可注射的生物可降解的透明质酸—酪胺交联水凝胶的药物控制释放和组织工程

可注射的生物可降解的透明质酸—酪胺交联水凝胶的

药物控制释放和组织工程

Motoichi Kurisawa,*a Joo Eun Chung,a Yi Yan Yang,a Shu Jun Gao a and Hiroshi Uyama b

接收于2005年5月19日（英国剑桥大学），2005年6月29日接受

首次是在2005年7月28日以预发表文章的形式公开在网络上

DOI号：10.1039/b506989k

连续注射透明质酸—酪胺结合物和酶在体内通过酶的诱导氧化偶联形成可生物降解水凝胶，是一种很有前途和潜力的作为药物控释和组织工程生物材料。

水凝胶被广泛应用于生物活性分子的控制释放和细胞的封装。1尤其是水凝胶用作组织工程的骨架材料是实现生物体内组织修复、再生的一种很有前景的方法。然而，到目前为止大部分水凝胶都需要外科手术植入，那样的话将导致组织排异反应和组织损坏。2因此，可注射的原位形成凝胶的聚合物水凝胶体系的发展得到了很多的关注。3理想的情况下，可注射的体系应形成的水凝胶应该在一个狭窄的生理上可接受的温度范围内，并且是以一个足够快的速率注入。4此外，所用的试剂必须是无毒的，而且形成的水凝胶在疾病治愈后和∕或组织再生完成后是可以降解的。为了避免有毒交联试剂的使用，物理交联水凝胶被设计成为运用聚合物链之间的离子反应和采用溶液—凝胶两亲性嵌段共聚物。2,5化学交联法用于合成机械稳定性和对生物可降解性的控制的水凝胶是一种很多变的方法。然而，这种方法用于可注射的体系却是不适用的，因为有毒化学试剂经常被用于水凝胶的合成从而导致生物活性分子例如生长因子和细胞的一些不良反应。

在这项研究中，我们提出了一个简单的生物相容的原位凝胶形成体系，它由透明质酸—酪胺（HA-Tyr）偶联物（方案1）在过氧化酶催化氧化反应下形成，其中还涉及一些生物合成途径像黑色素的形成。水凝胶在活体中通过注射器注入两种溶

液而形成，（ⅰ）HA-Tyr溶液含有H2O2作为辣根过氧化酶（HRP）的氧化剂加上（ⅱ）HRP作为一种模型催化剂，引发一部分苯环上的氧化偶联反应（方案2）。HA是细胞外基质（ECM）的一种主要成分，是一种由重复的二糖单元（β-1,4-D-葡萄糖醛酸和β-1,3-N-乙酰基-D-葡萄糖胺）组成的粘多糖。6我们将HA作为水凝胶的骨架高聚物是由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性。7因此，这种新型凝胶形成体系通过生物活性试剂的载入使我们形成的水凝胶没有任何炎症反应和任何多余的反应。我们相信一种很有前景的高效药物治疗和组织再生方式是在活体内通过酶导介交联透明质酸凝胶形成的。

HA-Tyr偶联物

方案1 HA-Tyr偶联物的合成

HA-Tyr偶联物HA-Tyr水凝胶

方案2 通过酶催化氧化导介交联HA-Tyr偶联物原位凝胶聚合成聚合物水凝胶在此，我们报道了由透明质酸和酪胺通过辣根过氧化酶的在体外或体内的酶触反应而形成的水凝胶，并且由于水凝胶的生物可降解性而发展成为具有药物控释和组织工程功效的理想注射体系。

透明质酸—酪胺偶联物是在蒸馏水中通过一种普通的碳化二胺和活性酯导介偶联反应8而成功合成的。†从1 H 核磁共振谱图中可以发现每100个透明质酸重复单元中有9个酪胺分子。

透明质酸—酪胺水凝胶是在H2O2和HRP作用下使一部分的酪胺发生催化氧化反应而合成的。‡

过氧化酶是经常在温和的反应条件下用作苯酚及其衍生物的氧化耦合反应的催化剂。9像方案2所显示的，过氧化酶的氧化偶联反应是在苯酚与苯酚之间形成

C-C键和C-O 键。图1显示了凝胶时间和催化剂（H2O2 和HRP）浓度之间的依赖关系。在图1a中显示的是凝胶时间是随着H2O2的浓度是增加而增加的。另外，当双氧水的浓度在2.4-20mmol/L之间的凝胶时间几乎是常数。同时，不仅是当

H2O2的浓度为0mmol/L时观察不到凝胶的形成而且当H2O2的浓度大于100mmol/L 时也观察不到凝胶的形成，其原因是过度的氧化作用。相反的是，在图1b 中显示

的是凝胶时间随HRP 浓度的增加而减少，而且当HRP 浓度大于1.25 份每毫升时凝胶时间几乎是常数。而且凝胶的机械强度和凝胶时间有关：更短时间内形成的凝胶具有更好的机械强度（数据未显示）。基于这些情况，凝胶强度和凝胶时间一样

可以通过改变H2O2和HRP 的浓度来控制。凝胶是在1.25份每毫升的HRP 和

2.4mmol/L的H2O2催化剂作用下20秒形成的。

图1 HA-Tyr水凝胶凝胶时间和催化剂浓度的关系。a) 1.25份每毫升的HRP的情况下H2O2的影响；b) 2.4mmol/L的H2O2的情况下HRP的影响。

如图2 所示，我们对水凝胶(规格为20⨯20⨯1.2 mm)的体外酶触降解反应进行了测试，我们以重量损失方面作为评估标准。以不同浓度的透明质酸(0，10，25，50和100份每毫升)来研究水凝胶的降解过程，作为体内酶水解透明质酸链的模拟。§所有水凝胶在透明质酸酶作用下都能完全降解，而单独在PBS缓冲液中培养的阴性对照实验形成的水凝胶却观察不到重量的变化。

图2 在体外37o C下的PBS缓冲液中HA-Tyr水凝胶的酶触降解情况。透明质酸酶浓度：○，100份每毫升；□，50份每毫升；△，25份每毫升；▽，10份每毫

升；●，0份每毫升。

水凝胶的降解速率(B)可以从下式中估算：

B=h/2t∞(1)

式中h 表示开始时板坯的厚度，t∞表示完全降解所需的时间。这个方程式基于降解是发生在板坯的两面而不是左右边缘的假设的。降解速率随着透明质酸酶浓度的增加而增加。透明质酸酶浓度从0，2.5，10，25和50 份每毫升的增加引起降解速率分别为0，1.8，2.3，4.1和5.5 106 cm/s。而且这些水凝胶重量的减少时随时间线性发生的，表明降解过程仅由表面侵蚀而产生。10就希望这种表面控制降解的水凝胶可以达到对生物活性分子的缓释作用，例如蛋白质可以通过这种表面降解而释放。

为了研究水凝胶的体内形成和降解情况，对小鼠进行HA-Tyr 的皮下注入给药并且不加入H2O2/HRP(表1)。¶使用四种注射方式：(ⅰ)注射器A(HA-Tyr +H2O2)+注射器B(HRP)，(ⅱ)注射器A(HA-Tyr)，(ⅲ)注射器A(HA-Tyr)+注射器B(HRP)，(ⅳ)注射器A(HA-Tyr +H2O2)。图3a 表明小鼠体内注射1天后收集到的水凝胶的情况。由注射体系(ⅰ)：注射器A(HA-Tyr +H2O2)+注射器B(HRP)形成的水凝胶具有最高的机械强度；其他的机械强度为(ⅰ)>(ⅲ)≈(ⅳ)>(ⅱ)。这种结果表明H2O2和HRP的协同效应和足够高的浓度的共存性影响着HA-Tyr水凝胶的交联效果。有趣的是仅仅注射HA-Tyr溶液也可以形成水凝胶，表明氧化偶联反应在很少量的

H2O2和过氧化酶的存在下甚至是在没有注射H2O2和HRP的生理条件下也能够进行。这些不仅是在可以观察到炎症或刺激的组织，而是通过这四种注射方式的部位都可以形成这种原位凝胶形成体系。

表1 注射溶液的成分a

注射体系注射器A 注射器B

ⅰHA-Tyr +H2O2HRP

ⅱHA-Tyr

ⅲHA-Tyr HRP

ⅳHA-Tyr +H2O2

a透明质酸酪胺偶联物和酶通过两种不同的注射器连续的注入