293T细胞中包装慢病毒实验方案

慢病毒包装实验⽅方案

实验步骤

⼀一、细胞培养

1、⽤用含10%FBS的H-DMEM培养基于37°C、5%CO2培养箱中培养293T

细胞，其中加1×102U/ml⻘青霉素、100µg/ml链霉素和10µg/ml

ciprofloxacin防⽌止⽀支原体污染，

2、待10cm⽫皿中细胞融合度到80%左右，⽤用0.25%胰酶消化293T细胞，分

到两个6cm⽫皿中，另⼀一盘10cm293T作同样处理理，使细胞在接种之后的

18-24h达到70%融合度。

●注意事项

293T细胞转染慢病毒24h之前，培养液中停⽌止使⽤用抗⽣生素和ciprofloxacin，减少对病毒转染的影响；注意接种后的293T细胞密度，过⾼高和过低的细胞密度都会导致转染后细胞死亡。

⼆二、细胞转染

3、每个6-cm培养⽫皿在转染之前4h⽤用5ml不不含⾎血清的H-DMEM培养基换

液，

4、应⽤用500µl Optimum和14.18µl Lipofactamine2000混匀于室温静置5min，

将500µl Optimum、1.7µg慢病毒载体、1.13µg psP AX2和0.57µg MD2.G

混匀配制成DNA mixture，然后与静置5min的

Optimum/Lipofactamine2000混匀，于室温静置20min后，将混匀后的

mixture加⼊入到培养基中。

5、6h之后将培养基更更换为含10%FBS的H-DMEM完全培养基，

6、分别收集48h、72h和96h的细胞上清液。

●注意事项

①293T细胞容易易脱落⽫皿底，加H-DEME沿⽫皿侧壁缓慢加⼊入，并且边加边轻微摇晃使培养基均匀分布⽫皿底防⽌止细胞⽆无培养基死亡

②质粒换算要准确，

③将mixture加⼊入培养基中要边滴边摇晃培养⽫皿使其mixture与培养基混匀，这样直⾄至结束。

三、病毒收集和浓缩

1、将离⼼心机时间和转速参数调⾄至成3000rpm和15min,其中加速度和下降速度降⾄至最低，

2、将收集的293T细胞上清液加⼊入超滤管中（⼀一次最多15ml）,3000rpm、15min开始离⼼心，离⼼心结束后⽤用收集病毒，-80℃保存。