转录组测序技术原理及应用PPT课件
转录组测序ppt课件
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2019/5/5
环境转录组也可以这样做
• 使用RNA-seq手段对实验样本进行转录组分析，关注个体或者组织器 官在不同环境条件下基因表达的动态变化，挖掘生物对逆境适应的分 子机制。
转录组？
• 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态下所能 转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码 RNA。
• 转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件 下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有 mRNA的集合。蛋白质是行使细胞功能的主要承担 者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述， 转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是 连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必 然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也 是生物体最重要的调控方式。
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）信息分析流程
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps • 测序质量控制：Q20% >80
相关概念
• 高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值， 这个质量值是衡量测序准确度的。Q20与Q30则表示质量值 大于等于20或30的碱基所占百分比。
• Q20值是指的测序过程碱基识别过程中，对所识别的碱基 给出的错误概率。
• 质量值Q20，错误识别概率是1%，即正确率是99%； 质量值Q30，错误识别概率是0.1%，即正确率是99.9%； 质量值Q40，错误识别概率是0.01%，即正确率99.99%； Q“N”0的质量值，就是正确率有N个9的百分比。
RNA-seq技术原理及应用-课件PPT
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
转录组测序技术原理及应用
转录组测序技术原理及应用转录组测序技术原理及应用：转录组测序技术可以帮助研究者了解细胞或组织中全部转录本的类型及其相对表达水平，从而揭示基因的功能和表达调控机制。
本文将介绍转录组测序技术的原理及其在生命科学研究中的应用。
转录组是特定细胞或组织中所有mRNA的集合，转录组测序即是测定所有mRNA的序列和表达水平。
传统的方法是利用几个重要的基因进行差异表达研究，但其局限性在于只能检测少量基因的表达水平。
而转录组测序技术的出现，使得研究者可以全面了解细胞或组织中的基因表达情况。
转录组测序技术主要有两种方法：全长转录组测序和测序-by-synthesis。
全长转录组测序技术是利用长读长的方法，直接测定mRNA的全长序列。
其中最具代表性的技术是RNA-seq。
该方法主要包括以下几个步骤：RNA提取、RNA 分离、RNA片段化、cDNA合成、文库构建、测序和数据分析。
首先，需要从样品中提取总RNA，并经过纯化和富集步骤，去除干扰物质。
然后，将RNA 切割成短片段，随后利用逆转录酶合成第一链cDNA。
接着，用DNA聚合酶合成第二链cDNA，并进行文库构建。
最后，将文库进行高通量测序，获取转录组数据。
数据分析通常包括预处理、比对、表达矩阵的构建、差异分析和功能注释等步骤。
通过该方法，可以得到高质量的转录组数据，进而研究目标细胞或组织中的基因表达情况。
测序-by-synthesis技术是通过测定每个mRNA片段的长度和表达水平，进而还原出全长的mRNA序列。
这种技术通常使用short-read测序技术，如Illumina （第二代测序仪），其基本原理是将DNA片段固定在流动细胞中，利用荧光染料标记的碱基链延伸的方式进行测序。
针对短读长的特点，通常需要对样本进行切割，并进行高通量测序。
此外，还需要进行数据重组和序列拼接。
虽然短读长测序技术成本较低，但由于测序片段的长度受限，会对结果的准确性和可靠性产生一定影响。
转录组测序技术的应用非常广泛。
转录组测序原理.pptx
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
第16页/共40页
ห้องสมุดไป่ตู้基片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
变性
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Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，
Throughput : up to 25 Gb per day
Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
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基于SBS测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T
T
C TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
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鉴定基因可变剪接
exon1
common reads
exon2
exon3
mRNA
exon1
junction reads
exon3
exon1
exon2
exon3
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鉴定融合基因
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Paired Reads distribution
Reads cluster
主要内容• 样品检测 • 制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
第14页/共40页
新一代测序技术
RNA-SEQ原理及应用解析PPT课件
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2020/1/1
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• 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万 读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:
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高通量测序
• 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指 能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定， 每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。
• 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文 献中称其为下一代测序技术(next generation sequencin g)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种 的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又 被称为深度测序(deep sequencing)。
所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对
ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。
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二、RNA-seq技术原理
RNA-seq 实验流程图
首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还 是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理
好的RNA再进行片段化最后用新一代高通量测序 依进行测序。
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三种高通量测序技术的优缺点
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高通量测序中重要名词解释
• 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深 度为10×。
转录组测序技术原理及应用 ppt课件
转录组测序技术原理及应用
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
真核mRNA的纯化
mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用Tris-
HCL在加热条件下解离洗脱到溶
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。
RT ds cDNA
转录组测序技术原理及应用
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
转录组消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000n Illumina Sequencing 生物信息分析
转录组测序技术原理及应用
系统生物学-第三讲-转录组学PPT课件
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• 第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和 let-7 ，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编 码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制， 进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译 从而调控线虫发育进程。
继线虫之后，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多 种生物物种中鉴别出数百拼接和注释表达与分类功能分析作用机理分析qpcr验证est软件平台est序列库序列的质量检查测序量监控聚类和拼接检查借助于基因组信息全长orf寻找发现全长基因研究表达基因概况的主要实验手段dnachipproteomics的先驱功能分类表达量分析交替剪接检测est特有信息microarray和genechip大规模表达谱或全景式表达谱globalexpressionprofile
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表达序列标签(EST)测定及分析
1、什么是EST? 2、EST的应用 3、EST序列测定及分析过程
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1、表达序列与表达序列标签概念
(1) 什么是表达序列?
基因组表达为RNA的序列: mRNA和功能RNA
(2) 什么是表达序列标签?
（expressed sequence tag, EST）
• 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和 出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞 及组织分子组成所必需的。
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• 转录组的特点：受到内外多种因素的调节，因而是 动态可变的。能够揭示不同物种、不同个体、不同 细胞、不同发育阶段及不同生理病理状态下的基因 差异表达信息。
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• 转录组学（Transcriptomics）：研究细胞在某 一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数；比较不
单细胞转录组测序技术的简介及应用 (1)
目录
CONTENTS
1. 技术简介 2. 研究应用 3.临床应用
01 技术简介
普通转录组（Bulk RNA）和单细胞转录组有什么区别？
广义转录组（Transcriptome）：指从一种细胞或者组织的基因组所转录出来的 RNA 的总和，包括编码蛋白质的 mRNA 和各种非编码 RNA（rRNA, tRNA, microRNA 和其他非编码 RNA 等）。 狭义转录组:指所有参与翻译蛋白质的 mRNA 总和。 单细胞转录组学：单细胞转录组分析技术是一种高通量基因表达分析技术，可 以通过对单个细胞的RNA 进行测序，识别不同类型的细胞，分析基因表达变异 性等。 传统的转录组学研究通常采用大量细胞的混合物作为样本，而单细胞转录组学 则可以对单个细胞进行分析，从而揭示细胞之间的异质性和功能差异。
以10X单细胞转录组测序为例
➢ 10X单细胞转录组测序技术又叫流式细胞术分选技术，该技术的核心利用「微流控芯片」对细胞进行精确区分， 通过「10xBarcodes」标记每一个细胞，能实现大规模的单细胞转录组测序，从而更高分辨率地揭示细胞间的细 胞差异以及其在微环境中的功能情况，在细胞异质性研究中表现出色。
优势： ➢ 通量高:灵活的获取量，可一次性对500-10000个细胞建库，提高效率 ➢ 周期短:10 分钟内完成上万个细胞封装，一天之内完成细胞悬液制备、
单细胞捕获、扩增以及建库； ➢ 捕获效率高:细胞捕获效率高达 65 %，不需要微量扩增，降低假阳性
率； ➢ 应用范围广:成本低，动物细胞和植物细胞均可以进行单细胞测序，
2. 发现新细胞类型：通过单细胞转录组，我们可以识别和定义新的细胞类型，特别是在复杂组织如脑和免疫系统 中。
单细胞转录组测序技术及其应用
单细胞转录组测序技术及其应用细胞是生命的基本单位，不同的细胞在形态、结构、功能等方面存在巨大的差异。
传统的测序技术无法很好地满足单细胞研究的需要，因为单细胞数量极少，不同细胞之间差异较大，需要高灵敏度、高分辨率的测序技术。
单细胞转录组测序技术的出现解决了这个问题，可以对单个细胞进行高通量的转录组测序，深入探究单个细胞的基因表达、表观遗传学等信息，为单细胞层面研究提供了重要的技术支持。
一、单细胞转录组测序技术的原理单细胞转录组测序技术是在单个细胞水平上进行基因表达测定，主要包括单细胞捕获、cDNA合成、文库构建和高通量测序等步骤。
单细胞捕获技术可以使用微流控芯片、FACS、微针等方式对单个细胞进行精确的分选和捕获，然后使用先进的cDNA合成技术对单个细胞进行全长转录本的扩增。
之后，通过构建文库，可以在保证测序质量的前提下对单个细胞进行高通量测序，获得大量基因表达信息。
二、单细胞转录组测序技术的应用（一）疾病研究单细胞转录组测序技术可以帮助我们研究各种疾病的发生和发展机制，在了解细胞状态的基础上为疾病治疗提供新思路。
例如，单个肿瘤细胞能够在微小的环境内大量繁殖，并且在进展期表现出极强的异质性。
因此，单细胞转录组测序技术可以帮助研究人员更好地了解肿瘤细胞在异质性方面的内在机制。
（二）发育学研究单细胞转录组测序技术也可以用于发育学研究，帮助我们了解发育过程中单个细胞的内在特点以及它们在发育时的不同形态和功能。
例如，我们可以使用该技术研究一个单一的细胞是如何分化成多种类型细胞的，或者在某些特定环境下，单个细胞如何改变自己内在的状态来适应环境的要求。
（三）新型药物研发单细胞转录组测序技术还可以为新型药物研发提供帮助。
借助该技术，我们可以了解不同细胞在药物作用下的基因表达变化信息，进一步优化药物设计和寻找新型药物的研发方向。
三、存在的挑战单细胞转录组测序技术的主要应用领域是基因表达的定量及深入探究单个细胞的基因表达和调控。
转录组学 ppt课件
三、研究方法
–微阵列（microarray） –SAGE –MPSS
（一）微阵列是大规模基因组表达 பைடு நூலகம்研究的主要技术
• 大规模表达谱或全景式表达谱（global expression profile）： 是生物体（组织、细胞）在某一状态下基因表达的整体状 况。
• 微阵列或基因芯片（DNA chip）:利用光导化学合成、照相 平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成 成千上万个寡核苷酸探针，并与放射性同位素或荧光物标 记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转 录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统 对每个杂交点进行定量分析。
组 （四）大规模平行信号测序系统
MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)。
五、特点
• 转录组的特点：受到内外多种因素的 调节，因而是动态可变的。能够揭示 不同物种、不同个体、不同细胞、不 同发育阶段及不同生理病理状态下的 基因差异表达信息。
（三）MPSS是以基因测序为基础的 基因表达谱分析新技术
• MPSS的原理：一个含有能够特异识别转录子的信息标签 序列（10～20 bp）与长的连续分子连接在一起，测出 mRNA的一端包含一个10至20个碱基的标签序列。每一标 签序列在样品中的频率（拷贝数）代表了与该标签序列相 应的基因表达水平。
一、转录组学的概念
转录组学的概念 • 转录组学（transcriptomics），是一门在
整体水平上研究细胞中基因转录的情 况及转录调控规律的学科。简而言之 ，转录组学是从RNA水平研究基因表 达的情况。是在整体水平上研究细胞 基因转录情况及转录调控规律的科学 。
转录组学PPT课件
况。
• 微阵列或基因芯片（DNA chip）:利用光导化学合成、照相 平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成
成千上万个寡核苷酸探针，并与放射性同位素或荧光物标
记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转
录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统
对每个杂交点进行定量分析.。
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Experimental overview:
Cell population A
Cell population B
AA B B
RNA extraction
Quantify pixel intensities.
AA BB
Reverse transcription
Sample A labelled with cy5 dye
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六、应用
• 1、共生体系中的应用 焦磷酸测序技术对沿海双壳软颚芒哈 与其体内的硫杆共生菌总RNA 约160 万 个序列（500 Mbp）进行测序
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• 2、肠道微生物研究中的应用
Gosalbes 等［19］运用454 技术对10 位健康人 的肠道微生物群落cDNA 进行测序，通过16S rRNA分析微生物群落的结构和组成，发现 厚壁菌门占48 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期49.18％，拟杆菌门占 31.42％，变形菌门占3.66％，放线菌门占0.4 ％。宏转录组技术在挖掘新功能基因、新 活性酶上的能力远远.高于宏基因组技术。 13
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• 4、在土壤、海洋生态环境中的应
用目前宏转录组学研究大部分仍集 中在对海洋与土壤生态环境群落微 生物宏转录组的研究中，表1归纳
基因转录组的测定及分析ppt课件
● 与编码区具有很强的保守性不同，3’UTRs序列的保守性 较差，因此很容易将单个基因与编码序列关系非常紧密的相 似基因家族成员分开。 （精J选aPmPT课e件s Sikela等，1991年） 9
EST的应用 3
ESTs与基因预测SAGE的测序： 单向测序。精选PPT课件
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Serial analysis of gene expression (SAGE) 分析流程
在双标签多聚体序列中定位NlaIII酶切位点（即CATG）； 提取CATG位点之间的20－22bp长的双标签序列； 去除重复出现的双标签序列，包括反向互补方向上重复的双
EST数量排名前10的物种
Organism Homo sapiens (human) Mus musculus + domesticus (mouse) Zea mays (maize) Bos taurus (cattle) Arabidopsis thaliana (thale cress) Danio rerio (zebrafish) Glycine max (soybean) Xenopus tropicalis (western clawed frog) Oryza sativa (rice) Ciona intestinalis
精选PPT课件
3
大规模EST序列测定的开始
1983年：Costanzo等提出EST概念的雏形
1991年：Adams测定了三种人脑组织共609条EST，宣布
了cDNA大规模测序的时代的开始代
1991年：Okubo等提出大规模cDNA测序的研究战略
1993年：Venter等创立现在的EST技术
转录组测序原理
通过比较不同条件或不同组织样本的转录本序列，可以检测基因表达的差异，从而分析基因表达的调控机制和相关生 物学过程。
稀有转录本的发现
转录组测序能够检测到稀有的转录本，这些稀有转录本在常规的基因表达分析中容易被忽略，但它们可 能在特定的生物学过程中发挥重要作用。
转录组测序的数据处理流程
数据质量控制
02
利用模式生物基因组小、繁殖 快、易培养等特点，进行高通 量、高分辨率的转录组测序。
03
将模式生物转录组研究成果应 用到人类和其他复杂生物的研 究中，促进生命科学领域的发 展。
案例三：生态与环境转录组研究
01
02
03
研究生物与环境之间的相互作用 和适应机制，揭示生态系统中物 种间的相互关系和协同进化。
03
转录组测序的关键技术
下一代测序技术
下一代测序技术，也称为高通量测序技术，能够同时对大量DNA或RNA 片段进行序列测定，大大提高了测序的速度和通量。
常见的下一代测序技术包括全基因组测序、全外显子测序和转录组测序等。
下一代测序技术的基本原理是采用可逆性末端终止的合成方法，通过不同 碱基的荧光标记和计算机系统进行序列读取。
基因注释与功能分类
01
基因注释是指对基因的功能、位置、表达等特征进行描述和 分类的过程。
02
通过基因注释，可以了解基因的生物学功能、参与的生物过 程以及在细胞中的定位等信息。
03
功能分类是将基因按照其功能相似性进行归类，有助于深入 理解基因的协同作用和调控网络。
基因网络与通路分析
01
基因网络是指基因之间相互作用的复杂网络，包括蛋
通过比较不同条件或组 织样本的转录本序列， 检测基因表达的差异， 筛选出差异表达的基因 。
转录组测序的原理及步骤
转录组测序的原理及步骤转录组测序是一种用于研究生物体内转录组的高通量测序技术。
转录组测序可以帮助我们全面了解基因在特定条件下的表达情况，从而揭示基因调控的机制、功能和调控网络等重要信息。
本文将详细介绍转录组测序的原理和步骤。
一、转录组测序的原理转录组测序的原理基于高通量测序技术，它通过将RNA转录本转化为DNA片段，再进行测序，从而获得RNA转录本的序列信息。
转录组测序可以分为两种主要方法：全长转录本测序和非全长转录本测序。
全长转录本测序（Full-Length Transcript Sequencing，FLTS）是指对转录本进行全长测序，并且能够确定转录本的5'端和3'端序列信息。
全长转录本测序可以通过一系列的实验步骤来实现，包括RNA提取、RNA逆转录、cDNA合成、DNA片段构建和测序等。
非全长转录本测序（Non-Full-Length Transcript Sequencing，NFLTS）是指对转录本进行部分测序，并且只能确定转录本的部分序列信息。
非全长转录本测序可以通过不同的方法来实现，如转录组测序技术中常用的RNA-Seq技术。
二、转录组测序的步骤转录组测序的步骤主要包括样品准备、RNA提取、RNA质量检测、RNA逆转录、cDNA合成、文库构建、测序和数据分析等。
1. 样品准备：选择合适的样品，如细胞、组织或体液等，根据实验设计的需要确定不同条件下的样品。
2. RNA提取：从样品中提取总RNA，常用的方法有TRIzol法、RNAeasy Mini Kit法等。
3. RNA质量检测：使用比较常用的方法如NanoDrop、Agilent 2100 Bioanalyzer等检测RNA的浓度和纯度。
4. RNA逆转录：将RNA转化为cDNA，逆转录反应可以使用逆转录酶和随机引物或寡聚引物进行。
5. cDNA合成：将逆转录得到的cDNA进行二次扩增，得到足够的DNA量用于后续的文库构建。
真核转录组讲解及数据解读PPT
转录组结果解读转录调控研究部北京诺禾致源科技股份有限公司OUTLINE简介实验部分生物信息分析概述1转录组是指特定组织或细胞在某个时间或某个状态下转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。
转录组研究是研究基因功能和结构的基础，对生物体的发育和疾病的发生具有重要作用。
RNA-seq技术流程主要包含两个部分，建库测序和数据分析。
2实验部分（RNA检测、建库、测序)）•琼脂糖凝胶电泳：分析样品RNA完整性及是否存在杂质污染。
•NanoPhotometerspectrophotometer：检测RNA纯度（OD260/280及OD260/230比值）。
•Agilent 2100 bioanalyzer：精确检测RNA完整性。
链特异性文库优势：相同数据量下可获取更多有效信息；能获得更精准的基因定量、定位与注释信息5➢1、一般动物样品会有三条带：28S 、18S 、5S ，如果提取过程经过过柱处理或者利用CTAB+LiCl 方法提取，5S 可能较暗或者没有。
➢昆虫或者软体动物等样品只有1条比较明显的带，例如：牡蛎、果蝇、螨虫、蝗虫、蚊、蚕等➢2、植物样品有三条带：25S 、18S 、5S ，有些特殊物种或部位可能本身含条带比较多，如果条带清晰，也可初步判定合格➢3.原核生物中主要有5S 、16S 、23S rRNA叶片小鼠蚊动物植物原核RIN 5RIN 7RIN 8RIN 9RIN 4RIN 6RIN 10RIN 2RIN 1RIN 值范围示意图问与答文献要求OD260/OD230≥1.8，OD260/OD230如果小于2.0，则表明样品中被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染；OD260/OD230合格的标准是多少呢？答：OD260/OD230≥2.0，且OD260/OD280≥2.0这说明RNA提取结果是相当好的，一般在1.8-2.1之间就说明RNA结果十分好，但是nanodrop的灵敏度没有2100好，因此我们主要根据2100检测结果来判定RNA是否合格，一般只要RIN值和RNA总量达到我们的判定标准的话，我们就会判为合格。
转录组测序技术.精选PPT
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RNA-Seq 技术背景
有关于ncRNA的一些知识
非编码RNA（ncRNA）主要包括：转运 RNA（tRNA），核糖体RNA(rRNA)，小核 RNA（snRNA），核仁小分子RNA（ snoRNA），细胞质小分子RNA（scRNA）， 不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（ microRNA,miRNA）等。
转录组测序技术：是指利用第二代 高 通 量 测 序 技 术 进 行 cDNA 测 序 ， 全面快速地获取某一物种特定器 官或组织在某一状态下的几乎所 有转录本。
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RNA-Seq 技术背景
高通量测序技术（High-throughput sequencing ）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测序，每一次序列测定的读长一 般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改 变，一次对几十万几百万条DNA分子进行序列 测序，因此在有些文献中称其为下一代测序技 术（next generation sequencing）组件其划时代 的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转 录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深度测序（deep sequencing）
台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通
量测序仪具有不同的应用侧重。
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RNA-Seq 技术背景
转录组（transcriptome）
广义：指某一生理条件下，细胞内所 有转录产物的集合，包括信使RNA、 核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。
狭义：指所有mRNA的集合。
5技术
转录组测序技术
RNA-Seq第一技讲术背景 RNA-Seq第二技讲术原理 RNA-Seq第三技讲术应用领域 RNA-Seq 技术优势 RNA-Seq 技术...面..... 临的挑战及发展
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Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
.
16
Applications of RNA-Seq
Application
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
RT ds cDNA
.
13
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
.14第一天制备第二天第三天消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测： Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。
O
Small RNA 测序
Small RNA
O
降解组测序 mRNA
Non-coding RNA测序
Non-coding RNA
O
O
表达谱研究
O
O
O
O
基因结构分析
O/X
X
X
O
EST 测序
O/X
X
X
X
筛选分子标记
O
O
O
X
转录融合基因 表达
O/X
XXXຫໍສະໝຸດ .5Workflow of RNA-Seq
Total RNA
RNA-Seq (Transcriptome resequencing)
11
原核mRNA的纯化
Ambion MICROExpress Kit
LNA扣锁型探针
.
12
mRNA反转录---fragment+RT
纯化过的mRNA样品加入 1 µl的fragment buffer 70℃ 作用1.5min。
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原llumina Sequencing 生物信息分析
.
6
Total RNA样品检测
Agilent 2200 检测 OD260/280:1.8~2.2 RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR
RNA测序技术原理及应用
.
1
基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次
遗传的中心法则
.
2
什么是转录组？
.
All transcripts
All mRNAs
3
RNA是解读基因组的关键
Genotype
Phenotype
DNA
Protein
RNA
.
4
RNA 测序技术
测序技术 研究对象 鉴定新分子
RNA-Seq mRNA
工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解
决方案。
● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板
● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果
● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程
● 样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品
.
7
检测报告-合格样品
棉铃虫/果蝇
.
8
检测报告-不合格样品
.
9
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
.
10
真核mRNA的纯化
链霉亲合素包被磁珠+生物素标记 Oligo（dT）25+poly（A）
.
mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用TrisHCL在加热条件下解离洗脱到溶 液中。
RNA-Seq (单端测序---Quantification)
√ － － －
RNA-Seq (双端测序---Transcriptome)
√ √ √ √
HiSeq 2500
.
1717
RNA-Seq (Transcriptome)
.
18
Workflow of RNA-Seq(Transcriptome)
.
PCR
↓
PCR胶回收
15
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
HiSeq 2000 sequencing 101PE
.
生物信息学分析
19
RNA-Seq (Transcriptome)
Technique
2
Characterize the transcriptome in unparalleled detail
RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)