生物被膜与细菌耐药及控制策略-胡继红
临床微生物实验室标准化操作
• 最重要的标本必须最先接种培养基。
• 通过手术等侵入性手段采集的标本要以最 快的速度接种培养。
• 延误接种和处理某些标本会影响培养质量 及分离出病原菌的能力。
标本预处理
总是选择标本最脓的部分接种培养和涂片。 1体液（除外尿液） 1）正常无菌体液 • 澄清体液用细胞离心机浓缩涂片 • 此外培养时，需接种平板和肉汤培养，标本和肉
汤比为1:10. • 关节和腹腔液标本，标本培养量需10ml. • 对于需氧菌，培养时标本接种量大比标本离心后
接种培养阳性率更高。 • 通常关节液和腹腔液接种需氧血培养瓶和厌氧血
培养瓶各10ml可提高阳性培养率。
2）用试子采集的其他液体标本，接种平板和涂片
2 试子
拒收未使用运送培养基的干燥试子
• 用试子划平板第一区，如果有两个试子标本，则 用另一个涂片。
临床微生物实验室质量控制环节
分析后 紧急报告
标本运留送取、分分析析前前
标本合格判定
培养基、试剂 仪器设备
分析中
基本要求
临床微生物实验室质量控制范畴
标本分析前的质量控制： 微生物学特殊性——得到正确分析结果的基础
分析中质量控制： •常规仪器和设备 •（成品商业培养基）（诊断抗血清）
分析后质量控制： 1、临床微生物学“紧急报告值” 2、监测报告结果是否正确、清楚、及时。
2、正确的运送方式(sop)
（运送工具和有效时间及储存方法等） • 标本因冷藏及pH改变或在氧气中暴露，可能减少很
多种细菌的存活时间
脑膜炎球菌，淋病奈瑟菌， 流感嗜血杆菌，肺炎链球菌， 沙门菌，志贺氏菌，
霍乱弧菌，空肠弯曲菌及厌养菌
• 定量评价细菌数量的培养（尿标本）（运送时间）
白念珠菌对唑类药物的耐药与对策
形成 、 细胞壁 成分 的变 化等 方面 。
２ １ 药 物 外 排 泵 的 改 变 ．
居 于 正常人 群 中 的 胃肠 道 、 阴道 和 口腔 粘 膜 。 当机
体 免 疫功 能低 下 时 ， 导致 口腔 念 珠 菌 病 、 可 阴道 炎 、
２ １ １ 药物 外排 泵 Ｓ ｎ ｌ ｄ １ ９ ） Ａｌｅｔｏ ． ． ａ ｇａ （ ９ ５ 和 ｒ ｂ ｒｓ ｎ （ ９ ６ 的研 究发 现 白念 珠 菌对 氟康 唑 的耐药性 与 能 １９ ） 量 依赖 的外 排泵 相关 。研 究证 实 ２个外 排泵 系统 与
康 唑 、 康 唑 的 敏 感 性 增 加［ 而 Ｕ Ｃ２基 因 的 氟 １ ， Ｐ
Ｇｆ ８ ４ Ｄ或 Ａ６ ３ 功 能 获 得 性 突 变 则 导 致 Ｅ Ｇ１ ４Ｔ Ｒ １ 过 度表 达 ， 白念 珠 菌 对 唑 类 药 物 的耐 药 增 加 ［ 使 １ 。 Ｕｐ ２ ｃ ｐ直 接 结 合 Ｅ Ｇ 基 因 的 启 动 子 从 而 调 控 Ｒ
＊国 家 自然 科 学 基 金 （ ． ０ ７ ６ ０ Ｃ ５ ８ １ Ｎｏ ３ ９ ２ ６ ／ １ ０ ０ ）和 广 东 省 自然 科 学 基 金 （ ． ０ ５０ ８０ ０ ０ ３ ） 合 资助 Ｎｏ １ １ １０ ９ １０ ｌ １ 联 通讯 作 者 ： 革 化 ， ｍａｌｚ ａ ｇ ｅ ＠ｍａ． ｙｕ ｅ ｕ ｃ 张 Ｅ ｉ：ｈｎ ｇｈ ｉ ｓｓ． ｄ ．ｎ ｌ 作者 单位 ：． 山大 学 附 属 第 三 医 院 ， 鼻 咽喉 科 ， 州 ５ ０ ３ ； １中 耳 广 １ ６ ０ ２ 暨 南 大 学 附 属 第 一 医 院 ， 南 大 学 真 菌 病 研 究所 ， 州 ． 暨 广
基 因与 白念珠 菌对 唑 类 药 物 的 耐 药性 及 Ｅ Ｇ１ Ｒ ｌ高
白色念珠菌的生物膜及耐药机制的研究进展
白色念珠菌的生物膜及耐药机制的研究进展摘要：白念珠菌是最常见的与免疫和医学受损患者的生物膜形成有关的真菌，现在已经确定生物膜的形成是念珠菌病期间的一个主要毒力因子。
白念珠菌生物膜的形成是一个高度调控和协调的过程。
白色念珠菌引起的念珠菌病可表现为皮肤、粘膜或深层器官感染，对人体的危害极大。
白色念珠菌的主要治疗药物为唑类，但同时其对唑类药物的耐药性最严重，研究其耐药机制对于白色念珠菌的治疗有很大意义。
关键字：白色念珠菌；致病方式；耐药机制念珠菌属是共栖物种，因此是正常人类菌群的一部分，分布于皮肤、胃肠道和生殖道。
然而，念珠菌也可在易感患者中引起各种感染，包括老年患者、住院患者或免疫抑制患者。
侵袭性念珠菌感染是全球最常见的真菌感染之一。
据报道，念珠菌是导致医疗相关感染的主要原因之一。
在不同的念珠菌属中，白色念珠菌是最常见的临床菌种。
念珠菌病有多种临床表现，从无生命威胁的浅表皮肤粘膜感染到与念珠菌病相关的毁灭性侵袭性疾病[1]。
1.白色念珠菌的生物膜白念珠菌生物膜的发育过程可分为四个主要阶段：粘附、增殖、成熟和扩散。
在早期粘附阶段，酵母细胞附着在材料表面，形成一层基底，将生物膜固定在表面。
随后是增殖阶段，其特征是丝状化的开始，导致菌丝和假菌丝细胞的出现，这些细胞在整个生物膜发育过程中继续伸长，形成一个复杂的网络，有助于生物膜的整体稳定性。
在随后的成熟阶段，菌丝支架被包裹在一层由自产的外聚合物质（EPS）组成的毯子中，这些物质基本上起到粘合剂的作用，将整个生物膜结构固定在一起[2]。
生物膜形成的整个过程在分子水平上受到高度调控。
在过去的十年中，分子研究已经开始揭示白念珠菌生物膜生长模式下的信号传导过程。
早期研究表明，在白色念珠菌生物膜的形成过程中，形态发生转变、粘附相互作用和群体感应起着关键作用。
米切尔小组的开创性工作开始剖析单个基因/蛋白质对生物膜形成和维持的贡献，从而确定了参与生物膜形成的关键转录因子和粘附素。
胡继红-微生物检验的标准化是准确报告的重要保证
出现的 正常菌群
NO
临床意义 阈值
NO
2类 其他标本
3类 含大量定植菌 标本
尿、呼吸道 皮肤、表皮、粘膜、 粪便、咽部
Yes
Yes
Yes
NO
European Manual Microbiology.1st edition. EMCM, 2012.
Organism 菌株 E.coli 大肠埃希菌 Entero/Prot 肠杆菌属/变形 杆菌属 Pseudo 假单胞菌属 Enterococci 肠球菌 Staph saprophyt 腐生葡萄 球菌 Yeast 酵母菌
药敏 试验
是
+
+
≤2
+
+
≤103
不 适用 不
+
-
≥105
≤2
a)免疫正常患者：重复尿细菌学及细 胞学检查（可能尿道感染初期） b)免疫抑制患者（化疗、移植）
是 不 不 不 适用
不 确定
பைடு நூலகம்不 确定 不 确定
103 - 104 ≥105 ≤103
≥1 ≥2
标本采集不好可能污染 定植 无尿路感染或定植
-
类型
苛养菌
肺炎链球菌、草绿色链球菌、牛链球菌 化脓链球菌、无乳链球菌 嗜血杆菌属、卡他莫拉菌、奈瑟菌属 JK棒状杆菌、产单核李斯特菌
G+c G-b
金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌 粪肠球菌、屎肠球菌 肠杆菌科、假单胞菌属、嗜麦芽窄食单胞菌 洋葱伯克霍德菌、不动杆菌、黄杆菌属
厌氧菌 其他
拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞 菌属、消化链球菌属 分枝杆菌属，念珠菌属，丝状真菌
真菌生物膜耐药机制与防治研究进展
真菌生物膜耐药机制与防治研究进展真菌已成为医院获得性感染的重要病原体，在抗真菌治疗过程中耐药性真菌的增加引起医学界广泛关注，真菌生物膜的发现和其在真菌耐药性中发挥的作用引起学者广泛的重视，真菌生物膜耐药与防治研究不断进入新领域。
该文旨在阐明真菌生物膜的重要性，从生物膜的胞外机制、外排泵基因表达以及药物靶点的基因变异几个方面来阐述真菌生物膜的耐药机制，总结真菌生物膜病防治的最新研究进展。
标签：真菌；生物膜；耐药机制由于临床广谱抗菌药物治疗、器官移植、免疫抑制剂治疗、内置医疗器材治疗、放化疗以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行使得真菌感染的发病率呈上升趋势，由于效率低下的诊断方法和不恰当的初始抗真菌治疗使真菌感染死亡率高达45%[1]。
真菌感染分离的真菌性病原微中白假丝酵母菌感染所占比例55%以上，甚至有报道高达66.7%[2-3]，真菌耐药性发生是临床抗真菌治疗效果不佳的重要原因，已证实病原真菌生物膜的形成是真菌产生耐药性重要因素之一[4]，临床上大约有65%的感染与微生物在组织、器官或医疗设备表面形成生物膜有关。
该文从常见致病菌生物膜的形成的结构及影响因素、生物膜可能的耐药机制以及真菌生物膜病的防治方法等几个方面进行综述，阐明当前临床对真菌生物膜耐药机制与防治研究进展。
1 生物膜的结构及影响因素1.1 生物膜的结构生物膜是真菌形成菌落的生存方式，Chandra等通过激光扫描共聚焦显微镜对白色念珠菌生物膜超微结构观察发现生物膜（biofilm）是微生物群落为了自我保护而产生的一种可黏附组织表面由其自身产生的细胞外聚合物基质（ECM）包裹的三维结构菌细胞群体，对生物膜形成过程分进行详细观察后将其形成过程分为早、中、晚3 个阶段[5-6]。
1.2 生物膜形成的影响因素生物膜的形成受包括宿主的免疫状态、营养成分、药物以及生长环境的物理、化学因素等多种因素影响。
孙秋宁等研究发现血清及组织液有增加念珠菌粘附于生物材料表面的作用，能够明显增加生物膜念珠菌活性，可以促进生物膜形成[7]。
细菌耐药挑战与对策
TONGJI MEDICAL COLLEGE HUAZHONG UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY细菌耐药——挑战与对策 细菌耐药——挑战与对策华中科技大学附属同济医院 田德英概 述40年代 纯化获得青霉素几十年来抗生素的 进一步开发各种类型抗生素 广泛应用于临床60年代研制成 第一代头孢菌素新的抗菌药物不 断研制开发细菌优胜劣汰，耐药 菌队伍不断壮大发现越来越多的针对 各种抗生素的耐药菌 60年代分离出 第一例ß-内酰胺酶Ø 感染性疾病是临床常见病，尤以细菌感染最多 见； Ø 熟悉常见感染性疾病的致病菌及其耐药性，掌 握抗菌药物的抗菌谱、药代动力学及宿主感染 部位、全身情况等是合理应用抗菌药物的基础。
内容病例分析 细菌耐药机制 治疗对策123病例患者何× ×，男，46岁，屠户 主诉: 寒战、高热伴咳嗽7天，加重伴意识障碍6小时 病史：三天未解大便 查体：T 39.6℃,Ｐ110bpm, R26bpm, BP 110/60 mmHg ，谵妄状态，双侧瞳孔等大等圆，对光反射灵敏， 颈强2指，躯干部皮肤可见散在红色斑丘疹，压之褪色，左 2 下肺呼吸音弱，未闻及干湿罗音。
心率110次/分，律齐， 心音有力，未闻及杂音，腹平软，无压痛及反跳痛，未及 包块，肝脾肋下未及，双下肢不肿。
左侧克氏征可疑阳性， 病理反射未引出。
门诊资料血常规： WBC 22.3×109/L，N 0.80， L 0.20， Hb 116g/L，PLT 102×109/L 尿常规：RBC ±，WBC－，Pr－ 肝功能：ALT 225 U/L，AST 143 U/L， TBil 12.2mmol/L，DBil 5.6mmol/L 肾功能、电解质正常发热伴WBC改变的常见原因WBC增高 G＋球菌感染 血液系统疾病 恶性肿瘤 WBC不增高或降低 vG－杆菌感染，如伤寒、 TB v病毒感染 v原虫感染 v血液系统疾病 v结缔组织病初步诊断该患者急性起病，寒战、高热伴多系统损害：皮 疹、肺部感染、肝功能损害、中枢神经系统症状 初步诊断——发热待查：G＋球菌脓毒症？处理措施1使用抗生素前取培养标本 • 血培养 • 尿培养 • 咽拭培养 • 痰培养 及时进行影像学检查 • 床边胸片 • 床边心脏彩超 • 床边腹部B超 • 预约急诊头部CT处理措施2感染部位的确认与控制仔细进行全身检查，发现后背肩胛间区有一 疖肿，顶端有脓液，局部红肿 请普外科会诊，能否切开引流 取脓液培养处理措施3经验性降阶梯抗感染治疗（2008年脓毒症指 南指出应在1小时内用抗菌药物）n n n根据本地的细菌流行和耐药状况选药 强调能够覆盖所有最可能的感染病原体 所选药物应能够渗透到假定感染部位恰当的抗生素治疗是存活的最强烈的预测因素在第一小时给予有效抗生素治疗的患者79.9%存活 超过六小时后每延迟一小时给予抗生素存活率降低7.6%每小时Kumar A et al.Crit care med.2006;34:1589-1596同济医院连续3年耐甲氧西林葡萄球菌发生率90 85发 生 率 %80 75 70 65 60 55 50 2007 2008 2009MRSA发生率 MRSCN发生率年尚未发现对万古霉素、替考拉宁、利奈唑 胺耐药的G＋菌处理措施3高度怀疑G＋球菌感染，立即经验性给予万 古霉素0.5 q6h治疗 脱水、行腰穿，脑脊液检查、培养 第二天患者神志恢复，腰臀部疼痛伴双下 肢及会阴部麻木。
临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成与其耐药性的相关性分析-推荐下载
No correlation is found between biofilm formation and antibiotic resistance in these isolates by statistical analysis. Key words:Staphylococcus epidermidis;biofilim;drugresistance 生物膜的形成是细菌为适应自然环境而采取的一种策略。生物膜对抗抗生素和机体免 疫吞噬作用的特征是生物材料相关感染性疾病的重要原因。随着生物材料(人工瓣膜、人工 关节、静脉插管等)在临床的广泛应用,表皮葡萄球菌引起的临床感染日益增多[1]。虽然体 外实验显示感染细菌对抗生素敏感,但在体内却难以清除。生物膜状态下的细菌相对其浮游 状态具有显着增强的耐药性,因此,分析临床分离的表皮葡萄球菌生物膜形成能力与抗生素耐 药性的相关性,对指导临床有效控制表皮葡萄球菌引起的感染具有重要意义。 1 材料与方法 1.1 菌株来源和鉴定 收集成都地区两家医院患者临床标本中分离的 45 株表皮葡萄球菌,删除同一患者相同 感染部位分离的重复分离菌株。采用 MicroScan WalkAway 96SI 全自动微生物鉴定及配套 Positive Combo Panel Type 20(PC31 测试板)进行细菌鉴定。以表皮葡萄球菌 ATCC 12228 株 为生物膜形成的阴性对照株。 1.2 主要试剂及仪器 LB 肉汤(胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、氯化钠 10 g/L、葡萄糖 0.25 g/L)购自杭 州微生物试剂有限公司,MH 培养基及受试的药敏纸片均购自英国 Oxoid 公司。 1.3 方法 1.3.1 药敏试验 药敏试验采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐 KB 法药敏试验,按《全国临 床检验操作规程》(第三版)进行,根据 CLSI 2009 版判定结果。 1.3.2 表皮葡萄球菌生物膜形成能力检测 采用传统的半定量黏附实验检测表皮葡萄球菌生物膜形成[2],将 LB 肉汤培养 18h 的表 皮葡萄球菌用新鲜 LB 肉汤(0.25%葡萄糖)按 1∶200 比例稀释。将 0.2 ml 稀释后的菌液加 入 96 孔平底组织培养盘,每株分别移入 4 个平行孔。在 37℃培养 18 h 后,用移液器吸头吸干 每孔菌液,然后用 PBS(pH7.2)缓冲液洗板 3 次,然后用 BOUIN 固定液固定,用结晶紫染色,洗 去未黏附细菌,晾干,每孔加入 200 μl 丙酮酒精,微振荡,酶标仪检测每孔的 A570 nm 值。生 物膜形成阳性株筛选条件为:阴性对照菌株平均 A 值+3 倍标准差为界定值,以平均 A 值大于 界定值为生物膜形成阳性株。
生物被膜与细菌耐药及控制策略胡继红ppt课件
MIC50 MIC90 Geom.MeManIC Ra
8 32 8.573 .125 - 5
8 32 5.137 .06 - 25
32 256 3.962 .016 - 5
0.064 0.5 0.102 .016 - 1
16 256 4.077 .016 - 5
1 32 1.293 .016 - 2
• 生长于BF中的细菌，无论其形态结构、生 理生化特性及对抗菌药物的敏感性等都与 浮游生长的细胞显著不同，致病特点也不 同。
2019
-
22
细菌生物被膜耐药机制
C.A.Fus, European Society of Clinical Microbiology and Infectios Diseases,
细菌耐药的遗传学机制
2019
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12
3. 转座子介导的耐药性
• 转座子(transposon，Tn)
在染色体、或在同一细胞中的染色体与质粒间移动， 使结构基因的产
物大量增加，从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性。
Tn还可以使位于染色体上和非接合质粒上的基因转移到接合质粒中，因此 实现细菌间的基因转移或交换。
家和地区传播（大叶性肺炎）； （4）出现耐万古霉素屎肠球菌（VRE）感染； （5）耐青霉素和耐头孢菌素的草绿色链球菌（PRS）的出现（细
菌性心内膜炎）； （6）产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL）耐药细菌变异。
2019
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4
第一届卫生部全国细菌耐药监测中心网
(2005-2006 Mohnarin)
• 全国17家医院；收集菌株4075株； G+ 23% G- : 3150(77%) G+ : 925 (23%)
临床微生物实验室质量控制及质量保证胡继红
卫生部临床检验中心 胡继红
质量控制概念的引入
• 历史上，现代风险管理的概念引入实验室 之后，就以质量控制的形式出现。 • 狭义上指的是一项持续的、系统性的评估 工作来确保终产品的一致性——
根据可接受的程度： 事先建立好的允许限度下的精确度和准确度。
临床微生物实验室质量控制环节
质量保证持续监测
评价和持续改进检测病人标本结果的可靠性和有效性
QA监测
目标 质量、数量、体积，可接受的合格标本
标本
检测
报告
根据临床指症、诊断和其他临床资料，采 用适当检测方法
监测报告的正确，清楚、及时
服务对象 积极问询其需要，满意度，对抱怨的处理 理解 情况
临床微生物实验室质量控制范畴
标本分析前的质量控制： 微生物学特殊性——得到正确分析结果的基础
凝固酶: 区别金黄色葡萄球菌/凝固酶阴性葡萄球菌，药敏标准 致病性和用药等都不同
氧化酶： G-菌区别，肠杆菌科/非发酵菌/弧菌科/少见G-菌等 β-内酰胺酶：预测流感嗜血杆菌、卡他布兰汉菌和淋病奈瑟 菌对青霉素类抗生素敏感性；葡萄球菌属对青 霉素敏感性。
每个工作日或每次试验应做质控（阳性对照及阴性对照）
血培养的时机
• 针对血培养的时机缺乏系统的研究。尽管菌血症 经常出现寒战，但是在发热前，而发热时才会把 血培养提上日程。
• 有权威建议血培养应被安排在任意间隔。但在一 项回顾性调查中，Li等认为，在24小时内或固定 间隔获得血样的结果没有差别。 • 临床医生和实验者应根据患者的状态及怀疑的诊 断决定。对于败血症或不稳定的患者，血培养须 迅速，以便制定治疗方案。相反地，若在病情稳 定的患者怀疑是亚急性心内膜炎，应在固定间隔 采集血样。
感控笔记丨胡继红：懂感染，从解读细菌药敏报告开始（下）
感控笔记丨胡继红：懂感染，从解读细菌药敏报告开始（下）讲者：胡继红整理：胡秀琼审稿：张静团队：SIFIC感控笔记团队上一期感控笔记丨胡继红：懂感染，从解读细菌药敏报告开始（上），胡教授对影响药敏报告的多种因素进行了全面讲解，可是到底采用哪些方法进行抗菌药物敏感试验呢？拿到一份药敏报告，如何能够正确理解其中的意义和内涵呢？抗菌药物敏感试验方法药敏常规方法，作为表型检测的，如现在用的纸片法，仪器自动/半自动商品化仪器；参考方法有琼脂稀释法、肉汤稀释法、表型确认方法；还有基因型检测，耐药基因检测。
1、当进行以下检测时，需用MIC法而不能用纸片法：•葡萄球菌-万古霉素，达托霉素；•金黄色葡萄球菌（MRSA）-Oritavancin,Telavancin•肠球菌-万古霉素“中介”结果，达托霉素；•肺炎链球菌-头孢噻肟/头孢曲松、美罗培南（CSF常规报告），青霉素，阿莫西林/棒酸，厄他培南、亚胺培南、头孢呋辛、头孢吡肟•草绿色链球菌-青霉素•Beta溶血链球菌-达托霉素2、CLSI推荐对与下列疾病相关的分离菌群检测最小抑菌浓度及敏感性结果•心内膜炎、脑膜炎、败血症、骨髓炎、免疫抑制、假体装置•虽然“敏感”但对治疗无反应的病人3、何时用浓度梯度药敏试验（Etest）？细菌药敏试验及结果解释依据•主要是美国临床和实验室标准化研究院（CLSI）颁布，每年都会有更新。
•需氧菌/兼性菌（纸片扩散法、稀释法）药敏解释结果见M100-S27（2017）•少见菌和苛养菌（纸片扩散法、稀释法）药敏解释结果见M45-3建议常规试验和报告细菌/药物分组（稀释法、纸片法）•A组：基本试验和报告•B组：可用于首选试验，但选择性报告，当对A组同类药物耐药时可选用，脑脊液中分离肠道杆菌用三代头孢菌素；泌尿道分离菌株用复方新诺明，多种微生物感染，多部位感染；对A组药物过敏、不耐受/无效；感染控制目的。
•C组：替代性或补充性药物，当某些医院潜在对数种基本药物（特别是同类耐药或广泛流行株；治疗对基本药物过敏者；治疗少见菌感染等）或流行病学为目的向感染控制部门报告。
耐药表皮葡萄球菌生物被膜形成前、后差异蛋白表达的分析
４ ０ ０／ ， ｇ ／ ｍＬ ｔ ａ ｎ ｎ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ）ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ （ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｓ ａ ｌ ｉ ｎ ｅ ） ． Ｔｈ ｅ ｃ ｏ ｌ ｏ ｎ ｙ ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｗａ ｓ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｆ ｉ ｌ ｍ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ —
ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｓ ｉ ｌ ｖ ｅ ｒ ｓ ｔ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ｂ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｄ ｒ ｕ ｇ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ． ＣＲＡ ｐ ｌ ａ ｔ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｗａ ｓ ａ ｄ ｏ ｐ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈ ｅ ｃ ａ ｐ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｓ ￡ ｎ ＾ Ｚ ０ ｆ ０ ｃ ｆ ｓ ｅ ｐ ｉ ｄ ｅ ｒ ｍｉ ｄ ｉ ｓ ｆ ｏ ｒ ｐ ｏ ｌ ｙ ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｉ ｄ ｅ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ ａ ｄ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｎ（ Ｐ Ｉ Ａ ）ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｄ ｒ ｕ ｇ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ． Ｔｗｏ — ｄ ｉ ｍｅ ｎ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ —
国际检 验 医学杂志 ２ ０ １ ３ 年 １ ２ 月第３ ４ 卷第 ２ ３期
Ｉ ｎ ｔ Ｊ Ｌ ａ ｂ Ｍｅ ｄ ， Ｄ ｅ ｃ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ４ ，
耐 药 表皮 葡 萄 球 菌 生物 被 膜 形成 前 、 后 差异 蛋 白表 达 的 分析
细菌膜功能与细菌耐药性关系研究进展
放或 者认 为该通道无效 。铜绿 假单胞 菌对碳青 霉烯类 抗 生 素耐药的主要机制是主动外排 系统 的过度表 达并伴有 持续 高 产 Ａ ｍｐ Ｃ酶 ， 其中１ ６株 菌 株伴 有 外膜 膜 孔 蛋 白
Ｏ ｐ ｒ Ｄ ２基 因缺失 。淋病流 行株 的多重耐 药性与 外膜通 透性密切相关 ， ｍ ｔ ｒ Ｒ的突变 与淋 病流 行株 对 Ｂ一内酰胺 类抗生素 （ 包 括青 霉 素和头孢 三 嗪） 、 四环 素 、 环 丙沙 星 、
物浓度 ， 利于微生物 的生存 ’ 。药物外排 泵作用 与膜渗
透性改变常协 同作 用 ， 对 细菌 耐药 性 的产 生起 着重 要作
用。
２ 细菌外膜渗透功能 改变 与耐药性
由于药物 的作用 ， 细菌 改变 了外 膜蛋 白， 使 菌体 外膜 通 透性 降低 ， 阻 碍抗 生 素进入 细 菌 内膜靶 位 。外 膜通 透
《 沈 阳部队医药》 ｏ
・
１ １ ９・
细 菌膜 功 能 与 细菌 耐 药 性关 系研 究进 展
刘 清 郭海龙 冯 小桥 综述
关键词 细菌 耐药 膜 功能 生多重耐药 的重要原 因 Ｊ 。不动杆 菌对碳青 霉烯类 抗生 素耐药的原 因之 一也 是 细胞外 膜通 透性 低 ， 其外 膜通 透 性是大肠埃希菌 的 ３ ％， 比铜 绿假单 胞菌更 低 。Ｃ ｌ ａ ｒ ｋ 等” 在研究鲍曼不动杆菌对亚胺培南 的耐药 机制时 发现 耐药菌株 中 ３ ２ ． ７ ４— ３ ５ ． ７ ２ ｋ ｕ蛋 白表 达减少 ； 一个 ４ ５ ． ６ ４ ｋ ｕ蛋 白被确定是鲍曼 不动 杆菌 主要 的外膜孔 蛋 白， 这 个 孔蛋 白的丢失会 导致 内酰胺类 抗 生素 耐药 。Ｑ ｕ ａ ｌ ｅ等 观察 到对 碳 青 霉 烯类 抗 生 素 耐 药 的菌 株 ４ ６ ． ６ ３ 、 ４ ３ ． ６ ５ 、
控制细菌耐药的措施
控制细菌耐药的措施
谢景超
【期刊名称】《中南药学》
【年(卷),期】2006(4)5
【总页数】2页(P392-393)
【关键词】细菌耐药性;抗菌药物
【作者】谢景超
【作者单位】中南大学湘雅二医院老年内科
【正文语种】中文
【中图分类】R978
【相关文献】
1.全面推进动物源细菌耐药性控制——农业部兽医局负责人解读《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》 [J],
2.细菌耐药现状与耐药细菌的预防控制策略 [J], 倪语星;糜琛蓉
3.2008年度长春市儿童医院耐药菌简析及控制儿童耐药细菌措施 [J], 王淑桂
4.2008年度长春市儿童医院耐药菌简析及控制儿童耐药细菌措施 [J], 王淑桂
5.碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌控制措施的监测 [J], 胡玲
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细菌耐药的遗传学机制
3. 转座子介导的耐药性
• 转座子(transposon，Tn)
在染色体、或在同一细胞中的染色体与质粒间移动， 使结构基因的产
细菌生物被膜引起的——
耐药
体外药敏试验＝体内敏感性？细菌生物被膜（B来自ofilm,BF）群居
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互助求生存
• BF是细菌为适应自然环境而形成的;
• 系细菌吸附于生物材料或机体腔道表面， 分泌多糖基质，将其自身包绕其中形成的 膜样物；
• 生长于BF中的细菌，无论其形态结构、生 理生化特性及对抗菌药物的敏感性等都与 浮游生长的细胞显著不同，致病特点也不 同。
细菌生物被膜耐药机制
C.A.Fus, European Society of Clinical Microbiology and Infectios Diseases, Volume 12,Number 4,April 2006
１阻滞抗生素的渗透；
２吸附抗生素灭活酶，促进抗生素水解； ３被膜下细菌代谢低下，呈“亚冬眠状态”，对抗 生素的敏感性降低；低于致死量的抗菌药物又容 易使细菌产生高度耐药性； ４阻止机体免疫系统对细菌的清除，产生免疫逃逸 现象，减弱机体免疫力与抗生素的协同杀菌作用。
微生态制剂主要有三类: 即益生菌(probiotics) ,如双歧杆菌和乳酸杆菌等; 益生元(prebiotics) ,如双歧因子和各种寡聚糖等; 合生元(synbiotics) ,即益生菌和益生元同时并用的生态制剂。
– 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （HaMRSA)（医院获得） – 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCons） – 万古霉素耐药的金葡菌（全球6株，中国0%）
– 万古霉素耐药的肠球菌（美国最高17%中国0-5%）
细菌耐药的遗传学机制
1 染色体介导的耐药
• 细菌固有的耐药性（天然耐药）或通过染色体突变产生的 耐药性,与细菌的遗传和进化密切相关。 自发基因突变的现象可导致细菌某些表型和功能的丧 失，或获得新的功能，以对抗抗生素的作用。是同属细菌 的共同特征，如肠球菌耐头孢菌素类药物。
%R 19.7 9.4 35.8 1.1 34.2 15.4 1.6 14.6 0 0 76.3 72.2
%I 10.8 16.4 21.3 1.3 19.7 4.3 0.5 10 0 0 1.1 3.8
%S 69.5 74.1 42.9 97.6 46.1 80.3 97.5 75.5 100 100 22.6 24
不同类抗生素的常见耐药机制
• • • β-内酰胺类：细胞壁通透性降低；与PBPs亲和力与结合率 降低；产生β-内酰胺酶；细菌自溶酶缺乏。 氨基糖甙类：细胞膜主动传递中摄入减少；产生钝化酶；核 糖体30S亚基蛋白改变；Eh↓和pH↓均可降低活性。 喹诺酮类：细胞外膜OmpF量降低，使喹诺酮类摄入减少， 同时细胞膜传透通道改变，外流加快，细菌内积蓄减少； DNA旋转酶A亚基蛋白改变。 大环内脂类：核糖体50S亚基改变；局部pH↓可降低活性。
• 肠球菌占: 27%(249)
耐青霉素粪肠球菌:23%; 耐青霉素屎肠球菌:90%
• 5株对万古中介的肠球菌,未见耐万古肠球菌
医院内感染中主要革兰阴性杆菌的耐药
In vitro susceptibility of 14 antibiotic agents against 371 strains of E. coli
在治疗过程中尽量选用能透过生物被膜的杀菌剂。
喹诺酮类药物：氟罗沙星、加替沙星等对细菌生物被膜有较好的渗透性， 对生物被膜下生长缓慢的细菌也有的杀菌作用； 大环内酯类药物：克拉霉素、阿齐霉素、罗红霉素等可抑制细菌生物被 膜的形成，与氟喹诺酮类药物联用时，可提高后者对细 菌生物被膜的渗透性和对被膜下细菌的杀菌活性。
第一届卫生部全国细菌耐药监测中心网
(2005-2006 Mohnarin)
• 全国17家医院；收集菌株4075株； G- : 3150(77%) G+ : 925 (23%) • 葡萄球菌占: 536 (58%)
MRSA： 63%、 MRSE: 83%
G+ 23% GG+
G77%
葡萄球菌 肠球菌 其他G＋菌
金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌
在各种生物医学材料如导尿管、大静脉导管、气管插管 等的表面形成生物被膜，导致所谓生物医学材料相关感染。
导尿管 菌膜外表面更促使黏附 金黄色葡萄球菌菌膜
BF相关感染的类型
生物医学材料相关感染有逐年上升的趋势
• 导尿管相关泌尿系统感染发生率为92%～93%，约占院 同感染的40%； • 心脏外科生物材料（人工瓣膜）臵入术合并感染发生 率为33.3%； • 90%的机械通气患者气管插管处有细菌定植并发复发生 感染； • 大静脉导管、伤口引流管、人工关节臵入等相关感染 的发生率亦较高。
导管相关感染—— 凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）
• 以表皮葡萄球菌为主，同时它也是医院内感染败血症的常见细 菌（CNS中耐甲氧西林菌株） • 可产生大量细胞间脂多糖粘附素(polysaccharide Intercellular Adhesin，PIA)与细胞外粘液样物质 (Extracellular Slime Substanece，ESS)，可通过不同途径 吸附在导管表面，引致导管所致的感染。 • 动物实验已证实PIA、ESS具有干扰宿主防御功能，ESS可抑制B 淋巴细胞的遗传性质、使合成免疫球蛋白减少；还可干扰吞噬 细胞；可保护包埋在其中的葡萄球菌免受抗生素的作用，由于 膜状物形成的生物膜 ，使得感染灶中细菌可以不断释放，从 而引起败血症。
BF引起脑脊液分流术后感染
导管内表面 导管外表面
球菌和杆菌
C.A.Fus, European Society of Clinical Microbiology and Infectios Diseases,Volume 12,Number 4,April 2006
控制BF引起细菌耐药的策略
１、抑制生物被膜的形成
• 耐药基因决定了各种各样的机制，使细菌抵抗特 定抗菌药物的抑制作用。
细菌耐药性变异的趋势
近年来临床上发现的耐药细菌的变迁有以下6个主要表现： （1）耐甲氧西林的金葡菌（MRSA）感染率增高； （2）凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）引起感染增多； （3）耐青霉素肺炎链球菌（PRP）在世界范围，包括许多国 家和地区传播（大叶性肺炎）； （4）出现耐万古霉素屎肠球菌（VRE）感染； （5）耐青霉素和耐头孢菌素的草绿色链球菌（PRS）的出现（细 菌性心内膜炎）； （6）产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL）耐药细菌变异。
%I 17.3 5 15.7 4.7 10.7 7.5 6.9 11.3 2.2 0
%S 58.8 59.4 58.2 74.5 78.3 64.2 64.2 60.4 74.8 95.6
MIC50 16 4 8 2 1 0.5 1 2 4 2
MIC90 64 256 128 16 16 16 16 16 256 2
• 对FQs 的耐药率高达 >70% • 对3-4代头孢菌素耐药机制几乎全为ESBLs
• 其中头孢吡肟和头孢他啶保持了高效
绿脓假单胞菌
In vitro susceptibility of 10 antibiotic agents against 318 strains of P. aeruginosa
对于耐药性而言，如果编码抗菌药物作用靶位的核苷 酸发生点突变，导致转录的靶位蛋白空间构象发生改变， 结果使药物与靶位之间的结合力下降或丧失，而使细菌产 生耐药性。
倪语星，洪秀华主编。细菌耐药性监测抗感染治疗。人们军医出版社，2002年
2 质粒介导的耐药
• 目前该类耐药在临床上占有重要地位
• 质粒可以通过接合或转导作用在不同的细菌之间进行转移。
物大量增加，从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性。 Tn还可以使位于染色体上和非接合质粒上的基因转移到接合质粒中，因 此实现细菌间的基因转移或交换。
• 整合子
可移动，可捕获和整合细菌的耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散 中起到了至关重要的作用。 整合子可在不同细菌中水平传播，在同一类整合子上可携带不同的耐 药基因盒，同一个耐药基因又可出现在不同的整合子上。细菌的耐药基因 可以在不同的整合子中移动，介导多重耐药的形成。
细菌耐药的遗传学机制
细菌耐药生物化学机制
（一）细菌产生灭活酶或钝化酶 使抗菌药物失活或结构改变； （二）细菌药物作用靶位改变或数目改变
使之不与抗菌药物结合；
（三）细菌细胞膜渗透性改变
使之不能进入菌体内
（四）细菌主动药物外排机制
将药物排出菌体之外
（五）细菌生物被膜的形成
这些耐药机制不是相互孤立存 在的，两个或更多种不同的机制相 互作用决定一种细菌对一种抗菌药 物的耐药水平。
MIC Range .125 - 256 .064 - 512 .016 - 512 .125 - 512 .016 - 256 .016 - 64 .064 - 64 .064 - 64 .125 - 512 .25 - 128
全球关注的多重耐药（表型）的阳性球菌
• 社区获得MRSA (CaMRSA)
•
• 四环素类：药物外流加快，在细菌体内积蓄减少；核糖体 30S亚基改变；产生灭活酶。 • 氯霉素类：细胞膜摄入减少；产生氯霉素乙酰转移酶。 • 林可霉素类：核糖体50S亚基改变，细菌产生灭活酶。 • 肽 类：如万古霉素，细菌不易产生耐药性，但也可由靶 位改变而产生耐药。 • 磺胺类：改变二氢叶酸合成酶的结构；增加磺胺的拮抗物 PAPA的产量。
Antibiotic name Cefoxitin Cefoperazone/Sulbactam Ceftriaxone Cefotaxime/Clavulanic Cefotaxime Ceftazidime Ceftazidime/Clavulanic Cefepime Imipenem Meropenem Ciprofloxacin Levofloxacin