【家蚕幼虫黄白血液蛋白差异的双向电泳分析】石蚕幼虫

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家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析

家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析

家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析黄志君;邓小娟;陈芳艳;母培强;杨婉莹;钟仰进;夏庆友;曹阳【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2007(33)2【摘要】分析了家蚕在变态期不同发育时段中肠组织蛋白表达差异的信息。

SDS-PAGE电泳分析显示,从家蚕吐丝前1 d到化蛹72 h的中肠蛋白分离到相对明显的16条泳带,其中分子量约为30、45、70 kD的蛋白组分含量较大,且比较稳定,分子量约为50、60、62 kD的蛋白组分在不同时期存在着显著的表达差异。

进而通过聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分析,发现家蚕中肠组织蛋白的表达种类和差异蛋白数目的变化在化蛹1~3 d非常明显:蛋白表达种类的变化呈现2个高峰,分别为化蛹0 h 和化蛹41 h;差异蛋白数目的变化呈现3个波峰,分别在吐丝98 h至化蛹0 h、化蛹30~41 h和化蛹41~58 h。

在化蛹1~3 d,这种显著峰值变化的时期刚好与家蚕中肠组织发生旧肠壁细胞退化死亡和新生肠壁细胞分化增殖的盛期相吻合,从一个侧面反映了家蚕中肠组织在变态期活跃的发育进程。

【总页数】9页(P207-215)【关键词】家蚕;变态期;中肠组织;蛋白表达差异【作者】黄志君;邓小娟;陈芳艳;母培强;杨婉莹;钟仰进;夏庆友;曹阳【作者单位】华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系;西南大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S881.2;Q51【相关文献】1.家蚕中肠与丝腺变态发育的组织切片观察 [J], 黄志君;钟仰进;邓小娟;贺湘仁;梁红;潘忠2.家蚕感染质型多角体病毒(BmCPV)后中肠组织差异蛋白质分析 [J], 高坤;邓祥元;裘智勇;覃光星;郭锡杰3.大鼠发育不同时期脊髓中PNP-43的表达/Tropic1808基因表达蛋白的免疫组织化学研究/胚鼠腹侧中脑组织联合胚肾组织脑内移植治疗帕金森病的实验研究 [J],4.浓核病毒(镇江株)感受性家蚕品种中肠组织不同部位蛋白质比较分析 [J], 郭锡杰;蒋云峰;裘智勇;刘挺;覃光星;沈兴家5.浓核病毒感染早期家蚕血液、中肠蛋白表达差异比较分析 [J], 裘智勇;赵巧玲;李木旺;沈兴家;郭锡杰因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

家蚕卵、幼虫期蛋白SDS-PAGE电泳观察

家蚕卵、幼虫期蛋白SDS-PAGE电泳观察

家蚕卵、幼虫期蛋白SDS-PAGE电泳观察
王叶元;刘京;秦获;倪惠波;林健荣
【期刊名称】《广东蚕业》
【年(卷),期】2006(040)002
【摘要】1)蚕卵催青期的蛋白电泳图谱,1至7天基本无很大变化,到第8、9日,蛋白变化才明显.2)一至三龄整条蚕跑出来的蛋白带数少且不清晰.大蚕剔除中肠内桑叶后,蛋白条带多且较清晰.四至五龄蚕血蛋白质条带有一定的变化.3)同一天不同组织取样处理,蛋白质带数及成分有差异.
【总页数】5页(P16-20)
【作者】王叶元;刘京;秦获;倪惠波;林健荣
【作者单位】华南农业大学蚕丝科学系,广州,510640;华南农业大学蚕丝科学系,广州,510640;华南农业大学蚕丝科学系,广州,510640;华南农业大学蚕丝科学系,广州,510640;华南农业大学蚕丝科学系,广州,510640
【正文语种】中文
【中图分类】S8
【相关文献】
1.广州管圆线虫Ⅴ期幼虫蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立和优化 [J], 宋增梅;黄慧聪;潘长旺
2.家蚕蛹变态期蚕血蛋白的SDS-PAGE电泳分析 [J], 黄志君;母培强;钟仰进;曹阳
3.家蚕蛹到蛾期蛋白 SDS-PAGE电泳观察 [J], 王叶元;秦获;刘京;倪惠波;林健荣;钟杨生
4.应用SDS-PAGE观察顺式氯氰菊酯对斯氏按蚊和嗜人按蚊成蚊血淋巴与幼虫蛋白的影响 [J], 李凤舞;王蓬文;叶炳辉
5.家蚕卵和幼虫、蛹、蛾血液蛋白成分的电泳观察与比较 [J], 张剑韵;黄龙全;徐永镇
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双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用

双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用

双向电泳法在家蚕蛋白质分离中的应用家蚕(Bombyxmori)是蚕类动物,是家养和蚕桑人类居住地区诸多蚕类中最重要的家畜,因其十分多样的蛋白质,被广泛用于分离及分析研究,如比较微生物的蛋白质组成和药物研究。

双向电泳法(SDS-PAGE)是一种用于分离家蚕蛋白质的广泛应用的方法。

它可以分离家蚕的多种蛋白质,以精确的分子量为结果,以其灵活的分离能力为科学家们提供研究机会。

原理双向电泳法(SDS-PAGE)是一种流动态电泳法(IEF),它可以分离不同大小的蛋白质。

它主要是利用电流来分离,譬如蛋白质悬浮液或者凝胶中的物质可以被电流所吸引,并被向前或向后推进,最终形成各个分离峰,从而实现按不同分子量进行电泳分离。

家蚕蛋白质的电泳分离可以通过添加一种叫做聚脂酰胺的表面活性剂。

聚脂酰胺可以在原有的和电流的作用下,使蛋白质在家蚕蛋白质电泳分离过程中变得更加稳定,从而提高分离的效率。

过程家蚕蛋白质的双向电泳分离一般以室温下进行。

蛋白质悬浮液或凝胶放入电泳室,连接电极,然后开启电源,开启正负电流,使每个组分移动不同的方向,这样便能有效地进行分离,最后得到家蚕蛋白质的分离曲线。

家蚕蛋白质电泳后,蛋白带的形态可以通过遗传自动染色法来确定,并利用紫外分光光度计来检测它们的浓度。

在染色过程中,可以将家蚕蛋白带的形态和分子量相匹配,从而确定它们的分子量。

优势双向电泳法(SDS-PAGE)利用它的灵活性,可以分离出家蚕蛋白质的多种组分,精确的分子量,并根据它们的浓度、形态及分子量进行精确分离。

它具有高灵敏度,分离过程快捷,可以进行大量分离,节省时间,实验简便,操作安全,分离的结果准确。

它的分离能力与其他传统的分离方法相比具有明显的优势,可以更好地满足实验室的日常需求。

缺点家蚕蛋白质电泳分离中,双向电泳法(SDS-PAGE)不是完美的。

它只能分离出家蚕蛋白质的一部分,并不能分离出所有种类的蛋白质,可能会遗漏一些重要的分子,还可能会出现分离的结果不准确的情况,因此使用双向电泳法进行分离时,需要进行大量的核酸和蛋白质分析,以更准确的分析出家蚕蛋白质的组成成分。

家蚕卵_幼虫期蛋白sds_page电泳观察

家蚕卵_幼虫期蛋白sds_page电泳观察

图 谱 和 幼 虫 蛋 白质
,
过 其所 编码 的 产 物
— 才能最后得 到 阐 明
图谱 通 过 比较 家蚕 卵 发 育过
程 和 幼 虫 发 育 过 程 中差 异 蛋 白带 的 变 化 条染 色 体
家 蚕 基 因组 共 有
为 今 后 进 一 步 从分 子 水 平 阐明 家蚕 个 体发
家蚕 卵
,
幼 虫期 蛋 白

大 蚕 的血 液蛋 白图谱 条 带清 晰
.
卵 特 异 蛋 白是家蚕 卵 中所 特 有 的蛋 白
以 清楚地 看 到 在 生 长 发 育 过程 中血液 蛋 白
的结 果 相 似
,
.
这 和 我 们 的 所作 的 观 察 到 处 的蛋 白带 在
,
一 至 三 龄 整 条蚕 电泳 结 果 并 不 是很理

.
但 未 查 到 相 关报 道
,
.
大蚕剔 除 中肠 内
,
这两 天 的 确减少 了 很 多
只 是减 少 了而 已
但是 不会 消失
的桑 叶 很多
.
蛋 白 电 泳结 果 比 整 条 蚕 的 清晰 了
,
大 蚕 别 除 中肠 内 桑
同一 天 不
蛋 白 条 带 多且 较 清 晰
四 至 五 龄蚕 血 蛋 白 质 条 带 有 一 定 的 变 化
.
同 组 织 取样 处 理
蛋 白 质 带数 及 成 分 有 差 异
关键词
家蚕 卵 幼 虫 蛋 白 质 电 泳
上世纪 划 的 开 始实 施
,
年代
,
随 着 人类基 因 组 计
大量合 成
,
日时 被 释 放 到 血 淋 巴 中去

家蚕不同品种后部丝腺蛋白质双向电泳图谱比较

家蚕不同品种后部丝腺蛋白质双向电泳图谱比较

家蚕不同品种后部丝腺蛋白质双向电泳图谱比较
鲁华云;叶键;李建营;钟伯雄
【期刊名称】《蚕业科学》
【年(卷),期】2006(32)1
【摘要】采用蛋白质双向电泳和图像分析技术,研究发现不同品种的家蚕5龄第4天后部丝腺细胞的蛋白质组成存在明显差异,并且蚕茧高产品种与蚕茧中、低产量品种之间所涉及的差异蛋白质斑点各不相同,暗示丝素基因的转录、翻译可能涉及了一个非常复杂的多点控制的调控系统,即不同品种的产茧量可能涉及不同的调控位点或调控因子。

【总页数】4页(P114-117)
【关键词】家蚕;后部丝腺;蛋白质;双向电泳;图谱分析
【作者】鲁华云;叶键;李建营;钟伯雄
【作者单位】浙江大学动物科学学院蚕蜂分子生物学实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S881.2;Q51
【相关文献】
1.家蚕五龄第1天与第4天后部丝腺蛋白质双向电泳图谱比较 [J], 吴卫成;叶键;鲁华云;李建营;陈金娥;孟智启;倪春霄;钟伯雄
2.家蚕茧色限性品种雌雄绢丝腺组织蛋白质组双向凝胶电泳分析 [J], 靳远祥;徐孟奎;姜永煌;陈玉银
3.家蚕品种P50和C108后部丝腺的表达序列标签及单核苷多态性比较 [J], 余东亮;钟伯雄;傅衍;汪旭升
4.茧层量差异家蚕品种后部丝腺细胞和血液组织的蛋白质表达谱分析 [J], 余芳;兰天云;李建营;范伟;叶键;苏松坤;丁农;徐海圣;蒋振东;张金卫;钟伯雄;段家龙
5.家蚕5龄幼虫不同时期中部丝腺细胞蛋白质双向电泳分析 [J], 沈飞英;钟伯雄;楼程富;洪波;蒋振东;苏松坤;梁建设;徐海圣
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家蚕性别相关血液蛋白质组的一维电泳-液相色谱-质谱分析

家蚕性别相关血液蛋白质组的一维电泳-液相色谱-质谱分析

家蚕性别相关血液蛋白质组的一维电泳-液相色谱-质谱分析刘艳艳;池旭娟;阚雪芹;方向明;郑必平;谈建中;平野久【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2009(35)2【摘要】分别从家蚕5龄幼虫和蛹期不同发育阶段提取雌、雄蚕血液总蛋白质,采用一维电泳-液相色谱-质谱(1DE-LC-MS)技术分析家蚕血液蛋白质的差异性表达及差异蛋白组分。

在家蚕血液蛋白质含量与种类方面检测到与性别及发育相关的差异性表达,数据库检索结果共获得96个相匹配的候选蛋白质,剔除冗余部分后鉴定其中的27个蛋白质组分,分别属于13种蛋白质或其亚基。

雌、雄蚕之间的差异组分主要出现在分子质量70-100 kD之间,其中芳基贮存蛋白、卵黄蛋白原、抗胰凝乳蛋白酶因子为雌特异性表达组分。

30K蛋白家族是家蚕血液中高丰度表达的蛋白组分。

这些差异蛋白质的鉴定与功能分析为研究家蚕性别发育调控机制提供了新的信息。

【总页数】8页(P287-294)【关键词】家蚕;性别;幼虫期;蛹期;血液蛋白质;差异蛋白质组;一维电泳-液相色谱-质谱【作者】刘艳艳;池旭娟;阚雪芹;方向明;郑必平;谈建中;平野久【作者单位】苏州大学建筑与城市环境学院;苏州大学蚕桑研究所;横滨市立大学【正文语种】中文【中图分类】S881.2;Q51【相关文献】1.凝胶电泳-毛细管液相色谱-质谱联用技术分析大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组 [J], 刘卓;李洪军;李晓鸥;杨照微;赵丽纯;黄丽红;郭宏华;王海;赵晴2.高效液相色谱与液相色谱-质谱分析冬虫夏草相关产品之麦角固醇与其衍生物 [J], 陈林垮;许瑞祥;郭嘉信3.不同穴组针刺后哮喘大鼠肺蛋白质组的纳升级二维液相色谱分析 [J], 洪嘉婧;洪杰;朱重玄;郭航;张梦4.基于不同提取方法的水稻叶片蛋白质组的二维液相色谱分离及高分辨质谱分析[J], 柴爽爽;马有宁;高欢欢;秦美玲;杨欢;张涵彤;何巧;林晓燕5.家蚕蜕皮液蛋白质双向电泳及质谱分析 [J], 侯勇;田莎;郭超;周霞;陈世达;杨欢;赵萍;夏庆友因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

一种适用于双向电泳的家蚕微孢子虫总蛋白的制备方法

一种适用于双向电泳的家蚕微孢子虫总蛋白的制备方法

1. 2
孢子结成块状, 转移到研钵中 , 加少量石英沙快速研磨。经过液氮反复冻融、 研磨, 直到光学显 微镜下 ( 16X40) 不能观察到完整的孢子为止, 再向孢子中加适量的裂解缓冲液 ( 8M 尿素 , 2% chaps, 0. 5% IPGbuffer, 5mMDTT) , 充分混匀 , 1500g 离心 10 分钟 , 上清即为家蚕微孢子虫总蛋白 样品 , - 80 保存待用。 1. 3 双向电泳 ( 2D- PAGE) 双向电泳( 2D- PAGE) 参照郭尧君的方法
钟, 脱色液 ( 40% 甲醇, 10% 乙酸 ) 脱色 3- 4 小时到可以清晰地分辨出蛋白质图谱。
2
结果与分析
微孢子虫表面有一层较厚的几丁质外壳,
目前一般采用极丝弹出法提取其总蛋白, 由于 提取缓冲液中含有离子去污 剂 ( 如 SDS) 和其 他的盐 份, 这 些组分 对双向 电泳结 果影响 较 大, 笔者等采用液氮多次冻融结合手工研 磨, 再用含有 CHAPS 的缓冲液抽提的方法能够得 到产率较高、 适用于双向电泳的家蚕微孢子虫 总蛋白。 电泳结果表明, 家蚕微孢子虫总蛋白中酸 性蛋 白占 多数 ( 见图 1) , 分子量 主要 集中 在 14. 4- 94. 0KD。在 2D- PAGE 图谱中可 以清 楚地分辨出 30 多个肽点, 其中有一半左右的 肽点分离比较清晰, 染色较深 , 可能是微孢子虫总蛋白的主要组分。
TM [ 2]
进行。第一相 IEF 采用固相 PH 梯度胶条 ( 线
性 pH3- 10) , 将 50- 100ul( 约 200 g) 的样品蛋白溶液与重泡胀液 ( 8M 尿素, 2% chaps, 0. 5% IPG buffer, 恒量溴酚蓝 ) 混合, 在 IPGphor IS0electric Focusing System 上进行, 总伏特时为 17500Vh 。等电聚焦结束后 , 将胶条放在 SDS 平衡缓冲液中 ( 50mM Tris- cl, pH8. 8, 6M 尿素, 30% Glyc

家蚕5龄第3天血液蛋白的双向电泳及质谱分析

家蚕5龄第3天血液蛋白的双向电泳及质谱分析

家蚕5龄第3天血液蛋白的双向电泳及质谱分析侯勇;赵萍;邹勇;钟晓武;夏庆友【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2008(34)4【摘要】基于为家蚕血液比较蛋白质组学的研究提供基础信息的目的,利用双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的血液蛋白进行分析,并采用基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对其中一些表达量较高的蛋白进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。

120μg血液蛋白经过双向凝胶电泳及考马斯亮蓝染色后可以检测出106个蛋白点,60μg血液蛋白经双向电泳及银染后可以检测出126个蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子质量15~80kD区域,等电点4~7。

MALDI-TOF MS鉴定的52个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中成功鉴定了46个蛋白点。

在这些蛋白中,不仅包含了SP贮存蛋白和30K低分子量脂蛋白等家蚕血液蛋白的主要成分,还包含了大量与代谢相关的蛋白酶类、蛋白酶抑制剂、离子转运蛋白、免疫相关因子、分子伴侣等不同种类的蛋白。

【总页数】6页(P670-675)【关键词】家蚕;血液蛋白;双向电泳;基质辅助质量飞行时间质谱【作者】侯勇;赵萍;邹勇;钟晓武;夏庆友【作者单位】西南大学生物技术学院,蚕学与系统生物学研究所,重庆400716【正文语种】中文【中图分类】S881.2;Q51【相关文献】1.家蚕五龄第1天与第4天后部丝腺蛋白质双向电泳图谱比较 [J], 吴卫成;叶键;鲁华云;李建营;陈金娥;孟智启;倪春霄;钟伯雄2.家蚕精巢蛋白质的双向电泳及质谱分析 [J], 聂红毅;钟晓武;邹勇;衣启营;赵萍;夏庆友3.家蚕蜕皮液蛋白质双向电泳及质谱分析 [J], 侯勇;田莎;郭超;周霞;陈世达;杨欢;赵萍;夏庆友4.家蚕5龄幼虫不同时期中部丝腺细胞蛋白质双向电泳分析 [J], 沈飞英;钟伯雄;楼程富;洪波;蒋振东;苏松坤;梁建设;徐海圣5.家蚕性别相关血液蛋白质组的一维电泳-液相色谱-质谱分析 [J], 刘艳艳;池旭娟;阚雪芹;方向明;郑必平;谈建中;平野久因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

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【家蚕幼虫黄白血液蛋白差异的双向电泳分析】石蚕幼虫摘要:试验利用黄白茧色限性品种Y92为材料,在4、5龄幼虫期,测定了黄血蚕(雌)、白血蚕(雄)的血液蛋白质含量的消长变化,幼虫血液蛋白质含量随生长发育逐渐增多,至5龄期第八天到达最高值,黄血蚕94.36μg/μL,白血蚕54.82μg/μL。

利用双向电泳技术,比较5龄期第六天幼虫黄、白血液的蛋白质差异,在蛋白质电泳图谱中,黄、白血蚕总共检测到507个蛋白点,其中黄血蚕有287个蛋白点,白血蚕有220个蛋白点,两者能匹配的蛋白点有205对,匹配率达到80.9%;特异性蛋白点,黄血蚕有82个,白血蚕有15个。

关键词:家蚕幼虫;黄白血液;蛋白质;电泳分析:S881.2+4:A:0439-8114(2011)10-2128-03ComparisonbetweenYellowBloodProteinsandWhiteBloodProteinsofBombyx moriLarvaebyTwoDimentionalElectrophoresisKONGQing-ming1,ZHONGYang-sheng1,LINJian-rong1,WANGYe-yuan1,LINBi-min1,GUODing-guo2,LINZhong-fen2(1.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China;2.GuangdongProvincialSericulturalExtensionCenter,Guangzhou510640,China)Abstract:Inthisstudy,thesex-limitedbreedyellowandwhitecocoonsilkworminthe4thand5thinstarwereusedtoanalysisthemetabolicruleofbloodproteins.TheresultsshowedthattheproteincontentinthebloodofBombyxmorilarvaeincreasedwithgrowingandreached peak inthe8thdayofthe5thinstar.Foryellow-bloodsilkworm(female)itwas94.36μg/μL;andforwhite-bloodsilkworm(male)itwas54.82μg/μL.Usingtwodimensionalelectrophoresis(2-DE)andgelimageanalysissystem,theproteinsinmaleandfemalebloodofsilkwormatthe6thdayinthe5thinstarwerecompared.Atotalof507proteinspotsweredetectedinthe2-DEpatternofmaleandfemaleblood,ofwhich287belonged tofemaleand220belonged tomale.Comparisonshowedthat 205 pairswerematchedinthe2-DEpatternsofbothmaleandfemale,withthematchpercentageashighas80.9%.Thereare85proteinspotsspecifictofemaleand15specifictomale.Keywords:Bombyxmorilarvae;yellowandwhiteblood;protein;electrophoresisanalysis家蚕是一种绢丝昆虫,一直是生物学研究的模式昆虫,由于蚕能够泌丝结茧,因而具有很高的经济利用价值。

近年,蚕业科技工作者进一步对天然彩色茧丝资源进行了拓展利用,并就彩色茧形成的机理作深入地研究。

Jouni等[1]通过硫酸铵沉淀、浓缩和阴离子交换层析等技术,在结黄茧的5龄幼虫中肠中发现了一种叶黄素结合蛋白(lutein-bindingprotein,LBP),该蛋白的等电点为5.4,相对分子量35kD。

Tabunoki等[2]在家蚕黄茧品种的丝腺组织中分离纯化出一种类胡萝卜素结合蛋白(carotenoid-bindingprotein,CBP),并对其进行了cDNA的序列分析,CBP的表达由显性的黄血Y基因调控,含297个氨基酸残基,大小为33kD,以1∶1的摩尔比结合叶黄素,该蛋白在中肠上皮细胞和中部丝腺内膜中发挥着辅助吸收和再分配类胡萝卜素的功能。

Tsuchida等[3]以4种家蚕突变体为材料,通过对脂肪酸转运与代谢的研究,认为家蚕Y基因隐性突变体的血液和蚕茧无色的原因可能是类胡萝卜素的转运与细胞吸收缺陷而引起的。

Sakudoh等[4]对CBP在前胸腺的表达分析研究中,分离鉴定了一种新的类胡萝卜素结合蛋白BmStart1,BmStart1基因与CBP正向同源,在家蚕黄、白茧品种中均有表达。

随着后基因组时代即功能基因组时期的来临,蛋白质组学(Protoemics)的应用越来越受到重视[5,6]。

自从1994年Wilkins和Williams第一次提出蛋白质组(Proteome)的概念以来,蛋白质组学的研究得到了空前的发展,相关技术的研究也取得了重大突破[7,8]。

家蚕蛋白质组的研究,科学工作者正以家蚕胚胎、丝腺、血液等组织器官为材料,采用双向电泳分离技术、质谱分析等鉴定技术,开展功能蛋白的探索研究,构筑参考图谱和家蚕蛋白质数据库,查找与生长发育有关的功能蛋白,从而在蛋白质水平上阐明家蚕生长发育、代谢调控等生命活动的规律。

与原核生物、酵母、人类的蛋白质组学研究相比,家蚕蛋白质组学还处在发展的初期阶段。

为进一步探索家蚕有色茧的形成机制,我们利用双向电泳技术对结黄白茧的家蚕幼虫的黄、白血液蛋白进行电泳图谱的差异分析,查找与茧色素相关联的蛋白。

1材料与方法1.1材料供试家蚕品种:Y92(黄白茧色限性品种),雌蚕黄血结黄茧,雄蚕白血结白茧,由华南农业大学蚕丝科学系提供。

1.2材料处理常规饲养Y92品种至4龄期,从4期开始,每天腹足取血,在血样本中加入微量苯基硫脲防氧化,10000r/min,4°C离心20min,取上清,按Bradford法测定蛋白质含量,分装后置于-80℃保存。

等电聚焦电泳前,根据所测蛋白质含量,将血液与裂解液适当比例混合,冰上裂解1h,12000r/min,离心30min,取上清备用。

本文为全文原貌未安装PDF浏览器用户请先下载安装原版全文1.3双向电泳分析第一向等电聚焦电泳(IEF)使用IPGphorⅡ等电聚焦仪,参照仪器使用说明书进行操作,使用18cm,pH值3~10的IPG干胶条,300μg上样量;第二向SDS-PAGE使用12%的分离胶,电泳后的凝胶,参考Yan等[9]的方法进行银染。

双向电泳图谱利用AmershamPharmacia公司的ImageMasterTM2DPlatinum5.0软件进行分析,按照说明书操作。

1.4质谱鉴定委托上海中科新生命生物技术有限公司采用电喷雾串联质谱(ESI-MS-MS)进行蛋白质检测分析。

2结果与分析2.1幼虫4、5龄期黄血、白血蚕的血液蛋白含量变化为了解Y92品种4、5龄期黄血、白血幼虫体血液蛋白含量的变化情况,从4龄第一天开始,测定各天血液蛋白质含量,结果见图1。

从图1可知,Y92幼虫4、5龄期血液蛋白质含量随生长发育逐渐增多,5龄第八天到达最高值,黄血蚕94.36μg/μL,白血蚕54.82μg/μL。

黄、白血幼虫体中的血液蛋白质含量在5龄第五天后逐渐变大,第八天达到最大,黄血蚕血液蛋白质含量高出白血蚕39.54μg/μL。

2.2双向电泳分析家蚕Y92幼虫5龄第六天黄血蚕(雌)、白血蚕(雄)的血液蛋白样品经双向电泳分析和银染法染色,其图谱如图2所示。

经ImageMasterTM2DPlatinum5.0软件分析,在图2的黄血蚕、白血蚕5龄幼虫的血液蛋白中共检测到507个蛋白点,其中黄血蚕蛋白点287个,白血蚕蛋白点220个,相互能匹配的蛋白点有205对,匹配率为80.9%;特异性蛋白点黄血蚕有82个,白血蚕有15个,其等电点和分子量列于表1、表2。

从表1和表2的结果看,黄血蚕特异性蛋白,分子量在10~29.9kD的占了总数的13.41%;30~49.9kD的占了总数的23.17%;70~89.9kD的占了总数的39.02%;90kD以上的占了总数的19.51%。

白血蚕的15个特异性蛋白点,分子量的大小在10~99kD。

在特异蛋白中,黄血蚕和白血蚕蛋白的等电点绝大多数分布在4.0~9.5。

对黄血、白血相配匹配的205对蛋白,经比对分析,黄血蚕血液蛋白含量为白血蚕3倍及以上的匹配蛋白点有48对(表3),差异3.0~4.9倍的有26个;5.0~6.9倍的有9个;7.0~8.9倍的有3个;9.0倍以上的有11个。

而白血蚕血液蛋白含量大于黄血蚕3倍以上的匹配蛋白点却只有18对(表4),差异3.0~4.9倍的有11个;5.0~6.9倍的有2个;7.0~8.9倍的有2个;9倍以上的有2个。

2.3黄血特异蛋白点的ESI~MS~MS鉴定分析通过从分析黄血蚕与白血蚕的双向电泳图谱(图2),我们发现黄血特异蛋白点中的2540号是一个白血蚕没有的、且容易提取的特异蛋白,于是将该蛋白提取送上海中科新生命生物技术有限公司用电喷雾串联质谱(ESI-MS-MS)进行质谱分析,图谱如图3所示。

质谱分析得到5段肽段序列,分别为:VFGTLGQNDDGLFGKEIFNDDRGKLTGQAYGTRVLGPAGDSTNYGGRNAEAAIDINRSGMTATGSGVWDLDKNTRLSAGGMVSKRPDVGVQAEFR对以上序列,经与Insecta和Oryzasativa蛋白数据库的相关蛋白进行比对,与gloverin~likeprotein4[Bombyxmori,在NCBI数据库中的登录号为5242121]有95个氨基酸相匹配,匹配率为55.56%。

3讨论家蚕茧色素物质的形成,是幼虫期蚕体从摄取的桑叶物质中转化而成,因而,蚕结黄茧还是白茧,茧色的表现如何,除了遗传基因起决定作用外,桑叶中的叶黄素、黄酮类化合物等色素物质能否被消化吸收,透过肠膜进入血腔再进入绢丝腺中,透过性便是一道屏障[10]。

根据我们对Y92血液的颜色观察,从3龄幼虫期的脚色便可观察出雌雄血液的颜色差异(雌黄血、雄白血),表明叶黄素、黄酮类化合物等色素物质已经在蚕体的血腔中形成,由此推测,色素物质在3龄前已经合成或桑叶中的色素物质经蚕体消化吸收进入到了血腔中。

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