第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导优秀课件

❖ 免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作 周期短（仅需数小时）、结果易于分析。
思考题
❖ 结合实验室的免疫固定电泳分析系统，简述血 清免疫固定电泳的影响因素及其克服的方法。
温州医学院 陶志华
实验二
血清IgG定量检测的可 报告范围评价实验
概述
❖ 可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型 的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。
❖ 当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它 浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，一般先以血清蛋白区 带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本－周蛋白定性作 为初筛实验。
❖ 如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、 免疫球蛋白亚型定量等检测做进一步定量分析和免疫 球蛋白分类鉴定。
实验一 血清免疫固定电泳实验
试剂与器材
❖ Acide Violet染色液：用1L 10%冰醋酸溶解Acide Violet。
❖ 脱色液：用1L蒸馏水溶解Citric Acid Destain。 ❖ 清洗液：8L蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。 ❖ 电泳仪：spife 3000全自动电泳仪。
Spife 3000全自动电泳仪
❖ 某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固 定泳道上均出现单克隆片段。在这样情况下可加25μl 还原剂（1％β-巯基乙醇）于75μl血清混匀并令其反应 至少15min（至多3h)后按规定程序继续进行。
❖ 在电泳之前，凝胶与电泳槽的贴合面充满电泳介质， 并确保两者之间无气泡。
❖ 在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无 气泡。
试剂与器材
❖ 选用与检测仪器相配套的试剂、校准品及其他 辅助试剂
❖ 参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择 低浓度标本和高浓度标本
操作步骤
❖ 按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统 处于良好状态。
❖ 实验标本的配制，将血清IgG的高（H）和低（L）样品按： 5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各自配 制混合，形成系列评价的实验样品。并计算各样品的G定量检测的可报告范围评价的原理和方 法学，了解血清IgG测定方法学的性能。
实验原理
❖ 由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点 定标绘制标准曲线，在绘制的标准曲线上查阅结果。由于 计算机技术的发展，仪器可对反应响应呈不同表现的结果 做适当的处理，直接以最终计量单位方式报告检验结果， 在此情况下，评价患者结果可报告范围时，可不必再去评 价响应结果的真实曲线状态，只要将样品作不同程度的稀 释或配制后，将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标 纸上应呈一条通过原点、斜率为1的直线。直线所达的限 值即为该方法的患者结果可报告范围。
操作步骤
❖ 样本处理：
用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清 第一泳道样本稀释3倍，第二至第六泳道样本稀释5倍。
❖ 区带电泳
上样
胶片准备
电泳
❖ 沉淀反应
加抗血清 洗涤、烘干
着色
结果分析
❖ 对染色烘干后的胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白 分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单 克隆免疫球蛋白条带。如图12-1所示, 其中sp泳道为血清 蛋白参考道，由下至上分别为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋 白、β球蛋白、γ球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为IgG、 IgA、IgM、κ、λ抗血清泳道。
❖ 染色之前的胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤，以出 去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景 色。
临床应用
❖ 本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床 常规M蛋白的分型与鉴定。通常用于单克隆Ig增殖 病，单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份 单克隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多 克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。
注意事项
❖ 标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现 象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。
❖ 总免疫球蛋白的水平＞20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋 白水平＜5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。
❖ 某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后， 可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在 点样问题。在这样情况下，加25μl液化剂于75μl血清中，混 匀15s。然后按规定程序继续进行。
❖ 将系列评价的实验样品上机检测，每标本重复检测2~4次， 结果记录于下表。
❖ 依照稀释关系，计算各实验样品的预期值。按实验要求， 每个样品做6次重复测定，得6个实测值，它们和预期值形 成6对数据。
第九单元免疫增殖病的免疫学检 验实验指导
概述
❖ 免疫增殖病通常是指以浆细胞、淋巴细胞和巨噬细 胞异常增生为特征的疾病，其表现往往有免疫功能 异常及免疫球蛋白质和量的变化。
❖ 与免疫学检验最为密切的是B淋巴细胞异常增殖或 其他导致免疫球蛋白异常的免疫球蛋白病，免疫球 蛋白病主要表现为高免疫球蛋白血症。
实验目的
❖ 本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习 ❖ 通过实习，熟悉血清免疫固定电泳的实验过程及
注意事项；掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白的基 本原理与临床意义。
实验原理
❖ 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂 和各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面的各自泳道上，经孵 育让固定剂和抗血清在各自泳道对应的凝胶内渗透并扩散， 若有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并 沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白质， 仅保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。经染色后蛋白质 电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。 根据电泳移动距离分离出单克隆组分。
❖ 分析测量范围指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等） 的标本，分析方法能够直接测定出的待测物范围，也就 是系统最终的输出值（活性或浓度）与被分析物的活性 或浓度成线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。
❖ 临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物 浓度范围。此范围如果超出了分析测量范围，可将标本通 过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内， 最后结果乘以稀释倍数。