第六章酶工程制药
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酶工程 第六章酶与细胞固定化 第二节酶和菌体固定化
第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。
酶工程制药课件
2.酶化学修饰的目的：
a.提高生物活性
胰蛋白酶 缬天天天天赖异缬甘
组
46
丝
S S
活性中心 缬天天天天赖 缬 异甘组 丝 S S
18 3
S S
S S
b.增强在不良环境中的稳定性 c.针对异体反应，降低生物识别能力
二、化学修饰的方法
化学修饰方法的几个问题 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条
哈尔滨医科大学 药学院生物制药教研室
第六章 酶工程制药
第五节三、进化酶
四、抗体酶
人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为 制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所 以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要 是为了解决酶的以上缺点。
2.酶分子内部修饰
3.结合定点突变的化学修饰
三、修饰酶的特性
1.热稳定性提高 2.抗各类失活因子能力提高 3.抗原性消除 4.体内半衰期延长 5.最适pH改变 6.酶学性质变化 7.对组织分布能力改变
四、酶化学修饰的应用
酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫 原性； 4.产生新的催化能力；
1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离 得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过 离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解 生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成 DL-乙酰氨基酸．再进行拆分。生产成本仅为用游离 酶生产成本的60％左右。
二硫键的化学修饰
氨基的化学修饰
第六章酶工程制药
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B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
生物技术制药——第六章 酶工程制药
2、酶的提取
3、酶的分离方法
4、酶的组合分离纯化策略
5、酶的浓缩、干燥与结晶
一、酶的分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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二、酶的提取
JY92-II D超声波
化学合成：固相合成多肽技术
早期酶的生产多以动植物为主要原料
植物提供的酶主要有： 蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。
动物组织提供的酶主要有：
胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的
凝乳酶等。
不适合大规模生产：动植物来源有限、生
产周期长，以及地理、气候和季节影响。
目前工业生产一般都以微生物为主要来源
酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测
定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
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(1)根据体内酶活力的变化诊断疾病:
一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在
某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于 组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内 的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此， 可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断
和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后， 分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核酸核糖酶等结合，制成固 定化酶。 郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基 酸，实现了酶应用史上的一大变革，开辟了固定化酶工业化应用 的新纪元。这时人们已经预感到了固定化酶以后可以在现代酶工 程以及整个生物工程中占有的重要作用, 它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子 等领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力。
第六章 微生物与酶制剂
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶 液称为宏观环境。
固定化酶制备的一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定
性研究、改进。
1． 四大类方法：
吸附法（包括电吸附法）
结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
各类固定化方法的特点比较:
其他品种
三． 四． 五． 六． 七． 八． 九． 十． ß -淀粉酶 葡聚糖酶 转苷酶 果胶酶 蛋白酶 木聚糖酶 脂肪酶 纤维素酶
用途 食品加工 业
作用 1生产麦芽糖 2果汁提取 3生产高甜天冬精 4生产果聚糖 5果实防霉 1降解纤维素 2分解地下水污染物-三氯乙烯 3纸浆漂白及废糖蜜水处理 4原油脱硫，降低空气污染 1生产丙烯酰胺 2在特殊条件下将煤转变为液 体燃料 1用于诊断心脏病和肝病 2用于分析血清中的尿酸浓度 3用于测定血清中的胆红素水 平
五、 酶制剂在饲料工业中应用
酶作为饲料添加剂的研究及应用发展很快，范 围也越来越广。酶制剂由单一型转向复合型， 多种酶搭配使用，起到互补作用，效果更加显 著。进一步开发活性强、价位低的专用酶制剂 是发展的一个趋势。 酶制剂具有作用效果显著、效益高、安全无毒， 能够最大限度地提高饲料的利用率和消化率， 增加某些有限制用量的饲料原料的使用，进一 步扩大非常规饲料资源的开发，促进动物的生 长，减少动物体内氮、磷及矿物质的排泄量， 减轻对环境的污染。在可持续发展的农业中， 最有效地使用非常规饲料和当地的饲料资源具 有重大意义。
葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。
用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。 葡萄糖
葡萄糖异构酶
果糖
果葡糖浆
酶工程制药BETA
高效合成。同时，通过对发酵过程的优化和控制，可以提高产物的纯度
和收率。
03
酶工程制药工艺流程
原料选择与预处理
原料选择
选择适合酶催化反应的底物，如生物 大分子、有机小分子等，确保原料的 纯度和质量。
预处理
对原料进行必要的预处理，如破碎、 溶解、除杂等固定化技术
固定化方法
酶的固定化可以通过物理吸附、化学交联、包埋法等方法实现， 将酶固定在载体上，提高酶的稳定性和重复使用性。
固定化酶的性质
固定化酶具有与游离酶相似的催化活性，同时具有良好的稳定性、 可重复使用性和易于与产物分离等优点。
固定化酶的应用
固定化酶在药物合成中可以用于连续反应、多步反应和固定床反应 器等，提高药物合成的效率和经济性。
血管紧张素转化酶抑制剂 生产
利用酶工程技术改进血管紧张素转化酶抑制 剂生产工艺，提高产量和纯度。采用固定化
酶技术降低生产成本和简化操作。
06
酶工程制药挑战与解决方案
技术挑战及应对策略
酶的表达与纯化
提高酶的表达水平，优化纯化方法，以获得高纯度、高活性的酶 制剂。
酶的固定化与修饰
研究新的固定化方法和修饰技术，提高酶的稳定性、选择性和催化 效率。
性、密封性等因素。
操作方法和注意事项
发酵罐操作前应检查设备是否完好，对培养基和接种物进行预处理，控 制好温度、pH、溶氧等参数，避免污染和发酵异常。
离心机操作前应检查设备是否平衡，选择合适的转子和转速，控制好进 料速度和分离时间，避免设备过载和酶活性损失。
层析柱操作前应选择合适的层析介质和缓冲液，对样品进行预处理，控 制好流速和洗脱条件，避免层析柱堵塞和酶活性损失。同时应注意设备 的清洗和保养，以延长使用寿命。
第六章 酶工程制药
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶； （b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
四、简答、论述 1.为什么工业生产酶以微生物作为主要原 料？ 2.优良的产酶菌应具备哪几点要求？ 3.固定化酶的常用方法有哪些？ 4.解释固定化酶活力大都下降的原因。 5.举例说明如何选择固定化酶的方法。
第三节固定化酶和固定化细胞的反应器
酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的 反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催 化反应的速度。 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
（6）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近
酶分子，导致酶的专一性发生改变。
3、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
五、固定化酶（细胞）的评价指标
(1)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测
三、酶的生产菌种
※1.对菌种的要求
一个优良的菌种应具备以下几点要求：
（1）繁殖快、产酶量高、酶的性质应符合使用要求， 最好是产胞外酶的菌； （2）不是病原菌，也不产生有毒物质；
（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌 体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
第六章酶工程制药
工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶， 工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是 微生物发酵法生产的。其特点是： 微生物发酵法生产的。其特点是： A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都能从微生物中得 、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶， 到； B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提 、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便， 高酶的产量； 高酶的产量； C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的 、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段， 高产菌珠。 高产菌珠。
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第二节、 第二节、酶的来源和生产菌 1、酶的来源： 、酶的来源： 提取分离、 提取分离、 化学合成、 化学合成、 细胞培养、 细胞培养、 微生物发酵
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酶的生产目前多以直接从生物体中提取分离。 酶的生产目前多以直接从生物体中提取分离。 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、 木瓜蛋白酶。 年来， 木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、 年来 研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、 成本高。 成本高。
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第三节、 细胞、 第三节、酶、细胞、原生质体的固定化
（一）固定化酶的制备 固定化酶（ enzyme）的定义: 1971年 1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:（1971年）指限制或固定于特 定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即 运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固 酶的固 定化。固定化所采用的酶 固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或 定化 固定化所采用的酶 细胞碎片上的酶或酶系。 2、固定化酶的特点 （1）可以多次使用，酶的稳定性提高； （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制； （4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少； （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。 3、酶和细胞的固定化方法 载体结合法： （1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。 物理吸附法： A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。 优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定 优点 化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。
生物技术制药(6)
• 离子结合法：通过离子键结合于具有离子交 换基的水不溶性载体上。多糖类离子交换剂、 合成高分子离子交换树脂。
• 优点：操作简单、处理条件温和、酶的高级 结构及活性中心氨基酸残基不易被破坏、回 收率较高。
• 缺点：载体与酶结合力弱、易受缓冲液种类 及pH影响、离子强度高的条件下酶易脱落。
• 共价结合法：酶（非活性部位：氨基、羧基、羟基、 咪唑基、巯基等）以共价键结合（重氮化、迭氮化、
• 只适合小分子底物和产物的酶。
• 网格型：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂 等，及天然高分子化合物。是固定化细胞最 常用、最有效的方法。
• 微囊型：颗粒比网格型小、利于底物与产物 的扩散、反应条件苛刻、成本高。
4）选择性热变性法 • 在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但酶不
变性，使酶固定于细胞内的方法。 • 专用于细胞固定化。
2、根据底物的物理性质 • 溶解性、浊液性——各种 • 颗粒状、胶状——CSTR、FBR、RCR 3、根据酶反应动力学特性选择 • 填充床式（平推流特性）——产物抑制酶 • 产物对反应抑制——PFR（PBR） • 底物对酶抑制——CSTR • CSTR——随搅拌速度加快而增加 • PFR——随流速加快而增加
• 管状固定化酶（酶管）：机械强度大、切 短用于填充床反应器、组装成列管式反应 器。
2、固定化酶的性质 1）酶活力的变化：下降 2）酶稳定性的变化：增加/降低（少） • 操作稳定性：T1/2＞1个月 • 贮藏稳定性：即用。加底物、产物、抑制剂、
防腐剂等 • 热稳定性：热稳定性高——工业意义大 • 对蛋白酶的稳定性：提高
• 酶的功能基团参与反应致活性中心结构改变、 酶活性降低
• 添加辅助蛋白（牛血清白蛋白）提高稳定性。
第6章 酶工程制药(二)
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5. 印迹酶
分子印迹：制备对某一特定分子具有选择性的聚 合物的过程。该特定分子称为印迹分子或模板。
（1）分子印迹的原理 分子印迹的过程：
1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补 作用，形成印迹分子功能单位复合物。
2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚 合反应，形成交联的聚合物。
➢ 由几个D-(+)-吡喃葡萄糖残基通过α-1，4糖苷键连 接而成。每个葡萄糖残基呈现椅式构象，整个分子
类似环柱形分子，由于环糊精分子空穴边缘有许多 羟基，能溶于水，空穴内基本是疏水的。
➢ 环糊精催化的特点是：参与反应的底物分子先被环 糊精分子包接，再于其发生反应，与酶促反应十分 相似，已模拟了转氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。
3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有 选择性的聚合物。
精选课件ppt
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（2）印迹分子与单体相互作用的类型
印迹方法：共价分子印迹和非共价分子印迹。
非共价分子印迹：首先是印迹分子与功能单位相 混合，二者以非共价键发生反应，然后功能单位 与交联剂发生共聚合，形成高交联的刚性聚合物， 最后使印迹分子从聚合物上脱离，并留下一个在 形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别 部位。
5、前景
酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可 以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应 选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程 法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰 法等，使酶的性质进一步改善。
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第六节 酶工程研究的进展
一、有机相的酶反应 20世纪80年代中期，A. M. Klibanov等人打
生物制药技术-第六章-酶工程制药(4,5,6,7)
在环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环 糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十 分相似，所以使得环糊精成为深受人们青睐的模型 分子，人们利用环糊精为酶模型已经对多种酶的催 化作用进行了模拟，在水解酶、转氨酶、核糖核酸 酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合 酶等方面都取得了巨大的进展，所模拟的胰凝乳蛋 白酶的催化效率与天然酶在同一数量级，该模拟酶 由β-环糊精和催化侧链组成，根据胰凝乳蛋白酶活 性部位由由Ser195、His57和Asp102组成的特件，在催 化侧链上接上羟基、咪唑基和羧基。β-环糊精具有 束缚底物的能力，而其催化侧链正好含有该酶的活 性部位的羟基、咪唑基和羧基，而且各基团所处的 位臵合适。由于模拟酶不含氨基酸，其热稳定性与 pH稳定性都大大优于天然酶。
--第四节，第五节，第六节，第七节
一、模拟酶的概念 酶是自然界经过长期进化而产生的高效生物催化 剂，它能在温和条件下高效专一地催化某些化学 反应，所以它的应用日趋广泛。但是，酶对热敏 感、稳定性差和来源有限等缺点限制了它 的大规 模开发和利用。设计一种像酶那样的高效催化剂 是科学家们一 直追求的目标之一，于是，新的催 化剂 人工模拟酶就逐渐被研制和开发了。
肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催 化活性的多肽，这是多肽合成的一大热点。 Atassi和Manshollri利用化学和晶体图像数据所提供 的主要活性部位残基的序列位臵和分隔距离，采用 表面刺激合成将构成酶活性部位位臵相邻的残基以 适当的空间位臵和取向 通过肽键相连，而分隔距 离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节，这样 就能模拟酶活性部位残基的空间位臵和构象。他们 所设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了 α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解 蛋白的活性分别与其模拟的酶相同。
酶工程制药
3
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
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青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
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3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
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青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
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6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
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4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
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酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
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许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
酶工程制药实用技术
酶工程制药实用技术随着生物技术的迅速发展，酶工程制药技术已经成为制药行业的重要支柱。
酶是一种生物催化剂，可以加速各种生物化学反应，因此酶工程制药技术利用酶的特性，在制药工业中发挥重要作用。
本文将详细介绍酶工程制药技术的原理、实用技术及其在实践中的应用效果和未来发展前景。
一、酶工程制药技术简介酶工程制药技术是指利用酶或微生物细胞作为生物催化剂，在体外合成或改造药物分子的一种技术。
该技术运用酶的特性和催化效率，在制药工业中生产、修饰和优化药物，为药物研发和生产提供了新的途径。
二、酶工程制药技术原理酶工程制药技术的基本流程包括：1、酶的筛选和鉴定：从自然界中筛选出具有特定催化功能的酶，鉴定其性质和作用机理。
2、酶的克隆和表达：将筛选出的酶基因克隆到表达载体中，实现大量生产。
3、药物合成：利用酶的催化作用，在体外合成药物分子。
4、药物修饰和优化：通过酶的修饰作用，改善药物分子的药效和稳定性等性质。
5、产品分离和纯化：将合成的药物分子分离、纯化，以备临床应用。
三、酶工程制药实用技术1、固定化酶技术：将游离酶固定在特定介质上，以提高酶的稳定性和可回收性，降低生产成本。
2、酶的修饰和改造：通过基因工程技术对酶进行修饰和改造，提高酶的催化效率和药物分子的产量。
3、全细胞生物转化：利用完整微生物细胞进行催化反应，实现多步生物化学反应的连续进行。
四、酶工程制药技术应用案例分析以β-干扰素的生产为例，传统生产方法主要采用化学合成法，但该方法步骤繁琐、产率较低。
采用酶工程制药技术，可以在短时间内实现大量生产，且产物纯度高、安全性好。
具体应用如下：1、酶的筛选：从微生物中筛选出具有β-干扰素类似物生产能力的酶。
2、酶的克隆和表达：将筛选出的酶基因克隆到表达载体中，在大规模发酵罐中进行表达。
3、β-干扰素的合成和修饰：利用固定化酶技术和全细胞生物转化技术，实现β-干扰素的高效合成与修饰。
4、产品分离和纯化：通过高效液相色谱等分离纯化技术，将合成的β-干扰素进行分离、纯化，得到高纯度的产品。
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
三、模拟酶的分类
按照模拟酶的属性
主-客体酶模型 胶束酶模型 肽酶 抗体酶 分子印迹酶模型 半合成酶
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
主-客体酶模型
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
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第六章酶工程制药
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五、固定化方法与载体的选择依据
2、载体的选择
为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量 应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻 胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都 是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物 的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化 酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或粘度大，宜 采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以 便实现转化反应和回收固定化酶。
五、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择
⑴ 固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域 的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和 残留。尽可选择无毒性试剂。
⑵ 固定化酶在操作上中的稳定性：在选择固定化方法 时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反 复使用，在经济上有极强的竞争力。
⑶ 固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包 括水、电、气、设备和劳务投资等。
包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。 固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限 制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了 酶构型的牢固程度。 A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常 用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历 的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即 具有工业应用价值。 B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否 则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加 底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。
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第六章酶工程制药
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C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大，热稳 定性高，可以提高反应温度和反应速度，提高效率。 D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋 白酶耐受力有所提高，可能的原因是由于空间位阻效 应是蛋白酶不能进入固定化酶内部。
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第六章酶工程制药
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第六章酶工程制药
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2、固定化酶的性质
⑴ 酶活力的变化
酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活 性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构 发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋 法中还有底物与产物扩散阻力增大。
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⑵ 酶稳定性的变化
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第三节 酶的人工模拟
三、模拟酶的分类
根据Kirby分类法
单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来 重建和改造酶活性。 机制酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和 过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成 单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化 活性的简单分子。
胶、咪唑基、羧基。
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⑶ 酶学特性的变化：
A、底物专一性：对底物的专一性下降。 B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲
线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质 有关。 C、最适温度：一般升高，原因是固定化后空间结构更为 稳定。 D、米氏常数（Km）：Km值均发生变化，有的增加很小 ，有的增加很大，但不会变小。 E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不定。
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
一、模拟酶的概念
人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方 法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模 拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构 上比天然酶相对简单。
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第三节 酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
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⑶ 膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联 在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大， 渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。 目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶、脲酶等 酶膜。
⑷管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙， 聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联的酶管。 酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也 可组装成列管反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、 脲酶等酶管。
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六、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状
⑴ 颗粒状：包括酶株、酶块、酶片、酶粉、每种固定 化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化 效率高，使用各种反应器。
⑵ 纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混 合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转 化效率高，但只适合于填充床反应器。此外，纤维酶可 以织成酶布用于填充床反应器。
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第三节 酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
主客体化学和超分子化学
Cram把主体与客体通过配位键或其他次级键形 成稳定复合物的化学领域称为主-客体化学。本质上 ，主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作 用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排 列的互补。
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
主客体化学和超分子化学
超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结 合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢键和范 德华力等，当接受体与络合离子或分子结合成稳定 的、具有稳定结构和性质的实体时，即形成了超分 子。它兼具分子识别、催化和选择输出的功能。
稳定过渡态理论
主客体化学和超分子化学
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第六章酶工程制药
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第三节 酶的人工模拟
二、模拟酶的理论基础
稳定过渡态理论
酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定 反应的过渡态（TS），降低反应活化能，从而加快 反应速度。模拟酶要和酶异养能够在结合底物的过 程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低 反应的活化能。