生物素、亲和素标记技术

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临床免疫学：第十三章生物素-链霉亲和素标记免疫技术

2、用0.1mg/L,pH9.0 NaHCO3溶液将纯化的1g抗体稀释为1～2g/L;
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合，室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成新的标记物。
10
3、生物素标记抗体（IgG）的制备基本原理生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽键，从而使其标记上生物素。
11
4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
29
17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰后形成的衍生物，只有活化生物素才能偶联各种其他生物大分子，如蛋白质、多糖、荧光素等。

标记亲和素生物素法

标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法是一种常用的生物化学实验技术，用于研究蛋白质的相互作用。

本文将介绍亲和素生物素法的原理、应用和实验步骤。

一、原理亲和素生物素法基于生物素（biotin）与亲和素（avidin或streptavidin）之间的高度特异性结合。

生物素是一种水溶性维生素，与亲和素结合后形成稳定的复合物。

利用这种结合关系，可以将含有生物素的分子与亲和素结合，从而实现对目标分子的标记和纯化。

二、应用亲和素生物素法在生物科学研究中有广泛的应用。

其中一些主要应用包括：1. 蛋白质纯化：通过将含有生物素的标签蛋白与亲和素结合，可以实现对目标蛋白的高效纯化。

2. 免疫组化：生物素标记的抗体可以与细胞或组织中的特定抗原结合，从而实现对抗原的检测和定位。

3. 蛋白质相互作用研究：通过将目标蛋白与生物素标记的配体蛋白结合，可以研究蛋白质的相互作用和信号传导机制。

三、实验步骤亲和素生物素法的实验步骤主要包括以下几个方面：1. 标记生物素：将生物素与所需标记的分子（如蛋白质或核酸）进行化学反应，将生物素引入目标分子中。

2. 制备亲和素柱：将亲和素（如avidin或streptavidin）固定在柱子上，形成亲和素柱。

亲和素柱可以商购买或自行制备。

3. 样品处理：将标记了生物素的分子与亲和素柱接触，使其与亲和素结合。

4. 洗脱：通过改变溶液条件，如改变pH值或添加竞争性配体，使亲和素与目标分子解离，从而洗脱目标分子。

5. 分析和应用：将洗脱得到的目标分子用于后续实验或分析，如Western blot、质谱分析等。

四、实验注意事项在进行亲和素生物素法实验时，需要注意以下几点：1. 使用高纯度的生物素和亲和素，以确保实验结果的准确性。

2. 选择适当的洗脱条件，以实现目标分子的高效洗脱。

3. 控制实验中的非特异性结合，以减少背景信号。

4. 根据实验需要选择合适的生物素标记方法，如目标分子的标记位置和标记方式（N-末端、C-末端或内部标记）。

生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用

步法、４步法和５步法等。多步法是在２步法原理的基础上，由于需要清除体内相关的影响因子，而选择不同的清除剂而
收稿日期：０ —２１２９１７０基金项目：国家自然科学基金面上项目：６０８３７５４０
２０年２月第１０１７卷第ｌ
５７
・
综
述・
生物素．和素预定位技术在亲肿瘤诊断和治疗中的应用
邓新荣杜，进。罗志福，
（．１中国原子能科学研究院同位素研究所，京１２１；．北０４３２中国同位素有限公司，京１０４）北００５用中具有广泛的应用前景。利用其作用特点进行肿瘤显像诊断和靶
向治疗的研究是一个热点。２生物素一亲和素系统预定位技术在肿瘤显像和治疗中
应用的研究现状
肿瘤组织的浓聚，提高了药物的有效性并减少了毒副作用。预定位技术的机理主要依据两类反应：和素（白素，亲卵
ａｉｎＡ）ｖｉ，或抗生物素蛋白链菌素（霉亲和素）ｓｅｔｉｉ，ｄ链（ｔｐａｄｎｒｖ
旦结合后很难分离。但当生物素或亲和素的活性受到损
伤时。其结合能力会下降０。
１２生物素．亲和素系统的特点
ＢＳ既可偶联抗体等一系列大分子活性物质，可被酶Ａ又
肿瘤预定位显像和治疗的具体方案可以分为２步法、３

亲和素与生物素连接

亲和素与生物素连接
亲和素与生物素，生命中的紧密连接。

亲和素和生物素是生命中不可或缺的两种物质，它们之间有着
紧密的连接。

亲和素是一种蛋白质，它在生物体内起着极其重要的
作用。

亲和素通过与生物素结合，形成了生物素-亲和素复合物，这
种复合物在细胞内参与了许多重要的生物化学反应。

生物素是一种维生素，它在细胞代谢中扮演着关键的角色。

生
物素与亲和素结合后，形成了一种生物素-亲和素复合物，这种复合
物在许多酶催化的生物化学反应中起着媒介作用。

这些反应包括葡
萄糖新陈代谢、脂肪酸合成和氨基酸代谢等，这些都是维持生命所
必需的过程。

亲和素和生物素的连接不仅仅局限于细胞内的生物化学反应，
它们也在医学和生物技术领域发挥着重要作用。

生物素标记技术利
用了生物素和亲和素之间的结合，用于检测和分离蛋白质和核酸等
生物分子，这为科学研究和医学诊断提供了重要的工具。

总之，亲和素和生物素之间的连接是生命中不可或缺的一部分。

它们共同参与着细胞代谢和生物化学反应，为维持生命的正常运转提供了重要的支持。

同时，它们的结合也为科学研究和医学诊断提供了重要的技术手段。

因此，亲和素与生物素之间的连接是生命中不可或缺的一环。

生物素-亲和素标记技术完整讲解

4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡 2.上样 3.洗杂 4.洗脱
五反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。
1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤2亲和素生物素过氧化物酶法abc法即亲和素生物素过氧化物酶法avidinbiotincomplextechnologyabc其原理是预先按一定比例将亲和素或链霉亲和素与酶标生物素结合形成可溶性的亲和素或链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物当其与检测反应体系中的生物素化一抗直接法或生物素化二抗间接法相遇时复合物中未饱和的亲和素或链霉亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合
磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能力。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用
BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作
BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联，先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大。李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗，最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定，结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星，与传统放射性同

临床免疫学：第十三章生物素-链霉亲和素标记免疫技术

生物素（biotin，B）, 又称维生素H 、B7,动植物中广泛存在，卵黄和肝中含量高；
MW244.31D,有两个环状结构；
Ⅰ环为咪唑酮环，为与亲和素结合部位；
Ⅱ环为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端可与生物大分子连接，形成生物素标记物。
咪唑酮环噻吩环
羧基
3
活化生物素噻吩环上戊酸侧链
第十三章
生物素－链霉亲和素标记免疫技术
Biotin-Avidin Labelling Immunoassay Tech
1
第一节生物素和亲和素第二节生物素和亲和素标记物的制备第三节生物素和亲和素系统的技术方法第四节技术评价与应用领域
2
T lymphocyte
第一节生物素和亲和素
PAP-ABC复合法检测原理示意图
第四节技术评价与应用领域
一、技术评价 1、生物素（B）和亲和素（A）之间的
高亲和力，使反应试剂经得起高度稀释，降低或避免了非特异性结合； 2、二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖等活性物质； 3、具有多级放大作用，使其具有高灵敏性；
23
二、应用领域 1、BAS与免疫标记技术适用于微量抗原、抗体及其他生物活性物质
可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记后活性会降低；
5
亲和素（avidin,A）从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种
蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组成，每个亚基都可以结合一个生物素分子。与生物素结合的特异性高、稳定性好。
K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody）
12
二、亲和素标记物的制备 1、几乎所有用于标记的物质均可与亲

生物素-链霉亲和素,作为荧光标记

生物素-链霉亲和素，作为荧光标记一、生物素-链霉亲和素的定义生物素-链霉亲和素是一种用于标记生物分子的荧光标记物。

它是由生物素和链霉亲和素组成的复合物。

生物素是一种维生素B7，也称作维生素H，它与链霉亲和素的结合具有较高的亲和力。

链霉亲和素则是一种可以与生物素结合并发出荧光的物质。

将生物素-链霉亲和素与所需标记的生物分子结合后，可以利用链霉亲和素的荧光发射信号来对生物分子进行检测和观察。

二、生物素-链霉亲和素的制备生物素-链霉亲和素通常通过化学合成的方式进行制备。

首先需要合成生物素分子和链霉亲和素分子，然后将两者进行反应结合，得到生物素-链霉亲和素复合物。

制备好的生物素-链霉亲和素可以在实验室中用于各种生物标记的研究工作。

三、生物素-链霉亲和素的特性1. 高亲和力：生物素和链霉亲和素之间的结合具有较高的亲和力，能够稳定地结合在一起，确保标记物在实验过程中不会轻易分离。

2. 显著荧光特性：生物素-链霉亲和素复合物具有明显的荧光特性，可以在适当的荧光激发条件下发出强烈的荧光信号，便于实验者进行观察和测量。

3. 稳定性：生物素-链霉亲和素复合物在适当的条件下具有良好的稳定性，可以在实验室中长时间保存和使用。

四、生物素-链霉亲和素在生物学研究中的应用1. 蛋白质标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记目标蛋白质，通过观察蛋白质的荧光信号，可以研究蛋白质在细胞中的表达和定位等信息。

2. 细胞标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记细胞膜表面的生物分子，有助于研究细胞相互作用和信号传导等生物学过程。

3. 分子探针：生物素-链霉亲和素作为一种标记物，可以用于研究分子间的相互作用和结构等相关信息。

4. 荧光显微镜：生物素-链霉亲和素标记的细胞和分子可以在荧光显微镜下观察，进一步拓展了荧光显微镜技术在生物学研究中的应用。

五、结语生物素-链霉亲和素作为一种荧光标记物，在生物学研究中发挥着重要的作用。

它具有高亲和力、显著的荧光特性和良好的稳定性，能够在生物标记的实验中提供可靠的信号和结果。

生物素-亲和素

该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面，使其更利于观察，提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素（BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，它由四个相同的氨基酸亚基组成，亚基之间通过二硫键连接，亲和素的每一个亚基含有一个与生物素结合的位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其他活性。生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。

亲和素与生物素系统的基本原理

亲和素与生物素系统的基本原理1979年，Guesdon及其同事首先将生物素—亲和素应用于免疫组化技术中，并成功地建立了标记亲和素—生物素技术(LAB)和桥亲和素—生物素技术(BAB)。

1981年，Hsu在LAB法和BAB法的基础上，先后建立了生物素—亲和素间接法及ABC法。

近年来，由于双重免疫组化标记技术的发展，除ABC-HRP试剂外，还制成了ABC-AKP和ABC-GOD试剂，进而发展了ABC-AKP等技术。

同时人们又对ABC法进行改进，相继出现了快速ABC法、二步ABC法、PAP和ABC连用等技术。

随着链霉亲和素(streptavidin)的应用又出现了LSAB、S-P、SABC等方法。

1．标记亲和素—生物素法(1abeledavidinbiotin，LAB)将亲和素与标记酶(HRP)结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体(一抗或二抗)结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。

细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。

2．桥接亲和素—生物素法(bridgedavidinbiotin，BAB)先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”物素连接，也可达到多层放大效果。

将生物素化抗体与酶标记生3．亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC)此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合，形成亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC复合物)。

抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物(此ABC复合物不能饱和，即亲和素上的4个结合位点最多允许3个位点与生物素化酶结合，留1～2个位点与生物素化二抗结合)结合，最终形成巨大复合体。

因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。

常用分子标记技术原理及应用

2 应用
追踪分子代谢和动力学研究、分析样品中的放射性同位素含量、放射性示踪和药物代谢研究。
3 注意
放射性同位素的使用需要特殊的安全操作和处置措施，遵循放射性防护法规。
酶标记技术原理及应用
原理
酶标记技术利用酶与底物的特异性反应，将酶连接到目标分子上，通过酶的催化作用进行检测和定量。
应用
• 酶活性测定和酶底物检测 • 蛋白质相互作用分析 • 医学诊断和药物筛选
应用
生物传感、分子成像、疾病诊断和药物递送系统。
分子印迹技术原理及应用
原理
分子印迹技术利用分子模板与功能单体的相互作用，构筑具有目标分子识别特异性的聚合物材料。
应用
• 选择性分离和富集目标分子 • 分子识别和传感 • 分析化学和生物医学研究
利用放射性同位素对分子进行标记，主要用于追踪分子代谢和分析样品中的放射性同位素含量。
3 酶标记技术
4 生物素-亲和素系统标记技术
通过将酶连接到目标分子上实现标记，常用于酶活性测定、分子检测和医学诊断。
利用生物素与亲和素的特异性结合，对目标分子进行标记，常用于免疫组织化学和分子生物学研究。
荧光标记技术原理及应用
原理
荧光标记技术利用荧光染料或荧光蛋白的特性，将其连接到目标分子上，通过激发和发射光的特性进行检测和观察。
应用
• 细胞成像和活细胞追踪 • 蛋白质分子定位和表达分析 • 分子交互作用研究和蛋白质结构解析
放射性同位素标记技术原理及应用
1 原理
放射性同位素标记技术利用放射性同位素对目标分子进行标记，通过放射性衰变进行检测和测量。
生物素-亲和素系统标记技术原理及应用
1
原理
生物素-亲和素系统标记技术利用生物素与亲和素的特异性结合，将生物素或亲和素连接到目标分子上。

生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析

4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交液相杂交原位杂交基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。
三实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）（3）标记生物素-抗生物素法（ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一背景二原理三实验方法及步骤四应用五反应特点六应用前景
一背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡，方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。

生物素和亲和素的结合原理

生物素和亲和素的结合原理生物素和亲和素都是一种广泛存在于生命体内的小分子，它们被广泛用于生物学研究和医学诊断。

生物素和亲和素的结合是一种高度特异性的作用，基于它们之间的生物化学相互作用，在此基础上进行蛋白质定位、蛋白质纯化等操作。

本文将重点介绍生物素和亲和素的结合原理。

1.生物素和生物素结合蛋白生物素是一种小分子，又称维生素H或D-生物素。

生物素的作用是参与体内蛋白质、脂类和碳水化合物的代谢，它是七种水溶性维生素之一，通常以其共价键进行结合。

生物素结合蛋白是一种高度特异性的受体，它能够特异性地识别并结合生物素。

生物素结合蛋白是一种相对分子量较大的蛋白质，通常也被称为生物素连接蛋白。

生物素与生物素结合蛋白之间的相互作用是一种具有可逆性的高亲和力非共价结合，其结合常数约为10^15M^-1。

2.亲和素和对应配体亲和素是一种小分子，它也被称为标记物，是一种在生物学和生物化学实验中经常使用的化学试剂。

亲和素结合蛋白是一种糖蛋白，它是一种高度特异性的受体，它能够特异性地识别并结合亲和素。

常用的亲和素包括：FITC，PE，biotin，HRP等。

在细胞学、生理学、生化学和分子生物学研究中，亲和素具有广泛的应用价值。

生物素通常被共价结合在目的蛋白质上。

如果要将目的蛋白质用于蛋白质定位或纯化等操作，我们可以使用以生物素为结合标记的亲和素。

这种亲和素（例如Streptavidin）可以特异性地结合生物素，从而将目的蛋白质和耦合生物素的标记物固定在一起。

由于生物素与生物素结合蛋白之间的结合常数异常高，这种方法可以实现非常高亲和力的蛋白质捕捉，这大大提高了蛋白质定位和纯化的效率和特异性。

亲和素也可以作为标记物，结合在目的蛋白质上。

一般来说，亲和素标记物非常容易与相应的亲和素结合蛋白发生相互作用。

例如，biotinylated antibodies通常可以与Streptavidin相互作用，从而实现目的蛋白质高度特异性的捕捉和富集。

生物素-亲和素系统相关技术3

3、BAS在放射免疫技术中的应用
4、
BAS在分子生物学中的应用
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
PCR技术具有高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的
还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，
且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生
物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）
-生物胞素（MPB）。
4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三
磷酸、BNHS和BHZ。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
降低ALP的活性。
活化生物素可与不同的大分子物质结合，应
根据可标记基团的种类及特性，选择相应的
活化生物素；
抗体：BNHS
偏酸性抗原：BHZ
核酸：光生物素
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即
生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级放大作用的物质基础。

生物素、亲和素标记技术

2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
3 生物素酰肼(BHZ)：
制备：生物素 +水合肼标记特点： BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记
适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA
三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
1 概念：亲和素(avidin)：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质 2 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD
3 ABC法： ⑴ A+B· E ⑵ Ag+B· Ab
A- B· E----------ABC Ag-Ab· ABC Ag-Ab· B B-ABC
பைடு நூலகம்
特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC
+A
+A
返回
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
返回
3 结构特点：咪唑酮环/四氢噻吩环结合亲和素侧链末端羧基结合蛋白质
4 溶解特性：难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)
5 等电点： PH=3.5 6 其它特性：羧基需经活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化的生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）

生物素-亲和素标记技术

生物素-亲和素标记技术孔令青;李勇;高洪;严玉霖【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2008(29)4【摘要】生物素-亲和素系统(BAS)是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术,研究证明生物素与亲和素依靠接触表面均一的多层膜来维系其稳定的结合.随着不断的探索和研究,该技术现已发展出多种标记方法,例如桥-亲和素-生物素标记法、亲和素-生物素-过氧化物酶法、标记生物素-抗生物素法,由于该标记技术具有优秀的性质,因此很快渗透到多个学科,在细胞和抗原的定位和检测中体现出极其重要的作用.目前,BAS已广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域,并取得较好的效果.文章对该技术的特点、方法和应用做了简述.【总页数】3页(P100-102)【作者】孔令青;李勇;高洪;严玉霖【作者单位】云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用 [J], 吴在荣;王宏锐2.外源性生物素对基于生物素-链霉亲和素化学发光技术干扰的研究进展 [J], 刘栋;仝慧;陈斌;张宁;胡健;王晓琴3.抗亲和素鼠单克隆抗体增强亲和素-生物素免疫技术和免疫组织学染色的敏感性[J], W.F.Cassano;张红毅4.用亲生物素蛋白-生物素酶标法对植物凝集素亲和乳腺癌的初步观察 [J], 卢百川;黄泰安;贺晓英5.不同生物素检测系统在核酸分子杂交检测中的应用——Ⅲ 链霉亲和素-碱性磷酸酶标记生物素检测系统 [J], 刘钟瑸;杨秋霞;王丽群;赵玉莹;康洋;杨贵贞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生物素亲和素

生物素亲和素生物素亲和素3篇生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。

如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。

计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2、在打开之前，平衡生物素至室温。

加2mgSulfo-NHS-Biotin 于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。

4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的.管中。

5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。

6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。

如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

2、测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。

3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

生物素-亲和素技术锚定肝素于胰岛表面

１．５，２．０ｇ／Ｌ肝素，培养液中孵育１ｈ，培养液洗涤３次，最终在胰岛表面形成生物素一亲和素一肝素复合物。上述孵育温度均为３７ ℃ 。同时设立对照组，只采用ＣＭＲＬ１０６６培养液进行上述处理。
将上述制备的胰岛（每组１０Ｏ个胰岛）分别置于这２０种培养液中孵育１ｈ，后用培养液洗涤３次。再加入１ｇ／Ｌ亲和素，
成人胰岛的分离和纯化：采用高渗枸橼酸盐腺嘌呤液和威斯康星大学保存液原位灌注、腹部多器官联合切取法获
取胰腺。应用相对密度分别为１．０７０与１．１００的淋巴细胞
分离液在血细胞分离机中进行连续密度梯度法纯化胰岛。首先安装细胞淘洗袋，留下１条管路备用，与装淋巴细胞
孵育３０ａｉｒｎ，后培养液洗涤３次。最后，分别加入Ｏ．５，１．０，
动泵并取出ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ管路，血管钳夹住淘洗袋根部，按下Ｃｏｂｅ２９９１的泵出键，调整离心速度２４００ｒ／ｍｉｎ，并计时５ｍｉｎ；离心５ｍｉｎ后，缓慢调节泵出速度为１Ｏ０ｍＬ／ｍｉｎ，依次收集泵出的胰岛悬液，每瓶混匀后取样１００ｕＬ，双硫腙染色后于显微镜下观察胰岛的数量和纯度。将胰岛悬液瓶置于

生物素、亲和素标记技术

临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术

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