siRNA 载体的构建
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实验题目：pLL3.7-Mcl-1-siRNA 载体的构建
实验日期：2010年12月6日
实验记录者：孙向东实验参加者：孙向东
实验目的：
将退火后的shRNA片段克隆至慢病毒载体pLL3.7慢病毒载体中，构建成pLL3.7-Mcl-1-siRNA载体。实验材料：
pLL3.7慢病毒质粒
Sh-mcl-1-f：5'- AAC GCAGTCCTCTAGTGTTTCA TTCAAGAGA TGAAACACTAGAGGACTGC TTTTTT C-3'
Sh-mcl-1-r：5'-TCGAG AAAAAA GCAGTCCTCTAGTGTTTCA TCTCTTGAA TGAAACACTAGAGGACTGC GTT -3' Sh-GAPDH-f：5’- AAC GTA TGACAACAGCCTCAAG TTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATAC TTTTTT C -3’
Sh-GAPDH-r：5’- TCGAG AAAAAA GTATGACAACAGCCTCAAG TCTCTTGAA CTTGAGGCTGTTGTCA TAC GTT -3’
实验方法：
1. shRNA单链退火形成shRNA双链（实验方法参考Invitrogen公司Protocol：Generating the Double-Stranded Oligo (ds oligo)）
2．稀释shRNA 修改原因
3．酶切：
pLL3.7：20ul
Buffer B: 4 ul
BSA: 4 ul
dH2O: 8 ul
HpaI: 2 ul
XhoI: 2 ul
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37度4h（13：40～17：40）
4. 电泳胶回收：
5. 连接:
pLL3.7(XhoI/HpaI)： 2 ul
McL-1 siRNA： 4 ul
10×T4 DNA ligase Buffer: 1ul
dH2O: 2.5 ul
ligase 0.5ul
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16度4h，或者4度过夜（13：40～17：40）
6. 转化
7. 鉴定
实验结果：
实验结论/分析讨论：