GE重组标签蛋白的亲和和纯化.pdf
重组蛋白质表达、复性与纯化.ppt
• Flag-tag (DYKDDDDK)
加 tag ? • Myc-tag (EQKLISEEDL)
有前景的特殊用途的tag
• Biotinylation-tag
100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生 物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. • 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯)
在大肠杆菌中表达 重组蛋白质
• 如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构, 尽可能进行可 溶性表达;
• 如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清, 采用包含体表达 比较好;
• 如果目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进行融合表达
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • 分泌表达: pel/ompT分泌肽
• 质粒不稳定，尚无商品化的表达 载体
其他
•乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
两种主要的分子伴侣
Type I: chaperones which are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide– HSP family,GroELS,ect.
第五章 重组蛋白质表达与纯化
第五章重组蛋白质的表达、复性与纯化为什么要重组基因表达？1.蛋白质功能研究2.生物制药和疫苗生产3.疾病的基因治疗4.食品、化工用酶制剂5.抗虫、抗逆植物改良6.细胞代谢产物的富集•基因表达体系及优劣势•大肠杆菌表达体系•蛋白质的复性•工作中经常碰到的问题基因表达体系1.原核体系2.真核体系大肠杆菌(Escherichia coli)•遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；•基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillus subtilis)•分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；•无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；•质粒不稳定，已有商品化的表达载体（枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌）。
其他•乳酸菌(Lactic acid bacteria)•沙门氏菌(Salmonella typhimurium)•苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞植物细胞/组织哺乳动物细胞/组织酵母细胞•可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有糖基化修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;•糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;•商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;毕氏酵母(Pichia pastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）蛋白质糖基化的分类1.O-糖基化:糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser 或Thr等侧链的羟基处2.N-糖基化:糖链连接在Asn-X-Ser或Asn-X-Thr （X是除Pro以外的任何氨基酸）中Asn的氨基侧链处3.GPI-Anchor糖基化:蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。
昆虫细胞•可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞生产蛋白;•适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；•糖链有所区别，表达量有限；•作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞•可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；•表达量不够高，培养成本较高植物组织•植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；•转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；•表达量较难提高，分离纯化不方便动物乳腺组织•分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；•转基因动物制作花费巨大，实验周期长鸟类输卵管组织•分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；•实验成本低，饲养费用低；•加糖方式可能与人有所不同体系选择研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物有可能以后能做到的事∙在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素∙在大肠杆菌中生产人凝血IX因子∙在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽∙在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰∙在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化∙在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化∙提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性∙在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在大肠杆菌中表达重组蛋白质•如果目的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达;•如果目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好;•如果目的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达大肠杆菌表达载体分类按蛋白质类型分•单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc •分泌表达: pel/ompT分泌肽按启动子分•lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子IPTG诱导•lamda phage P L和P R启动子热诱导•T7 启动子IPTG诱导•T5 启动子IPTG诱导•ara启动子阿拉伯糖诱导常用表达载体•pJLA50X 系列; pcDNAII; etc •pET 系列(T7 promoter, Novagen 公司)•pQE系列(T5 promoter, Qiagen公司)•pMAL系列(周质表达, BioLabs公司)•pGEX系列(GST融合表达, Pharmacia公司)•pBAD系列(Arabinose诱导型)•pTYB系列(CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)各种融合蛋白表达载体•Protein A•GST（glutathione S-transferase）•CBD (chitin-binding domain, BioLabs;cellulose-binding domain, Novagen)calmodulin-binding domain, Stratagene)•MBP (maltose-binding protein)•GFP (green fluorescence protein)•Thioredoxin **帮助二硫键形成•Dsb (periplasmic enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与•SUMO (small ubiquitin-related modifier) •KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀可用亲和层析纯化帮助可溶化帮助分泌到周质让表达产物可溶化•采用MBP融合•采用GST融合•采用CBD融合•采用thioredoxin融合•采用Origami等宿主菌•降低菌体培养的速度温度(15-30℃), 降低转速让蛋白质分泌到间质去•采用CBD 融合(pET36/37)•采用Dsb融合(pET39/40)•采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)•采用带MBP融合(pMAL载体, Biolabs)•采用带SUMO融合(pET SUMO, Invitrogen)纯化方便: 先用EDTA/蔗糖溶液处理, 然后5 mM MgSO4 洗出•His-tag (6-8 Histidine )•T7-tag (MASMTGGQQMG )•HSV-tag (QPELAPEDPED )•S-tag (KETAAKFERQHMDS )•VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK )•HA-tag (YPYDVPDYA )•Flag-tag (DYKDDDDK ) •Myc-tag (EQKLISEEDL )各种用于抗体识别的标记为什么要加tag ?有前景的特殊用途的tag •Biotinylation-tag100多AA的结构域,在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点. Promega的PinPoint TM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST.•未命名DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合(个人通讯)•未命名一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞融合蛋白的专一性切割•DTT: intein的↓Cys •溴化氰: Met↓•Thrombin: LVPR↓GS •Factor Xa: IEGR↓•Enterokinase: DDDDK↓•PreScission TM protease:LEVLFQ↓GP •Genenase I TM PGAAHY↓•TEV protease:ENLYFQ↓G特殊的表达用菌株•BL21(DE3)/pLysS : 自身表达T7 RNA polymerase 适用pET系列等带T7启动子的载体•M15/SG13009 : 自身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体•BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变•Origami(DE3): thioredoxin reductase/ glutathione reductase 双突变适合带thioredoxin reductase的融合表达载体, 帮助形成更多的二硫键•BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达•BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达重要的原核表达质粒提供商•Novagen•Stratagene•Invitrogen•BioLabs•Qiagen•Pharmacia•Promega•Clontech•Roche•Gibco/BRLThe protein folding Problem How to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?包含体蛋白质的复性方法•透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质量少，浓度不能过高(容易产生沉淀) •快速稀释法:最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)•超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度•凝胶过滤法:快速, 可重复性高, 不会产生沉淀, 操作复杂一点•亲和层析复性法, 水相二相法, etc工作中经常碰到的问题•表达量不够高；•包含体在8M尿素中不能溶解；•重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；•带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；•Ni-chelating分离纯化的效果不好；•GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；•包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；•Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？•贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？•某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体•是不是忘了加还原剂（DTT 或巯基乙醇）？•是不是在－20℃冻存过？•用4M盐酸胍试试•是不是酸性蛋白质？•是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含Arg, Ile, Leu, Pro这几种氨基酸）•可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或RP 作宿主菌(Stratagen)；•使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21, Novagen）以便纯化全长的融合蛋白•His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰；•His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）;•其他不明原因导致弱结合•样品没有很好细心去除不溶性物质•重复使用前树脂没有洗干净•蛋白质之间存在相互作用•可以提高盐浓度, 改变pH, 添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质是不是在进行复性时用了Redox buffer尝试用Urea gradient /Gel filtration来解决尽快用0.1 N HCl冲洗用0.1 N NaOH / 0.1% SDS洗主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积。
融合标签蛋白亲和纯化填料
随着基因工程下游的技术的日益发展。基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显 示出其重要性，在重组蛋白的纯化过程中，研究人员常常利用各种融合表达的亲 和标签来纯化所表达的蛋白质，这样纯化相对比较容易，即便如此，由于蛋白的 多样性，重组蛋白的的纯化还是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉的研究 者来说，它还有可能成为一个瓶颈。
735565094@ order@ （2）技术咨询： immunechem@ 4.通信地址： 广西壮族自治区南宁市高新技术开发区科园大道 68 号东盟慧谷 11 栋 203 室
实验结果：
1） 蛋白浓度：
标准品浓度 （mg/mL）
0 0.625 1.25
OD 值 0
0.05 0.152
稀释后浓度 （mg/mL）
实际浓度 （mg/mL）
总蛋白量（mg）
2.5 5
样品名称 1/10 His 原 液 1/10 His 滤 液 His 洗脱液
0.29 0.61
0.012 0.099667774 0.996677741 9.96677741
His 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而 且基本不影响蛋白的活性，现在通用的做法是用镍柱亲和纯化，虽然是通用的方 法，但是不可避免的是它也有缺点，使用过镍柱纯化的研究者应该都遇到过蛋白 不溶解，蛋白不挂柱，蛋白难洗脱，电泳杂带多，特异性差等问题，并为此焦头 烂额，荒废不少的时间与精力，所以开发一种新的高效高质量的纯化介质是大家 一直以来的追求。
抗体
HRP
1:2000
洗脱液稀释度
His 洗脱 液
1/3 2.511
1/9 2.593
1/27 2.439
1/81 1.997
GE中文-疫苗和载体纯化手册
将乙肝疫苗接种列入各国的计划免疫规划中。
对洗脱组分 1，2，3 中 r-HBsAg 的活性分析显示，组分1 中没
纯化策略
有 r-HBsAg 活性，组分2 中包含了大于 90% 的 r-HBsAg 活性，
据估计全世界约有 5% 的人口被乙肝病毒感染，仅在中国，就 可能有9%的人群是乙肝病毒的携带者，并且每年新增的感染 者高达一百万。为控制这种趋势，就要付出巨大努力，生产
14 对下游纯化工艺的杰出见解和技术支持
迎接现代疫苗和载体纯化的新挑战
正如以蛋白为原料的药物一样，疫苗以及载体也要受到管理 我们的研发人员，技术支持和维修专家可在生产的任何环节
部门的审查，要求产品符合严格的安全性和有效性的质量标 上为您提供帮助，解决问题。我们工程师熟知疫苗和病毒载
准。生物制药公司自身也同样要对自己的产品制定一些保证 体的下游制备过程中的纯化要求标准。由于疫苗，载体只在
Sepharose 4 Fast Flow 层析
Q Sepharose XL virus licensed 层析 超滤、透析
中空纤维柱 截留分子量 750 kDa
去除杂质 (HCP) 去除杂质 (HCP) 和 DNA
病毒浓缩和配制
纯化策略
如同其它所有病毒一样，人流感病毒颗粒远比蛋白质和肽这 类分子大，利用这个特征可以从发酵液中分离病毒。它能应
100 g
17-0448-02
cytodex 1
500 g
17-0448-03
cytodex 2 适合于一般病毒培养 (比表面积 3300 cm2/g)
cytodex 2
25 g
17-0484-01
cytodex 2
100 g
17-0484-02
GE组氨酸标签蛋白纯化手册
%0.120.0组氨酸标签蛋白的纯化GE 生命科学部填料应用部简介组氨酸标签被广泛的使用，因为它们小，几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构。
固定的金属离子亲和层析(IMAC)是纯化组氨酸标签蛋白的最常用方法。
二价金属离子螯合到亲和填料上，还可以与组氨酸等氨基酸以配位键结合，从而快速的纯化出标签蛋白。
由于宿主蛋白也存在组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基，其它的非特异蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析柱料发生结合，造成纯化样品纯度不高，在这种情况下，上样咪唑的浓度提高，换Co 2+离子亲和或者加多一步分子筛技术都是很好的解决方法。
一、his 标签蛋白的纯化工具Ni Sepharose FF 和Ni Sepharose HP具有高载量，达到40mg/ml 填料。
低Ni 离子脱落，在低浓度的还原剂存在下，脱落<5%。
无需每次重新螯合上Ni 2+。
选择在样品缓冲液和平衡液中加入20mM-40mM 的咪唑能大大提高样品的洗脱纯度。
1: Start material2: Eluate HisTrap FF crude 3: Eluate Superdex 75pg图1. 两步纯化，得到高纯度的his 标签蛋白TALON Superflow比Ni 亲和结合力弱，容易洗脱，带来更高的纯度。
结合缓冲液: 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH7.4清洗缓冲液: 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl1, 5 mMimidazole, pH 7.4洗脱缓冲液:50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl1, 150mM imidazole, pH 7.4图2.用预螯合Co 2+的TALON 预装柱纯化标签蛋白HisTrap™FFcrude/HiTrap™TALON crude1ml/5ml---直接结合未澄清的样品分钟时间。
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程（编号：069）1、目的及适用范围利用GST亲和层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器GST柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机3、主要试剂3.1 Binding Buffer：1×PBS3.2 Elution Buffer：20-50mM还原型谷胱甘肽3.3 高pH值缓冲溶液：0.1M Tris，0.5M NaCl，pH 8.53.4 低pH值缓冲溶液：0.1M 醋酸钠，0.5M NaCl，pH4.54、GST柱的预处理用5个柱体积的1×PBS缓冲溶液平衡柱子5、操作步骤5.1蛋白的纯化5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；5.1.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；5.1.3 将收集的菌体用1×PBS重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；5.1.4 将菌体用1×PBS重悬，超声破碎菌体；5.1.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；6.1.6 将收集的上清加入GST柱子中，4℃结合2h；5.1.7 流出穿透液；5.1.8 用20-30个柱体积的1×PBS冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；5.1.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；5.1.10将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
5.2 柱子的再生5.2.1 用3个柱体积的高pH缓冲溶液冲洗柱子；5.2.2 用3个柱体积的低pH缓冲溶液冲洗柱子；141。
GE蛋白质纯化手册——中文——高段武学
蛋白质纯化
手册
imagination at work
Handbooks from Amersham Pharmacia Biotech
Antibody Purification Handbook 18-1037-46
The Recombinant Protein Handbook Protein Amplification and Simple Purification 18-1142-75
蛋白质纯化
手册
目录
前言................................................................................................6
第一章 纯化策略-- 一个简单的方法 ..............................................................................................................................................7 样品准备 ......................................................................................................................................................................................8 三步纯化策略 ..........................................................................................................................................................................8 蛋白质纯化的总体指导原则 .............................................................................................................................................10
亲合层析原理及标签蛋白纯化
特异性
支链甘露糖, 终端甘露糖或葡萄糖 通过α(1,6) 糖苷键连接与海澡糖上 的N-乙酰基-葡萄糖胺的支链甘露糖
亲和层析柱和平衡
重点 • 柱体积:
– 依据目标物的数量和填料的载量确定，Hitrap 1ml and 5ml.
样品准备
重点 • 过滤或离心以去除颗粒性物质 • 用脱盐柱校正样品的pH、盐浓度和添加剂来 提高结合的效率 • 确保已知的能影响结合的物质不存在
• 柱高:
– 无严格要求，一般是短而粗
• 平衡:
– 无严格要求, 对于 HiTrap™柱可以用注射器平衡
上样
重点 • 按照标准程序作 • 上样前充分平衡柱子 • 结合缓冲液一般采用中性 pH • 确保平衡:
– 亲和作用较强或比较容易平衡: 高流速 – 亲和作用较弱或比较难平衡: 慢流速
Troubleshooting
为什么选择亲和层析?
offers high selectivity, hence high resolution, and usually high capacity for the protein(s) of interest • 亲和层析能够完成一般方法很难完成的分离
– 如变性和非变性的，功能不同的蛋白
任何规模纯化都比较简单－Ni Sepharose
预装柱/填料 一次可纯化组氨酸融合蛋 白的量 注意
•筛选参数更方便和可再生的优化;预 装柱，上未澄清样品;用机械手自动操 作或使用离心机/抽真空等手动方式操 作 简化流程：预装柱，上未澄清样品， 离心 预装柱，重力，上未澄清样品 可直接上未澄清的样品，同HisTrap 预装柱，可用注射器、蠕动泵，层析 系统,样品必须澄清 适合大规模样品纯化，简化流程：无 需装柱可用蠕动泵，层析系统操作 •不同包装的凝胶，需要自行装填，客 户需自备空柱 •可用蠕动泵，层析系统（如ÄKTA） 或者批量操作
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
ge 亲和层析 纤维素硫酸葡聚糖-概述说明以及解释
ge 亲和层析纤维素硫酸葡聚糖-概述说明以及解释1.引言1.1 概述在生物科学领域，亲和层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法。
通过利用生物分子之间的特定相互作用，如受体与配体的结合、抗体与抗原的结合等，可以实现不同生物大分子的分离。
本文将重点介绍GE 亲和层析技术，以及纤维素硫酸和葡聚糖在亲和层析中的应用。
GE亲和层析是一种基于生物分子亲和性的分离技术，通过将生物分子与特定配体结合在一起，然后经过一系列洗脱步骤来实现目标蛋白的纯化。
纤维素硫酸和葡聚糖是两种常用的亲和层析材料，它们可以与生物大分子特异性结合，从而实现目标蛋白的高效纯化。
在本文的后续部分，我们将详细介绍GE亲和层析技术的原理和应用，以及纤维素硫酸和葡聚糖在这一过程中的作用。
同时，我们也将探讨纤维素硫酸葡聚糖在亲和层析中的潜力和未来研究方向。
通过本文的阐述，读者将对亲和层析技术及其在生物大分子研究中的重要性有更深入的理解。
1.2 文章结构本文分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，将对GE 亲和层析、纤维素硫酸以及葡聚糖进行简要介绍，并阐明文章的目的。
随后在正文部分，将详细探讨GE 亲和层析技术的原理和应用、纤维素硫酸的特性和用途，以及葡聚糖在生物医药领域的意义。
最后，在结论部分，将总结亲和层析技术在生物医药领域的应用前景，探讨纤维素硫酸葡聚糖作为一种生物活性物质的潜力，同时展望未来研究的方向。
整篇文章将从理论到实践，从应用到展望，为读者呈现一个全面而丰富的内容结构。
1.3 目的本文的目的是探讨和分析GE亲和层析技术在纤维素硫酸葡聚糖中的应用。
首先，我们将介绍和解释GE亲和层析技术的原理和优势，帮助读者了解其在生物制药领域的重要性。
其次，我们将详细介绍纤维素硫酸和葡聚糖两种生物大分子的结构、性质和医药应用。
最后，我们将讨论GE 亲和层析技术在纤维素硫酸葡聚糖生产和研究中的实际应用情况，并探讨其未来的发展前景。
通过本文的研究和分析，我们希望能够为生物制药领域的研究者和生产者提供有益的参考和启发，推动这一领域的进步和发展。
GE蛋白质纯化手册
GE Healthcare富有挑战性的蛋白质纯化原理和方法Gel FiltrationPrinciples and Methods 18-1022-18Recombinant Protein Purification HandbookPrinciples and Methods 18-1142-75Protein PurificationHandbook 18-1132-29Hydrophobic Interaction and Reversed Phase ChromatographyPrinciples and Methods 11-0012-692-D Electrophoresisusing immobilized pH gradientsPrinciples and Methods 80-6429-60Microcarrier Cell CulturePrinciples and Methods 18-1140-62GST Gene Fusion SystemHandbook 18-1157-58Affinity ChromatographyPrinciples and Methods 18-1022-29Antibody PurificationHandbook 18-1037-46PercollMethodology and Applications 18-1115-69Ion Exchange Chromatography & ChromatofocusingPrinciples and Methods 11-0004-21PurifyingChallenging ProteinsPrinciples and Methods 28-9095-31Handbooksfrom GE HealthcareChallenging 蛋白质纯化的原理和方法前言 (5)概要 (5)名词和缩写 (6)符号 (8)膜蛋白质 (9)前言 (9)膜蛋白质的分类 (10)用于结构和功能研究的内膜蛋白质的纯化 (11)原材料 (12)表达和筛选 (13)E.coli 裂解物中组氨酸标签膜蛋白小规模表达水平的筛选 (15)多蛋白复合物 (47)前言 (47)新兴的工作流程 (49)Pull-down 实验 (49)使用GST spintrap纯化模式进行GST pull-down实验 (51)串联亲和层析纯化,TAP (52)包涵体 (63)附录1 不同纯化技术的原理和标准条件 (76)附录2 手动以及自动纯化 (82)附录3 装柱以及制备 (86)附录4 数据换算：蛋白质、柱压 (89)附录5 从线性流速（cm/h）转换成体积流速（ml/min）以及从体积流速（ml/min）转换成线性流速（cm/h） (90)附录6 氨基酸表 (92)订购信息 (95)本手册详细描述了内膜蛋白质、蛋白质复合物的分离纯化以及包涵体蛋白质的重新折叠的原理及方法。
蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍---精品资料
蛋白纯化层析柱2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数：1164 网友评论0 条关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。
对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。
GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。
这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。
bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。
第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。
通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。
GE亲和不掉Ni填料装柱流程
GE亲和不掉Ni填料装柱流程
使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。
我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。
这些经验都是大家智慧的结晶。
同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。
一般像GE、Qiagen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。
避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni 流失；在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%。
应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素；可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。
重组蛋白在E.coli中表达及纯化
重组蛋白在E.coli中表达及纯化一. 实验目的1. 掌握重组蛋白诱导表达的方法。
2. 亲和层析法纯化His 标记的融合蛋白。
二. 实验原理将目的基因连接在表达载体后，通过加入诱导剂IPTG诱导目的基因表达。
表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个His编码序列，便于蛋白的亲和层析纯化。
亲和层析以蛋白质或生物大分子和结合在介质上的配基间的特异亲和力为基础。
本实验采用磁座和结合有Ni2+的磁珠在变性或非变性条件下对融合蛋白进行分离纯化，只需通过“结合-清洗-洗脱”三个简单的操作步骤就可完成。
该系统可根据样本量灵活调整磁珠用量，从而进行小量和大量蛋白纯化，并且磁珠可以再生使用。
大体过程：载体表面先键合一段间隔臂，再连接上配基↓固体化的配基只能与和它有特异亲和性的蛋白质分子互相作用而吸附↓改变流动相条件将吸附的蛋白质洗脱下来三. 试剂及器材1.磁珠（浓度为25%，v/v），储存于100mM NiSO4溶液中，2～8℃。
注：磁珠不能干燥，不能离心，不能冰冻。
2.PBS缓冲液：137mM NaCI，2.7mM KCI，4.3mM Na2HPO4，pH7.5。
3.结合液/缓冲液：0.5M NaCI，20mM Na2HPO4，10mM imidazole，pH7.4。
4.洗脱液：0.5M NaCI，20mM Na2HPO4，0.5M imidazole，pH7.4。
四. 实验操作(一)蛋白的诱导表达1. 挑取含重组质粒的单菌落，接种于含相应抗生素的培养基中（Amp），37℃振荡培养过夜。
2. 次日以5%量接种，37 ℃培养至OD=0.6时，加入IPTG（终浓度为0.1mM）37℃诱导表达2～3h。
3. 收集细菌（每人3ml，分两次收集），5000rpm离心3min。
PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。
每3ml菌液的菌体加入0.4ml 结合液悬浮。
(二)细菌的破碎1. 加入溶菌酶4μl（100mg/ml），使得终浓度为1mg/ml，放置冰浴中30～60min充分酶解。
蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
.Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白纯化设备：纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden)HisTrapNi亲和层析柱：试剂：所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。
Binding Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑4224Elution Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑4242Stripping Buffer: 20 mMNaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 442220%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L0.1M NiSO: 称取2.6284g NiSO·6HO，加蒸馏水溶解，定容至100 mL244操作步骤：1 样品前处理取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM孔径过滤器过滤后待用。
2 Ni柱前处理上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。
3 上样经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。
4 平衡上样后的Ni柱将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer以5mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。
5 梯度洗脱以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经280SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。
重组蛋白的表达与分离纯化
基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。
亲和层析纯化重组蛋白
亲和层析纯化重组蛋白【实验目的】学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白。
【实验原理】利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性,(Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag,则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化,经过低浓度咪唑溶液洗涤后,可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。
【器材与试剂】1.实验仪器摇床,高速冷冻离心机,超声波细胞破碎仪,微量移液器,电泳仪,蛋白电泳槽2.实验试剂蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2,镍离子螯合树脂(His.Bind Resin,美国Novagen公司),结合缓冲溶液:0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,20 mmol/LTris-Cl,pH8.0;洗涤缓冲液: 0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,20 m mol/L Tris-Cl,pH8.0;洗脱缓冲液:0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑,20 mmol/L Tris-Cl,pH8.0;30%凝胶贮液:29% 丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10% 十二烷基硫酸钠(SDS),N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED), 10%过硫酸铵,标准分子量蛋白,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1% SDS,pH8.3;1.5mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS, 10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸3.实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)(工程菌)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内,待凝胶沉淀且保护剂流净后,用10 mL蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液,待其流干净后,用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。
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晶N晶NM体M体R R 研研究究 分分析析
从基因到目标蛋白质 - 流程范例
表--Es--表--Es--cx纯定PCcxr纯定达PCpuhr达ep化性uhrreae化性筛reriae筛rnefsirianf选sicsian选cicsiancotgia:toetgn::itenor:iorinzinzaatitoionn
重组蛋白
经过重组可以快速 表达大量目标蛋白、 有一套比较成熟的 纯化方案、完全满 足科研需求。
4/ GE /
2
重组蛋白应用
Diagnostic
Industrial enzymes
Therapeutics
Recombinant protein
Basic Research
Agriculture Functional studies Structural studies
++ +/- + -+ +/- +/-
Insect Mammalian
cells
cells
--
--
++
--
+ = Yes - = No
7/ GE /
重组构建
L+
Medium Bead
Ligand
Tag
Recombinant Protein
Tag cleavage site
8/ GE /
4
重组构建
标签
• 高重复性 – 孔对孔 & 板对板
• 高灵活性 – 可以用机械手自动操作或 使用离心机/抽真空等手动 方式操作
• 载量 0.5 mg/孔 (GST)
31 / GE /
2.3 应用
克克隆隆 (构(构建建) )
培----培----细收裂澄养细收裂澄养胞获解清胞获解清: :培培养养
新新药药设设计计-建建立立药药库库
36 / GE /
18
3.1 产品-凝胶 预先鳌合金属凝胶
Ni Sepharose 6FF凝胶：是一款放大纯化His标签蛋白的凝胶。 适合于重力流方式纯化。可以忽略的Ni离子脱落，高载量 (40mg/ml)，流速快，可以耐受多种添加剂。
37 / GE /
3.1 产品-凝胶 没有鳌合金属凝胶
IMAC Sepharose HP凝胶&IMAC Sepharose 6FF凝胶： 是一性能优越的，纯化His标签蛋白的凝胶。可以自己鳌合不同 的金属离子，适合纯化外露His，Cys，Try残基的蛋白。金属离 子脱落极低，可以耐受多种添加剂。
诱导前
Hale Waihona Puke 诱导后裂解物目未裂标结解蛋合物 73白组000质分000000x
g xg
酶
切除标记的目标蛋白质
21 / GE /
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
用 Thrombin 或 因子 10a 切除 GST 标记的纯化流程
3. 加还原谷胱甘 肽洗脱
4. 加 thrombin 或因 子 10a 到洗脱液中切 开融合蛋白质
11 / GE /
2. GST标记融合蛋白的纯化
6
2. GST标记融合蛋白的纯化
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶 2.2 纯化优化 2.3 应用
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
Glutathione Sepharose填料分子结构
谷胱苷肽通过环化反应偶联到填料的骨架上，这个配体结构是和谷 胱苷肽转移酶作用位点的结构互补的。
1/ GE /
内容
1. 重组标签蛋白 2. GST标记融合蛋白的纯化 3. His标记融合蛋白的纯化 4. MBP标记融合蛋白的纯化 5. Strep(II)标记融合蛋白的纯化
2/ GE /
1
1. 重组标签蛋白
为什么重组蛋白?
天然蛋白
天然存在比较少、 纯化比较困难、科 学研究往往需要比 较多的目标蛋白。
放放大大纯纯化化 GSTrap™
大大规规模模纯纯化化 GSTPrep™
结结构构及及功功能能研研究究
32 / GE /
16
3. His标记融合蛋白的纯化
3. His标记融合蛋白的纯化
3.1 产品-凝胶、预装柱、产品特性 3.2 纯化优化 3.3 应用
17
3.1 产品
Ni2+ Ni2+
Ni Sepharose™
凝胶
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow凝胶：是一款高流速纯化 GST标签蛋白的凝胶，比较适合放大纯化。
预装柱
GSTrap FF Columns 1ml 5ml GSTPrep FF 16/10(20ml media) GST MultiTrap FF(50ul/well)
酶
7. 穿透液含有酶 和切除的融合蛋白 质
分析蛋白 质
4. 穿透液含有酶 和切除的融合蛋白 质
4. 下面是 HiTrap Benzamidine FF (high5. 穿透的就是切除
分析蛋白
sub) 吸附 thrombin 或因子 10a
的融合蛋白质
质
22 / GE /
11
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
26 / GE /
13
2.2 纯化优化 2.2.4 纯化过程优化因素： 流速：！！！！！！！！！！！ 样品浓度：GST-标记蛋白质的浓度 洗脱：推荐还原型谷胱苷肽的浓度 20mM 洗脱时的 pH：8
27 / GE /
2.3 应用 例：简单纯化GST融合蛋白
28 / GE /
14
2.3 应用
克(构克(构隆建隆建) )
5. 用 HiTrap
6. 再把脱盐样品
Desalting 小柱脱 加到 GSTrap
盐去除还原谷胱甘 FF 或 HP 小柱
肽
1. 加细胞裂解澄 清液到 GSTrap FF 或 HP 小柱
柱外 2.酶切
柱上
3. 加 thrombin 或因 子 10a 到柱上直接切 出融合蛋白质
上面是 GSTrap FF 或 HP
5/ GE /
重组蛋白表达流程
RNA
cDNA Plasmid
Host Cell
2HN COOH
2HN COOH
6/ GE /
3
表达系统
Processing
Inclusion bodies Secretion Glycosylation Proteolytic cleavage
Bacteria Yeast
17 / GE /
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
酶
18 / GE /
9
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
酶
用 PreScission protease 切除 GST 标记的纯化流程（可在4℃操作）
3. 加还原谷胱甘 肽洗脱
1. 加细胞裂解澄 清液到 GSTrap FF 或 HP 小柱
柱外 2.酶切
柱上
酶
柱上 GST-标记切除
Glutathione Sepharose™
GST
rec-Protein
Thrombin, Factor Xa at + 22-25 ºC PreScission™ Protease at + 4ºC
GSTrap™ FF HiTrap™ Benzamidine FF (high sub)苯甲脒
16 / GE /
8
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶
凝胶、预装柱
凝胶
Glutathione Sepharose 4B凝胶：可以方便的纯化GST标签
蛋白，耐压较低，流速比4FF凝胶低，载量也比4FF低。
预装柱
GSTrap 4B Columns 1ml 5ml
GST MultiTrap 4B(50ul/well)
25 / GE /
2.2 纯化优化 2.2.3 筛选高表达克隆，优化菌体培养条件
1、用Glutathione Sepharose 4B填料： 2-3ml 培养基产物裂解物与填料孵育，纯化。 适合小规模菌体筛选。
2、用GST MultiTrap 4B ： 能在一小时内纯化多达48个样品。适合大量 克隆筛选 带GST标签的蛋白浓度测定公式： 1A280＝0.5mg/ml
N-terminal sequencing
Size Proteolytic cleavage
Aggregation Heterogeneity
Stability at different pH, ionic strengths, protein concentrations detergent concentrations Truncated forms Heterogenous N-terminus
9/ GE /
标签蛋白
优势:
简单亲和纯化即可实现 验证方便 方便柱上复性 增加产量 (表达/稳定性) 增加溶解性/折叠 促进分泌/定位
劣势:
可能需要切除标签 标签可能影响蛋白结构/功能
10 / GE /
5
表达验证
重组蛋白是否正确表达?
SDS-PAGE and immuno blotting Native PAGE IEF Biological activity
38 / GE /
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3.1 产品-凝胶 没有鳌合金属凝胶
Chelating Sepharose HP凝胶&Chelating Sepharose FF凝胶： 是亚胺二乙酸活化的，可以鳌合不同的金属离子，适合纯化外 露His，Cys，Try残基的蛋白。
4. 收集穿 透液
19 / GE /
2.1 产品-凝胶、预装柱、酶 柱上酶切
酶
未结合组分 切除标记的目标蛋白质 GST-标记