生物素、亲和素标记技术

生物素、亲和素标记技术
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一、生物素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
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1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布 的一种小分子生长因子，又名辅酶R或 维生素H。
2 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
(在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸 ）
标记特点: (同BNHS) BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的
适用：(同BNHS) 标记Ab、酶、中性或偏碱
性教学的pptAg、DNA
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3 生物素酰肼(BHZ)： 制备：生物素 +水合肼 标记特点：
BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记 适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA
B·E
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省 却了加B-E的步骤
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3 ABC法： ⑴ A+B·E ⑵ Ag+B·Ab
A- B·E----------ABC Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC
特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复 合物ABC
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+A
+A
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Ag-Ab1-Ab2-B + A-E Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
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+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC 教学ppt Ab-Ag-Ab-B-ABC20
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DMF 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺
二环己基碳二亚胺 标记特点：
BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的
适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA
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2 长臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸
制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺 二环己基碳二亚胺
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六、技术类型：
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹 心法、间接法、竞争法等，在次基础上 引入A-B系统。
1 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A
B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
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2 BA法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-
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2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
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五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
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三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
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1 概念：
亲和素(avidin)：是动物微生物中提 取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。
链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养 液中提取的一种蛋白质
2 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD
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3 结构特点： 咪唑酮环/四氢噻吩环
结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质
4 溶解特性： 难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)
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5 等电点： PH=3.5
6 其它特性： 羧基需经活化修饰才能结合蛋白质 （羧基活化的生物素，称为活化生物素， 也叫生物素衍生物）
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二 生物素衍生物的种类及特性： 1 生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS)：
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3 结构特点： 每分子由四个亚基组成
4 溶解特性：溶于水，C=5mg/ml
5 等电点： A: PH=10.5 SA: PH= 6.0
6 比活性： A≥12u/mgP SA ≥14u/mgP
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四、亲和素的活性及其测定
1 亲和素的活性：是表示亲和素结合生物 素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。