GE重组标签蛋白的亲和和纯化.pdf

GSTrap FF
高纯度没有标记的目标蛋白质
高纯度没有标记的目标蛋白质
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2.2 纯化优化
2.2.1 载体的选择：决定重组蛋白表达量的多少、下游
纯化过程使用何种酶切割Tag、采用何种切割方式等。
Vector
Leaved by
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12
2.2 纯化优化
2.2.2 表达宿主的选择： E.coli BL21被认为是合适的 pGEX质粒的宿主，它是蛋白酶基因（Lon和OmpT）缺 陷型。E.coli BL21能更好的以可溶形式表达融合蛋白。
培----培----细收裂澄养细收裂澄养胞获解清胞获解清: :培培养养
新新药药设设计计-建建立立药药库库
晶N晶NM体M体R R 研研究究 分分析析
从基因到目标蛋白质 - 流程范例
表--Es--表--Es--cx纯定PCcxr纯定达PCpuhr达ep化性uhrreae化性筛reriae筛rnefsirianf选sicsian选cicsiancotgia:toetgn::itenor:iorinzinzaatitoionn
4. 收集穿 透液
19 / GE /
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶 柱上酶切
酶
未结合组分 切除标记的目标蛋白质 GST-标记
PreScission™ Protease
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10
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
柱上酶切
Mr 97 000 66 000 45 000 30 000 20 100
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18
3.1 产品-凝胶 预先鳌合金属凝胶
Ni Sepharose 6FF凝胶：是一款放大纯化His标签蛋白的凝胶。 适合于重力流方式纯化。可以忽略的Ni离子脱落，高载量 (40mg/ml)，流速快，可以耐受多种添加剂。
37 / 源自文库E /
3.1 产品-凝胶 没有鳌合金属凝胶
IMAC Sepharose HP凝胶&IMAC Sepharose 6FF凝胶： 是一性能优越的，纯化His标签蛋白的凝胶。可以自己鳌合不同 的金属离子，适合纯化外露His，Cys，Try残基的蛋白。金属离 子脱落极低，可以耐受多种添加剂。
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3.1 产品-凝胶 没有鳌合金属凝胶
Chelating Sepharose HP凝胶&Chelating Sepharose FF凝胶： 是亚胺二乙酸活化的，可以鳌合不同的金属离子，适合纯化外 露His，Cys，Try残基的蛋白。
重组标签蛋白的亲和纯化
GST -tag His -tag MBP -tag Strep(II)-tag
Zhanyong Zhao(赵战勇) Product Specialist of Protein Separation GE Healthcare Hotline: 8008109118 M: 13386153366 E：zhanyong.zhao@ge.com
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重组蛋白表达流程
RNA
cDNA Plasmid
Host Cell
2HN COOH
2HN COOH
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表达系统
Processing
Inclusion bodies Secretion Glycosylation Proteolytic cleavage
Bacteria Yeast
Glutathione S-transferase (GST) Poly histidine Maltose Binding Protein (MBP) Strep(II)-tag
配基
Glutathione Nickel ions (or other metal ions) Amylose StrepTactin
放放大大纯纯化化
MultiTrap™
大大规规模模纯纯化化
结结构构及及功功能能研研究究
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2.3 应用
GST MultiTrap™
GST-标记蛋白质的高通量筛选和平行快速纯化
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2.3 应用
GST MultiTrap 4B & FF
• 简化流程 – 无需装柱 – 上未澄清样品
Ni2+ Ni2+
Ni2+
Ni 2+
His His His His His His
Ni2+ Ni 2+
Ni 2+
Ni2+
rProtein
cleavage site
TEV protease
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3.1 产品-凝胶
预先鳌合金属凝胶
Ni Sepharose HP凝胶：是一性能优越的，纯化His标签蛋白的凝胶。 可以忽略的Ni离子脱落，高载量(40mg/ml)，可以耐受多种添加剂。
酶
柱上 GST-标记切除
Glutathione Sepharose™
GST
rec-Protein
Thrombin, Factor Xa at + 22-25 ºC PreScission™ Protease at + 4ºC
GSTrap™ FF HiTrap™ Benzamidine FF (high sub)苯甲脒
N-terminal sequencing
Size Proteolytic cleavage
Aggregation Heterogeneity
Stability at different pH, ionic strengths, protein concentrations detergent concentrations Truncated forms Heterogenous N-terminus
5. 用 HiTrap
6. 再把脱盐样品
Desalting 小柱脱 加到 GSTrap
盐去除还原谷胱甘 FF 或 HP 小柱
肽
1. 加细胞裂解澄 清液到 GSTrap FF 或 HP 小柱
柱外 2.酶切
柱上
3. 加 thrombin 或因 子 10a 到柱上直接切 出融合蛋白质
上面是 GSTrap FF 或 HP
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2.2 纯化优化 2.2.3 筛选高表达克隆，优化菌体培养条件
1、用Glutathione Sepharose 4B填料： 2-3ml 培养基产物裂解物与填料孵育，纯化。 适合小规模菌体筛选。
2、用GST MultiTrap 4B ： 能在一小时内纯化多达48个样品。适合大量 克隆筛选 带GST标签的蛋白浓度测定公式： 1A280＝0.5mg/ml
• 高重复性 – 孔对孔 & 板对板
• 高灵活性 – 可以用机械手自动操作或 使用离心机/抽真空等手动 方式操作
• 载量 0.5 mg/孔 (GST)
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2.3 应用
克克隆隆 (构(构建建) )
培----培----细收裂澄养细收裂澄养胞获解清胞获解清: :培培养养
新新药药设设计计-建建立立药药库库
4. 加 PreScission 5. 用 HiTrap
6. 再把脱盐样品
Protease 到洗脱液中 Desalting 小柱脱 加到 GSTrap
切开融合蛋白质
盐去除还原谷胱甘 FF 或 HP 小柱
肽
7. 收集穿 透液
分析蛋白 质
3. 加 PreScission Protease 到柱上直接 切出融合蛋白质
放放大大纯纯化化 GSTrap™
大大规规模模纯纯化化 GSTPrep™
结结构构及及功功能能研研究究
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3. His标记融合蛋白的纯化
3. His标记融合蛋白的纯化
3.1 产品-凝胶、预装柱、产品特性 3.2 纯化优化 3.3 应用
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3.1 产品
Ni2+ Ni2+
Ni Sepharose™
晶N晶NM体M体R R 研研究究 分分析析
从基因到目标蛋白质 - 流程范例
表--Es--表--Es--cx纯定PCcxr纯定达PCpuhr达ep化性uhrreae化性筛reriae筛rnefsirianf选sicsian选cicsiancotgia:toetgn::itenor:iorinzinzaatitoionn
酶
7. 穿透液含有酶 和切除的融合蛋白 质
分析蛋白 质
4. 穿透液含有酶 和切除的融合蛋白 质
4. 下面是 HiTrap Benzamidine FF (high5. 穿透的就是切除
分析蛋白
sub) 吸附 thrombin 或因子 10a
的融合蛋白质
质
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2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
重组蛋白
经过重组可以快速 表达大量目标蛋白、 有一套比较成熟的 纯化方案、完全满 足科研需求。
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2
重组蛋白应用
Diagnostic
Industrial enzymes
Therapeutics
Recombinant protein
Basic Research
Agriculture Functional studies Structural studies
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2.2 纯化优化 2.2.4 纯化过程优化因素： 流速：！！！！！！！！！！！ 样品浓度：GST-标记蛋白质的浓度 洗脱：推荐还原型谷胱苷肽的浓度 20mM 洗脱时的 pH：8
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2.3 应用 例：简单纯化GST融合蛋白
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2.3 应用
克(构克(构隆建隆建) )
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标签蛋白
优势:
简单亲和纯化即可实现 验证方便 方便柱上复性 增加产量 (表达/稳定性) 增加溶解性/折叠 促进分泌/定位
劣势:
可能需要切除标签 标签可能影响蛋白结构/功能
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表达验证
重组蛋白是否正确表达?
SDS-PAGE and immuno blotting Native PAGE IEF Biological activity
诱导前
诱导后
裂解物
目未裂标结解蛋合物 73白组000质分000000x
g xg
酶
切除标记的目标蛋白质
21 / GE /
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
用 Thrombin 或 因子 10a 切除 GST 标记的纯化流程
3. 加还原谷胱甘 肽洗脱
4. 加 thrombin 或因 子 10a 到洗脱液中切 开融合蛋白质
++ +/- + -+ +/- +/-
Insect Mammalian
cells
cells
--
--
++
--
+ = Yes - = No
7/ GE /
重组构建
L+
Medium Bead
Ligand
Tag
Recombinant Protein
Tag cleavage site
8/ GE /
4
重组构建
标签
16 / GE /
8
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
凝胶、预装柱
凝胶
Glutathione Sepharose 4B凝胶：可以方便的纯化GST标签
蛋白，耐压较低，流速比4FF凝胶低，载量也比4FF低。
预装柱
GSTrap 4B Columns 1ml 5ml
GST MultiTrap 4B(50ul/well)
凝胶
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow凝胶：是一款高流速纯化 GST标签蛋白的凝胶，比较适合放大纯化。
预装柱
GSTrap FF Columns 1ml 5ml GSTPrep FF 16/10(20ml media) GST MultiTrap FF(50ul/well)
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2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
酶
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2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
酶
用 PreScission protease 切除 GST 标记的纯化流程（可在4℃操作）
3. 加还原谷胱甘 肽洗脱
1. 加细胞裂解澄 清液到 GSTrap FF 或 HP 小柱
柱外 2.酶切
柱上
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2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
凝胶、预装柱
凝胶
Glutathione Sepharose HP凝胶：是一款高效、高分辨率的， 只需通过一步亲和就能纯化GST标签蛋白的凝胶。
预装柱
GSTrap HP Columns 1ml 5ml
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2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
凝胶、预装柱
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内容
1. 重组标签蛋白 2. GST标记融合蛋白的纯化 3. His标记融合蛋白的纯化 4. MBP标记融合蛋白的纯化 5. Strep(II)标记融合蛋白的纯化
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1. 重组标签蛋白
为什么重组蛋白?
天然蛋白
天然存在比较少、 纯化比较困难、科 学研究往往需要比 较多的目标蛋白。
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2. GST标记融合蛋白的纯化
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2. GST标记融合蛋白的纯化
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶 2.2 纯化优化 2.3 应用
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
Glutathione Sepharose填料分子结构
谷胱苷肽通过环化反应偶联到填料的骨架上，这个配体结构是和谷 胱苷肽转移酶作用位点的结构互补的。