成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

杨雪超樊明文

武汉大学口腔医学院(430079)

email:yangxuecao@

摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。

关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞

1．引言

目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法

2.1 材料

α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage）

2.2 方法

2.2.1细胞培养和克隆

采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。细胞计数板计数

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细胞浓度，调整后以1－2个细胞／孔的浓度接种于96孔板，常规培养7-14天，至出现细胞克隆（细胞数≥50为判定标准），扩大培养。

2.2.2 Hoechst33342染色

成功扩大培养的细胞克隆，取其第四代接种于6孔板，常规培养24小时，更换培养液（无血清的α-MEM，含0.12μg/ml Hoechst33342），37℃暗处孵育30分钟后1.5％冷福尔马林固定15分钟，冷PBS充分漂洗。倒置荧光显微镜下340nm波长光激发后观察荧光表达情况，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。

2.2.3 细胞的定向诱导分化

成功扩大培养的细胞克隆，待生长至90%汇集，0.15%胰酶消化后，以5x103/cm2接种于6孔板和24孔板。传代后第二天改为诱导液培养（矿化液为含10%胎牛血清，50μg/ml α-抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠的α-MEM；脂肪分化体系为含10%胎牛血清，10－6M 地塞米松，0.5mM IBMX，0.1mMα-抗坏血酸的α-MEM）。

2.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性

细胞接种于24孔板，矿化液连续培养14天，弃去矿化液，0.01M冷PBS冲洗三遍，每孔加入细胞裂解液200μL，室温振荡10分钟，收集上清液。按照试剂盒说明检测细胞的ALP活性。

2.2.5 矿化结节

细胞接种于6孔板，矿化液连续培养14天，中止培养，0.01M冷PBS冲洗三遍，4%中性福尔马林固定后进行Von Kossa染色，具体方法参见文献[8]。

2.2.6 牙本质唾蛋白（DSP）的检测

细胞接种于6孔板，每个克隆有5个复孔，一部分细胞加矿化液连续培养；对应复孔细胞则用常规培养液培养。14天行DSP免疫荧光染色。具体操作步骤为：冷PBS洗去细胞表面培养液，以4%中性福尔马林固定15分钟后，-20℃甲醇继续处理10分钟；正常山羊血清封闭20分钟，兔人DSP特异性抗体4℃孵育过夜，PBS洗3次；FITC标记二抗37℃作用30分钟，PBS洗3次；水性封片剂封片，荧光显微镜下观察。

取矿化诱导前后细胞蛋白样品20μg经5－12％ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。用1％BSA室温孵育1h，以封闭非特异性结合位点，加入兔人DSP特异性抗体4℃过夜。根据相应的二抗及三抗，DAB显色5～10分钟，观察Western blot结果。

2.2.7 Oil Red-O 染色

经脂肪分化体系诱导培养21天后，部分细胞4％中性福尔马林固定10分钟，Oil Red-O 染液常温孵育1小时，充分漂洗后镜检，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。。

2.2.8 PPARr2基因的表达

提取培养细胞总RNA，参考Genebank检索数据设计PPARr2特异性引物，上游：5' CTCCTATTGACCCAGAAAGC 3'，下游：5' GTAGAGCTGAGTCTTCTCAG 3'。RT-PCR检测PPARr2基因的表达。反应条件：50℃ 30min逆转录，94℃2min逆转录失活，然后94℃45s，56℃ 45s，72℃ 60s，35个循环，72℃延伸7min。PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化后测序。以正常人脂肪细胞细胞作为阳性对照。

3. 结果

3.1 细胞生长和形态

通过消化和滤网过滤，细胞皆以单细胞方式贴壁生长，24小时内呈类圆形或不规则形，伸展不完全；24小时后少数单个细胞开始分裂增殖[图一]，7天后少数细胞增殖能力旺盛形成克隆[图二]，细胞克隆呈三角形，多角形等多种形态，但都有一共同特点——从中心向四周放散生长。消化分散后，多数细胞能够形成克隆[图三]。

3.2 Hoechst33342染色

体外培养的第四代克隆来源细胞经Hoechst33342染色后，大部分细胞荧光表达阴性或弱

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