稳态荧光分析方法与应用进展

5 .0 0 0
Y = 0 .0 7 0 1 + 1 .8 9 * 1 0 X R = 0 .9 9 8
4
4 .0 0 0
Relative I
FL
3 .0 0 0
20 15
I
2 .0 0 0
1 .0 0 0
10 5 0 250 300 350 400
0 .0 0 0 0 .0 0 5 .0 0 x 1 0
N H3C NH CH3 S N CH3
CH3
The RLS spectra pf MB with DNA(pH 8.14)
MB在DNA分子骨架上的组装 在 分子骨架上的组装
Huang et al, Bull. Chem. Soc. Jpn, 72, 1501-1508(1999)
荧光偏振技术(1926年，Perrin)
β-carotene在表面活性剂中的同步以及3D荧光光谱
550
0.5000 19.81 39.13
1800 1600 1400 1200 1000 800
4.55E-4 mol/L 3.62E-4 mol/L 2.74E-4 mol/L 1.10E-4 mol/L 7.12E-5 mol/L 6.25E-5 mol/L 5.37E-5 mol/L 4.49E-5 mol/L niosome membrane phase solvent
三维荧光分析方法应用 天然与人工处理琥珀的三维荧光光谱
天然琥珀
热处理琥珀
热处理琥珀
热填充处理琥珀
亓利剑等，宝石和宝石学杂志，2005，7卷，1期，10-16
同步荧光分析方法的应用
• 恒波长同步荧光分析
– 多环芳烃和生物大分子的检测 – 小分子与蛋白相互作用的热力学研究
• 恒能量同步荧光分析
– 多环芳烃的检测
• 1993年Pasternack 等用共振光散射技术研究了卟啉类 化合物在核酸上的聚集，首次将该技术应用于分析 化学。 • 黄承志等利用光散射技术研究了生物大分子体系的 散射光谱。
金纳米(AuNPs)共振光散射测定糖原
10000 8000 RLS Intensity 6000 4000 2000 0 200
稳态荧光
荧光分析法
偏振荧光
时间分辨荧光
2D荧光 3D荧光 同步荧光 共振光散射 荧光动力学， 共振能量转移， … … 荧 光 成 像 脉冲时间分辨 频域时间分辨
• 获得分子的大小以及分子之间相互作用的信息。
– – – – 免疫分析 激素-受体作用 蛋白-多肽相互作用 DNA-蛋白相互作用以及酪氨酸激酶分析等方面的研究。
荧光偏振免疫分析(FPIA)
荧光分析法（第三版）， 王尊本， 科学出版社， 荧光分析法（第三版）， 许金钩 王尊本， 科学出版社，2007
稳态荧光分析方法与 应用进展
北京大学化学学院 邹明健 许潇 李娜 2009年1月9日
The Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP ）绿色荧光蛋白 （
2008诺贝尔化学奖 诺贝尔化学奖
Osamu Shimomura 1960s Martin Chalfie 1990s Roger Y. Tsien’s, today
10000 8000 6000 4000 2000 0 0 200 400 600 800
B
300
400 500 600 Wavelength (nm)
700
来自百度文库800
AuNPs
AuNPs和500 ng•mL-1糖原
+
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http://nobelprize.org
分子荧光产生机理-Jablonski Diagram
荧光分光光度计结构示意图
透射光 吸收光谱 氙灯(或高压汞灯） 氙灯 或高压汞灯） 或高压汞灯 （200-800 nm)
荧光信号
• • • • 荧光寿命 荧光光谱 荧光强度随光谱变化 成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）
-5
1 .0 0 x 1 0
-4
1 .5 0 x 1 0
-4
2 .0 0 x 1 0
-4
2 .5 0 x 1 0
-4
3 .0 0 x 1 0
-4
C o n c e n tr a tio n / m o l/L
w a v e le n g th / n m
unpublished results
大气样品中对苯二酚与间苯二酚的同步荧光测定
• 以平面偏振光激发荧光分子时，静止的荧光分子则发 射与入射光相同偏振面的偏振光（各向异性/偏振)。 • 由于分子存在旋转翻滚运动，发射光的偏振平面与入 射光会有差异，产生消偏振。 • 消偏振 vs 分子运动
– 大分子(如蛋白质)运动缓慢，发射光偏振度较高。 – 小分子，旋转与翻滚速度快，发射光有不同程度的消偏振 现象。
– 强度 – 寿命
可获得的信息
• 分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子 表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等 • 分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭 • 分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移， 静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等 • 分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能 量转移、新的荧光峰的产生 • 分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等
∆λ=15 nm
HO
OH HO OH
hydroquinone
292/328 nm
resorcinol
275/303 nm
Anal Bioanal Chem (2004) 378 : 1648–1651
共振光散射原理和应用
• 光散射 • 共振光散射
– λLS≈λAbs
2 n12 − n0 2 16π a NI0 sin α 2 I= 2 4 n + 2n2 rλ 0 1 4 6
一般稳态荧光仪的功能
• 2D荧光光谱：荧光强度-激发（发射）波长 • 3D-荧光光谱：激发波长-发射波长-荧光强度 • 同步荧光光谱（固定∆λ）：以一定波长差同时扫 描激发和发射单色器，∆λ=Stokes位移;荧光强度激发（发射）波长 • 共振光散射(固定∆λ=0 nm) • 荧光偏振技术：平面偏振光激发样品。 • 荧光动力学方法 • 导数荧光方法
SFS, ∆λ=20 nm
a. Settled sewage b. Final effluent c. Filtered sewage
SFS, ∆λ=20 nm
a. Tyrosin b. Humic acid c. Tri-distilled water
280 nm
280 nm
Wat. Res. Vol. 29, No. 6, pp. 1599-1602, 1995
500
58.44 77.75
Excitation wavelength / nm
97.06
450
116.4 135.7 155.0
350
IFL
400
600 400
300
200
250 250
0
300
350
400
450
500
550
400
450
500
550
600
Emission wavelength / nm
• 可变角同步荧光分析
– 天然产物检测 – 高背景体系中微量组分的检测
生活污水的同步荧光谱(SFS)研究(λex=248 nm)
FL & UV absorption
a. b. Settled sewage Final effluent
FL
a. Tyrosin b. Cinnamic acid c. Humic acid
40 35 30 25
FL
wavelength / nm
6 .0 0 0
2 . 7 4 E - 4 m o l/L 2 . 4 0 E - 4 m o l/L 2 . 0 6 E - 4 m o l/L 1 . 7 1 E - 4 m o l/L 1 . 3 7 E - 4 m o l/L 1 . 0 7 E - 4 m o l/L 6 . 8 5 E - 5 m o l/L 3 . 4 8 E - 5 m o l/L n io s o m e m e m b r a n e p h a s e s o lv e n t
KAuGn
KChSn
K ChSG n
[ChSG n ] = [ChS][G n ]
Talanta 76, 1207-1211, 2008. J. Phys. chem. B (accepted)
共振光散射研究亚甲基蓝(MB)在核酸 分子骨架上的组装
DNA mg/mL a. 0 b. 0.4 c. 0.8 d. 1.2