转基因动物2012

• 问题：如何避免不理想的结果？
第二阶段：转基因的定点整合。
1987年，美国北卡罗莱纳大学Smithies和犹 他大学Capecchi领导的研究小组根据同源重组的 原理，实现了导入的外源基因的定点整合，这一 技术亦称为“基因打靶”(gene targeting).基因打 靶技术的应用，一方面可以使导入的外源基因定 点整合于人们希望整合的部位，从而避免了外源 基因随机整合对内源基因的影响。另一方面，人 们还可以利用基因打靶技术定点灭活一个内源基 因，亦称为“基因敲除”(gene knockout)。因此 基因打靶技术为在整体水平研究某一基因的功能 以及进行基因治疗开辟了新的途径。
2007年诺贝尔生理学或医学奖
• 北京时间2007年10月8日下午5点30分，2007年诺贝尔生理学或医 学奖揭晓，美国犹他大学Eccles 人类遗传学研究所科学家Mario R. Capecchi 、美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院教授 Oliver Smithies 与英国科学家卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院 Martin J. Evans因干细胞研究获得此奖项。
谢谢！
• 今年的三位诺贝尔奖获得者是由于在胚胎干细胞和哺乳动物的 DNA重组方面的开创性成绩而获奖。由于他们的发现，产生了一 种名为“小鼠中的基因打靶”的技术。这项技术极其有用，目前 已经被广泛应用在几乎所有生物医学领域——从基础研究到新疗 法的研制。
美国犹他大学Eccles 人类遗传学研 究所Mario R. Capecchi
第一阶段：实现外源基因的导入
1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40的DNA导 入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾 组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明将外源基因 导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。 以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受 精卵中的转移并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继 出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。
（3）感染效率高（100%）、范围广 不需特殊仪器 外源基因15kb以下
Transgenic pig generated with lentiviral vector
3.电脉冲法 (electroporation)
电穿孔仪
三、转基因动物的应用
1. 2. 3. 4. 基因功能的研究 建立疾病动物模型 建立转基因动物生物反应器 异种器官移植
一、转基因小鼠技术的发展史
转基因小鼠技术兴起于60年代，至 80年代中期逐渐成熟。其中关键的技 术是实现外源基因的导入及整合，这 一技术的发展到目前已经历了四个阶 段： 1. 实现外源基因的导入。
2. 实现外源基因的定点整合-基因打靶。 3. 实现外源基因的组织特异性表达。 4. 实现外源基因的时间可控性表达。
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转基因的组织特异性表达
问题：表达时间能否控制？
第四阶段：转基因的时间可控性表达
转基因的表达如果不影响动物的胚胎发 育，则携带有转基因的动物可以生长、发育 成熟。但有时转基因会影响动物的胚胎发育， 导致动物在胚胎阶段死亡。为了克服这一弊 端，必须要找到一种可以人为控制转基因表 达时间的方法。1993年，Gu等应用Cre/loxP 重组酶系统实现了转基因的时相可控性表达。 现在已经能够做到从时间和空间的角度 控制转基因的表达。
美国北卡罗来纳州大学教会山分 校医学院教授Oliver Smithies
英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学 学院Martin J. Evans
问题：实现基因打靶后基因的整合有没有 组织特异性？
第三阶段：转基因组织特异性表达
• 尽管基因打靶技术的应用实现了外源基因的 定点整合。但整合入的外源基因要随着生殖细胞 的发育进入各种组织细胞。这样外源基因的表达 就没有组织特异性，因而无法研究某一基因在特 定组织中的功能。 随着一系列组织特异性启动子的发现和应用， 导入的外源基因逐步实现了在特定组织细胞内的 表达。这样就使得对转入的外源基因功能的研究 精确到了组织特异性表达的水平.
二、转基因小鼠的制备原理与方法
(一)转基因小鼠制备实验流程：
1.选择小鼠品系
可以用远交系也 可以用近交系。一般采 用两种近交系的杂交一代。 C57BL/6J， Balb/c 近交系小鼠 C57BL/6J × Balb/c =F1 昆明小鼠（KM），远交系小鼠
C57BL/6J
2. 收获受精卵-百度文库排卵
3.导入外源基因
显微注射法(microinjection) 注射部位：雄性原核
4. 代养母鼠的制备 不育雄鼠和假孕母鼠。
用输精管结扎的方法制备不育 雄鼠，不育雄鼠与雌鼠交配可获得 假孕母鼠。
5.受精卵植入
将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的 输卵管或子宫内发育，小鼠孕期20天。
6. 首建转基因鼠 (founder)中转 基因的检测。
显微注射需要的受精卵可以通过小鼠 自然交配得到，但数量常不能得到保证。 因而需对雌鼠施以激素以获得足够数量的 受精卵——即诱导超排卵。
4-6周龄雌鼠在明暗循环的动物房内饲 养3-5天，即可作超排卵。一般以孕马血清 （PMS）模拟卵泡刺激素（FSH），人绒毛 膜促性腺激素（hCG）模拟黄体生成素 （LH）。PMS和hCG注射间隔42-48小时，排 卵发生于注射hCG后10-13小时。
超级小鼠 supermouse
外源基因的整合方式
这一阶段转基因技术的共同特点 是导入的外源基因是随机整合的。 这种随机整合的外源基因可能是单 拷贝的，也可能是多拷贝的。
外源基因的整合可能会产生 以下几种结果：
1.能够有效地表达而不影响动物的发育 以及正常的生理功能。 2.不能有效表达，整合入动物细胞基因组 中的外源基因无功能。 3.外源基因的整合导致动物细胞正常基因 的失活或激活癌基因，这样动物则不能正 常生长、发育。
Course for postgraduates
转基因动物 Transgenic Animal
郭长占
北京大学医学部 guo4626@yahoo.com.cn 2011.3
转基因与转基因动物的定
义
转基因动物是指用实验的方法将 外源基因导入早期胚胎细胞，使之整 合于细胞基因组中而建立的动物品系。 整合的外源基因称为转基因 （transgene) 。
转基因动物技术与基因功能的研究
转基因动物技术建立以前研究基因的功 能是将外源基因导入原核细胞或真核细胞 来进行。 但基因在离体单个细胞中的功能并不一 定能代表基因在整体中的功能。因为在一 个复杂的动物个体中，众多的基因彼此之 间在功能上并不是孤立的，而是相互关联、 相互影响的。而且一个基因在单一细胞中 的表达究竟会对整个机体的生理功能产生 什么作用也必须在整体水平上来研究。因 此，转基因动物技术目前是研究基因功能 的最好技术。
• 方法： • 1.PCR, Southern blot • 2. Real-Time PCR
7. 通过繁育建立转基因小鼠品系。 （1）.互交得到转基因纯合子小鼠
（2）.回交至少10代建立纯系转基因小鼠
→ × Fo♂ Fo♀ F1
8.转基因小鼠制备实验流程总结
（二）外源基因导入常用方法：
1. 显微注射法。 2. 逆转录病毒载体法。 3. 电脉冲法。
早期胚胎-单细胞期受精卵
受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成 一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称 为全能性。随着分化发育的进程，转基因会分 布到各种组织细胞中去，包括生殖细胞，因此， 转基因是可以遗传的。
转基因小鼠(transgenic mouse)
最早建立成功的转基因动物是转基 因小鼠(transgenic mouse)。由于制备转 基因小鼠比制备大的转基因动物要省时、 省力得多,因此转基因小鼠技术作为生命 科学研究的一个新的技术体系已经得到 越来越广泛的应用，特别是基因功能的 研究。
1. 显微注射法 (microinjection)
显微注射仪
显微注射(microinjection)
显微注射法(microinjection)
注射部位：雄性原核
2. 逆转录病毒载体法
（1）逆转录病毒基因结构
↓
LTR gag pol env LTR
4-8细胞期胚胎
（2） Moloney ES细胞
第一个转基因小鼠—超级小鼠的建立
1982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激 素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中 有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓 的“超级小鼠”(supermouse)诞生了(Palmiter et al.,1982:Nature,Vol.300,December 16,1982) 。 “超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学 界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实 验室竞相开展这方面的研究工作，因此，转基 因小鼠技术迅速发展，不断完善。