。
生物制药技术-第六章-酶工程制药(4,5,6,7)
在环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环 糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十 分相似，所以使得环糊精成为深受人们青睐的模型 分子，人们利用环糊精为酶模型已经对多种酶的催 化作用进行了模拟，在水解酶、转氨酶、核糖核酸 酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合 酶等方面都取得了巨大的进展，所模拟的胰凝乳蛋 白酶的催化效率与天然酶在同一数量级，该模拟酶 由β-环糊精和催化侧链组成，根据胰凝乳蛋白酶活 性部位由由Ser195、His57和Asp102组成的特件，在催 化侧链上接上羟基、咪唑基和羧基。β-环糊精具有 束缚底物的能力，而其催化侧链正好含有该酶的活 性部位的羟基、咪唑基和羧基，而且各基团所处的 位臵合适。由于模拟酶不含氨基酸，其热稳定性与 pH稳定性都大大优于天然酶。
--第四节，第五节，第六节，第七节
一、模拟酶的概念 酶是自然界经过长期进化而产生的高效生物催化 剂，它能在温和条件下高效专一地催化某些化学 反应，所以它的应用日趋广泛。但是，酶对热敏 感、稳定性差和来源有限等缺点限制了它 的大规 模开发和利用。设计一种像酶那样的高效催化剂 是科学家们一 直追求的目标之一，于是，新的催 化剂 人工模拟酶就逐渐被研制和开发了。
肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催 化活性的多肽，这是多肽合成的一大热点。 Atassi和Manshollri利用化学和晶体图像数据所提供 的主要活性部位残基的序列位臵和分隔距离，采用 表面刺激合成将构成酶活性部位位臵相邻的残基以 适当的空间位臵和取向 通过肽键相连，而分隔距 离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节，这样 就能模拟酶活性部位残基的空间位臵和构象。他们 所设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了 α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解 蛋白的活性分别与其模拟的酶相同。
酶工程制药
3
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
例：6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。
CH2OH O OH
OH OH
OH
CH2OH
CH2OH
O OH
OH OH
6、合成酶类
合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、CN 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分 解反应相互偶联。
A + B + ATP === A-B + ADP + Pi
酶的高效性
以分子比表示，酶的催化反应的速度比非催化 反应高108—1020倍，比非酶催化剂高103— 1013倍。
专一性 只能作用于某一类或某一种特定物质。
反应条件温和 许多反应如无酶催化须在高温、高压、极端的 pH条件下才能进行，而以酶为催化剂则可在 常温、常压及中等的pH条件下进行。
反应可调节性
近代－－酶的发现
•1783年,意大利科学家司 帕拉扎尼（Spallazani）阐 明动物和人的胃液对肉块 的消化作用为化学变化而 非物理变化（如溶解）， 在“温和”的条件下实现， 这个作用还和温度、胃液 加量有关，且在体外是不 稳定的，活性会逐渐丧失。
19世纪，Pasteur和Liebig学术长期争论: 1857年，法国化学家和微生物学家Pasteur认为没 有生物则没有发酵。 德国化学家Liebig认为发酵是由化学物质引起的。 此争议由德国学者Buchner兄弟于1896年解决。
如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
CH3CHCOOH NAD+ OH
CH3CCOOH NADH H+ O
2、转移酶类
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基 团或原子转移到另一个底物的分子上，如如转甲基 酶、转氨基酶、已糖激酶、磷酸化酶等。
例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括 蛋白质和核酸。
三、酶的分类
1961年国际生化协会酶命名委员会根据酶 所催化的反应类型将酶分为六大类，即氧化 还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶类、 异构酶类和合成酶类。
1、氧化还原酶类
催化氧化-还原反应。
主要包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以 及加氧酶类。
第六章 酶工程制药
第一节 概述
一、酶的定义
定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的、受多 种因素调节控制的、具有催化能力的生物催化剂。
酶具有一般催化剂的特征： 1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反 应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低 活化能加快化学反应速度。
酶的特点： 高效性、专一性、反应条件温和、可调节性。
其优点如下： ❖ 微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。 ❖ 微生物繁殖快，生产周期短，成本低。 ❖ 微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过
适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新 的高产酶的菌株。
五、酶工程及其研究内容
酶工程：工业上有目的地设计一定的反应器和 反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下 催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于 其它目的的一门应用技术。广义地讲还包括酶 的生产、分离和纯化。
近代－－酶的化学本质
◆ 1926年美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结 晶，首次提出酶的蛋白质本质,并为此获得1947 年诺贝尔奖。
◆ 30年代，Northrops得到了胃蛋白酶、胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶的结晶。
酶是蛋白质???
酶表现出蛋白质性质：
◆ 酶是高分子胶体物质、两性电解质，在电场 中如蛋白质一样泳动; ◆ 导致蛋白质变性的因素如温度、pH、紫外线、 表面活性剂、重金属等往往也能使酶变性; ◆ 酶能被蛋白酶水解而失活。
1969年，Merrifield等人由氨基酸人工合成了具 有催化活性的酶RNase，进一步证实了酶的蛋白 质本质。
•1982 美国的切克（Cech）发现具有催化功能 的RNA，即四膜虫的26s rRNA具有催化自我剪切 能力，并命名为核酶(ribozyme) 。
• 这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟 了酶学研究的新领域，Cech 因此获得1986 诺贝 尔奖。
• 德国巴克纳(Buchner)兄弟用石英砂磨碎酵 母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并 证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵， 说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发 酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得 了1911年诺贝尔化学奖。
1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这 个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。
例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。
丙酮酸 + CO2 草酰乙酸
四、酶的来源和生产
1 、直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯 不足：生产周期长，来源有限，还要受一些自然 条件的限制。
2、化学合成方法 不足：一般只适用于短肽的生产。
3、 工业微生物发酵
通过液体深层发酵或固态发酵细菌，从细菌中 获得酶，是工业上酶的主要来源。
酶浓度的调节 共价修饰调节 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 抑制剂的调节 反馈调节 金属离子和其他小分子化合物的调节
二、酶学研究历史回顾
古代
最早酶的利用： 食品加工：面包，酒，醋及奶酪等。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 商代，BC 1300，“酒池肉林”。 酿醋出现的时间几乎和酿酒同步。 公元前12世纪周朝，酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。
4、裂解酶类
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成 双键的反应及其逆反应。
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。
例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。
HOOCCH=CHCOOH H2O
HOOCCH2CHCOOH OH
5、异构酶类
异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分 子内基团或原子的重排过程。如消旋酶、顺反异构 酶等。
CH2
O
CH3CCOOH HOOCCH2CH2CHCOOH
O
NH2
3、水解酶类
水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：
R COOCH2CH3 H2O RCOOH CH3CH2OH