聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 步骤 详细
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理,步骤和结果分析
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理，步骤
和结果分析
一、实验原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理基于蛋白质在凝胶电泳过程中受到凝胶孔隙大小及电场力的影响而发生迁移分离。
在非变性条件下，蛋白质保持其原有的构象，通过电泳进行分离。
二、实验步骤
1. 制备凝胶：首先准备非变性聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过聚丙烯酰胺单体聚合成凝胶板。
2. 样品加载：将待分离的蛋白样品混合添加载体缓冲液，并加热变性处理，然后加载到凝胶槽中。
3. 电泳分离：将已加载样品的凝胶槽浸入电泳缓冲液中，施加电场进行电泳分离，蛋白质根据其分子大小及电荷迁移至不同的位置，最终形成条带。
4. 凝胶染色：分离完成后，应用染色方法将蛋白质条带可视化。
5. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移位置以及染色效果，分析样品中含有的蛋白种类及相对含量。
三、实验结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们可以获得样品中蛋白质的分子量信息，并进一步分析样品中可能存在的杂质及纯度。
在电泳过程中，蛋白质根据其分子大小在凝胶中迁移的速度不同，从而实现了蛋白质的分离。
根据蛋白质在凝胶上的位置，我们可以对样品进行定性和定量分析，从而获得关于样品组成和含量的重要信息。
综上所述，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单有效的蛋白质分离技术，广泛应用于生物学和生物化学研究中。
通过实验结果的分析和解读，可以更好地了解样品中蛋白质的组成及结构，为进一步的实验研究提供重要参考。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤
1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul
精选版课件ppt
5
2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 ％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后， 立即灌胶。
(2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中， 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹 心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地 去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完 全后即可拔去梳子，准备电泳。
(2). 将混合液充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平 板电泳槽里的狭槽中，注意在本操作过程中不能产生任何 气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。
(3). 置于室温下15-30分钟，使凝胶聚合完全 (在水相和凝胶的交 界处有一明显的亮线)。除去上层水相，然后再用水或浓缩 胶缓冲液(0.125mol/m1Tris-HCI，pH6.8, 0.1%SDS) 洗凝 胶表面，准备灌制浓缩胶。
精选版课件ppt
4
不同浓度凝胶的制备
成
不同浓度所需的储备液体积
份
8.5% 10% 12.5％ 15％ 17.5%
H20
3.5ml
30% Acr和Bis分离胶 2.0ml
4X缓冲液
l.9ml
10% 过硫酸铵
112 u1
TEMED
5 ul
Байду номын сангаас
3.1ml 2.5ml 1.8ml 2.4ml 3.Oml 3.7ml 1.9ml 1.9ml 1.9ml 112 ul 112 ul 112 ul 5 ul 5 ul 5 ul
精选版课件ppt
3
三、操作步骤
血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳
在血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，如果出现异常的蛋白条带，如过亮、过暗或异常迁移率，可 能提示某些疾病或生理变化。这些异常条带可能与炎症、感染、肿瘤或代谢紊乱等病理状态相关，需 要进一步的临床和实验室检查以明确诊断。
结果分析
总结词
结合临床信息和实验室数据，对血清蛋白聚丙烯酰胺 凝胶电泳结果进行分析。
应用
聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛应用于蛋白质组学、生物医药等领域，用于分 离、鉴定和纯化蛋白质，了解蛋白质的组成和功能。
02 实验原理
CHAPTER
血清蛋白的分离原理
分子筛效应
聚丙烯酰胺凝胶作为分子筛，能够根据蛋白质分子量大小进行分离，分子量小 的蛋白质容易进入凝胶孔洞，移动距离短；分子量大的蛋白质不容易进入凝胶 孔洞，移动距离长。
实验结果可靠性验证
对比已知标准品
通过与已知标准品进行比较，可以验证实验结果的准确性。 如果实验结果与标准品一致，则说一样品进行检测，并将结果 进行比较。如果不同方法得到的结果一致，则说明实验结 果是可靠的。
统计学分析
通过统计学分析，可以评估实验结果的可靠性和准确性。 例如，可以采用方差分析、回归分析和相关系数等方法对 实验结果进行统计分析。
总结词
通过观察分离出的血清蛋白条带，可以了解蛋白质的种类和数量。
详细描述
在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，可以清晰地看到不同分子量和电荷的蛋白质被分离成不同的条带。根据条带的亮 度、清晰度和数量，可以初步判断血清中蛋白质的种类和数量。
异常蛋白条带的解读
总结词
异常蛋白条带的出现可能提示某些疾病或生理变化。
血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳
目录
CONTENTS
• 介绍 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果解读 • 实验注意事项
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于分子的电荷与分子的质量之间的相互作用，通过电场驱动，将蛋白质样品分离成不同的带状条带。
该方法的工作原理可分为以下几个步骤：
1. 样品制备：将待分离的蛋白质样品与sds（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质样品在含有还原剂的缓冲液中发生变性并且呈带负电荷的复合物。
2. 样品加载：将样品加载到预制的聚丙烯酰胺凝胶槽中的样品孔中。
通过上下两个电极施加电压使样品向凝胶孔移动。
3. 分离：当电压施加后，带电的蛋白质复合物将根据其质量和电荷大小在凝胶中移动。
较小的蛋白质在电场作用下通过凝胶孔移动更快，而较大的蛋白质移动较慢。
4. 染色：在分离完成后，经过染色处理使分离出的蛋白质带呈现出可视化的条带。
常用的染色方法包括银染、共染和荧光染色等。
通过观察得到的条带模式，可以确定蛋白质的分子质量和其含量。
这种方法比较简单、经济且广泛应用于蛋白质研究领域。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
下面是sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤：
1.准备凝胶溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合，加入去离
子水并搅拌直至溶解。
加入TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸铵，混合均匀。
2.制作玻璃板：清洗两个玻璃板，加入适量凝胶溶液，用玻璃板
夹夹住，形成模具。
等待凝胶聚合。
3.准备电泳缓冲液：混合Tris 和甘氨酸，调整pH值。
4.准备样品：将蛋白质样品与loading buffer混合，煮沸3-5
分钟。
5.上样：将样品加入凝胶顶部，用移液枪或者吸管将样品加入凝
胶的梳子底部。
6.电泳：接通电源，调节电压和电流，进行电泳。
7.转膜：将凝胶和膜一起放入电转仪中，加入Tris甘氨酸电泳
缓冲液，接通电源，进行转膜。
8.染色：将膜放入染色液中染色，用保鲜膜将染色液表面覆盖，
轻轻摇动，直至膜完全染色。
9.洗脱：将膜从染色液中取出，用去离子水洗脱。
10.分析结果：观察膜的条带，进行数据分析。
以上是基本的聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。
需要注意的是，实验操作中需要注意安全，避免对身体有害的试剂。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
该方法利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过电场作用将带电的蛋白质分子在凝胶中移动分离。
其原理可以分为三个步骤：样品加载、电泳分离和染色/检测。
首先，将待测样品经过加热变性处理，使蛋白质变性并带有负电荷，然后将其加载到聚丙烯酰胺凝胶的凝胶孔中。
加载完成后，施加电场使带负电荷的蛋白质沿着凝胶孔向正极移动。
由于蛋白质分子的大小和形状不同，它们在凝胶中的移动速度也不同，从而实现了蛋白质的分离。
接下来，电泳分离的时间和电场强度可以根据需要进行调节，以实现较好的分离效果。
一般情况下，较小的蛋白质分子会更快地向阳极移动，而较大的蛋白质分子移动较慢。
根据蛋白质在凝胶中的迁移距离，可以用来判断蛋白质的相对分子质量。
最后，对分离完成的蛋白质进行染色或检测。
常用的染色方法包括银染法和脱氧核糖核酸( DNA )染料染色法，这些方法可
以使蛋白质在凝胶上形成可见的条带。
另外，还可以使用荧光标记的蛋白质或特定的抗体进行免疫检测，以获得更具体的信息。
综上所述，聚丙烯酰胺凝胶电泳利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过电场作用将带电的蛋白质在凝胶中移动分离，并通过染色或检测方法来获取蛋白质的分离结果。
这种方法具有简
单、快速和可重复性好的特点，被广泛应用于生物化学和分子生物学领域的蛋白质研究中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。
若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。
同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。
其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。
这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。
需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。
因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析聚丙烯酰胺凝胶电泳实验是一种分离和分析生物分子的方法，它可以通过电场使不同分子质量的DNA、RNA和蛋白质在物理性质相近的聚丙烯酰胺凝胶中移动，从而实现它们的分离和检测。
本文将就聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的理论、实验步骤、结果分析以及实验存在的问题进行详细的讲述。
一、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳实验主要是通过电场作用，将DNA、RNA和蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中分离并判断分子的大小。
其中聚丙烯酰胺凝胶是一种网状物质，它有很强的吸水性和渗透性，因此可以将生物分子填充其中。
当聚丙烯酰胺凝胶通过电场作用列成微观孔隙时，各种生物分子会在微孔内移动，根据分子的质量和大小，会在不同位置形成不同的电泳带。
在实验中，首先需要制备聚丙烯酰胺凝胶，然后将待测试的样品加入凝胶溶液中均匀混合，再将其注入电泳槽中，加入电解液并通电，通过电泳将被检测的生物分子分离后，用染色剂在凝胶上染色并观察其带型。
二、实验步骤1. 制备聚丙烯酰胺凝胶a. 测量所需聚丙烯酰胺的质量，按照重量比例混合罗丹明B缓冲液和甲醛b. 加入半加固剂后，在模板两边运用吸管将混合液吸入模板内，并加入宽度相等的橡皮垫c. 在上方加入半加固剂，使其混合，并等待其凝固，最后取下橡皮垫，去除凝胶。
2. 样品荧光标记a. 将测试样品制备好b. 将样品添加荧光染料，进行反应后用同样的染料标记分子质量标准。
3. 准备电泳槽a. 连接电源和电极，注入电解液b. 将制备好的聚丙烯酰胺凝胶放入槽中。
4. 进行电泳操作a. 分别添加样品和分子质量标准至凝胶中b. 通过电泳，将生物分子在凝胶中分离和定位c. 取下凝胶并对凝胶染色d. 进行显带，将电泳带进行图像捕捉5. 结果分析a. 在凝胶上观察带型b. 分离它们以确定大小及数量c. 分别进行其电泳常数的测定三、结果分析根据上述的实验步骤，在实验中我们可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，将DNA、RNA 和蛋白质分子分离，并判断分子的大小及数量。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯醯氨凝膠電泳作用原理聚丙烯醯胺凝膠電泳是網狀結構,具有分子篩效應,它有兩種形式,一種是非變性聚丙烯醯胺凝膠,蛋白質在電泳中保持完整的狀態,蛋白在其中依三種因素分開:蛋白大小,形狀和電荷:而SDS-PAGE僅根據蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白:這個技術首先是1967年由shapiro建立,他們發現在樣品介質和丙烯醯胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑後,蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視: SDS是陰離子去污劑,作為變性劑和助溶試劑,它能斷裂分子內和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白分子的二,三級結構:而強還原劑如巰基乙醇,二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂:在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS後,分子被解聚成多肽鏈,解聚後的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束,所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量,這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異: SDS-PAGE一般採用的是不連續緩衝系統,於連續緩衝系統相比,能夠有較高的解析度:濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶:當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩衝液,電極液選TRIS/甘氨酸:電泳開始後,HCL解離成氯離子, 甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子:蛋白質帶負電荷,因此一起向正極移動,其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中:電泳開始時氯離子泳動率最大,超過蛋白,因此在後面形成低電導區,而電場強度與低電導區成反比,因而產生較高的電場強度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動,形成以穩定的介面,使蛋白聚集在移動介面附近,濃縮成一中間層:SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳原理採用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE,polyacrylamide gel electrophoresis)方法可對蛋白質的組分進行分離,並可精確測得蛋白質的分子量:常用的方法為SDS-PAGE不連續系統:基本原理:聚丙稀醯胺是由丙稀醯胺(acrylamide)和N,N’-亞甲基雙丙稀醯胺(N,N’-methylene bis acrylamide)經共聚合而成:此聚合過程是由四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)和過硫酸胺(ammonium persulfate,AP)激發的:被啟動的單體和未被啟動的單體開始了多聚鏈的延伸,正在延伸的多聚鏈也可以隨機地接上雙丙稀醯胺,使多聚鏈交叉互連成為網狀立體結構,最終多聚鏈聚合成凝膠狀:丙烯醯胺是一種白色晶體化學物質,是生產聚丙烯醯胺的原料:聚丙烯醯胺主要用於水的淨化處理,紙漿的加工及管道的內塗層等:澱粉類食品在高溫( 120?)烹調下容易產生丙烯醯胺:研究表明,人體可通過消化道,呼吸道,皮膚黏膜等多種途徑接觸丙烯醯胺,飲水是其中的一條重要接觸途徑:丙烯醯胺進入體內又可通過多種途徑被人體吸收,其中經消化道吸收最快:進入人體內的丙烯醯胺約90%被代謝,僅少量以原形經尿液排出:丙烯醯胺進入體內後,會在體內與DNA上的鳥嘌呤結合形成加合物,導致遺傳物質損傷和基因突變: 對接觸丙烯醯胺的職業人群和偶然暴露於丙烯醯胺人群的調查表明,丙烯醯胺具有神經毒性作用,但目前還沒有充足的證據表明通過食物攝入丙烯醯胺與人類某種腫瘤的發生有明顯關係:丙烯醯胺簡介別名AM;純品為白色結晶固體,易溶于水,甲丙烯醯胺是一種有機化合物,醇,乙醇,丙醇,稍溶於乙酸乙酯,氯仿,微溶於苯,在酸堿環境中可水解成丙烯酸:職業性接觸主要見於丙烯醯胺生產和樹脂,黏合劑等的合成,在地下建築,改良土壤,油漆,造紙及服裝加工等行業也有接觸機會:日常生活中,丙烯醯胺可見於吸煙,經高溫加工處理的澱粉食品及飲用水中:N.N-亞甲基雙丙烯醯胺,別名MBA,雙叫N.N-甲叉雙丙烯醯胺,次甲基雙丙烯醯胺,N.N-甲撐雙丙烯醯胺:是一種白色晶體粉末,無味,吸濕性極小:遇高溫或強光則自交聯,微溶于水,乙醇:丙烯醯胺單體和交聯劑N1 N′-亞甲基雙丙烯醯胺在催化劑的作用下聚合成含有醯胺基側鏈的脂肪族長鏈:相鄰的兩個鏈通過亞甲基橋交聯起來就形成三維網狀結構的聚丙烯醯胺凝膠:N, N -亞甲基雙丙烯醯胺又名甲撐雙丙烯醯胺 , 英文縮寫名 MBA, 為白色或淺黃色粉末狀結晶 , 毒性低 , 對皮膚無刺激 , 無神經毒性 , 溶于水及乙醇,丙酮等有機溶劑:在它的結構中具有兩個相同且非常活潑的反應性官能團 , 可作為交聯劑 ,能將線性高分子迅速轉變為體型高分子 , 製備吸水性聚合物 , 還可與各種離子型單體發生聚合反應 ,使其在石油開採以及醫藥,水處理等行業具有廣泛用途: 產品簡介:TEMED即N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine,中文名為N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺:分子式為(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2, 分子量為116.20: 進口分裝,用於配製PAGE膠等:TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯醯胺與雙丙烯醯胺的聚合:加入加速劑TEMED後聚合馬上開始,應立即將凝膠混勻,迅速灌膠: 保存條件: 4?保存:注意事項:易燃,有腐蝕性,請注意防護:為了您的安全和健康,請穿實驗服並戴一次性手套操作:過硫酸銨分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20性狀:過硫酸銨是一種白色,無味晶體,常作強氧化劑使用,也可用作單體聚合引發劑:它幾乎不吸潮,由於能達到很高的純度而具有特別好的穩定性,便於儲存:另外,它還具有使用方便,安全等優點:儲存及使用注意事項:過硫酸銨屬於非易燃品,但由於能釋放氧而有助燃作用,因此必頇在一定條件下儲存:首先必頇存放在乾燥,密閉的容器中,其次應避免陽光直射,熱源,潮濕等不利因素:另外,一些雜質如髒物,鐵銹,少量金屬以及還原劑可能引起過硫酸銨的分解,在存放和使用過程中也必頇注意:由於潮濕的過硫酸銨粉末及其水溶液有漂白和輕微的腐蝕作用,因此使用過程中應避免眼睛,皮膚和衣物直接與其接觸: 過硫酸銨的應用:過硫酸銨提供驅動丙烯醯胺和雙丙烯醯胺聚合所必需的自由基:頇新鮮配製:過硫酸銨是乳膠或丙烯酸單體聚合液,醋酸乙烯,氯乙烯等產品的引發劑,同時也是苯乙烯,丙烯腈,丁二烯等膠體發生共聚作用的引發劑: 過硫酸銨-TEMED(四甲基乙二胺)系統 :在Acr 和Bis的溶液中放入這個催化系統後,過硫酸銨[(NH4)2S2O8]產生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態,從而發生聚合作用:聚合的初速度和過硫酸銨濃度的平方根成正比:這種催化系統需要在鹼性條件下進行:例如,在pH 8.8條件下7%的丙烯醯胺溶液30分鐘就能聚合完畢;在 pH 4.3時聚合很慢,要90分鐘才能完成:溫度與聚合的快慢成正比:通常在室溫下就很快聚合,溫度升高聚合更快:如將混合後的凝膠溶液放在近0?的地方,就能延緩聚合:一般來講,溫度過低,有氧分子或不純物質存在時都能延緩凝膠的聚合:為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合,在聚合前頇將溶液分別抽氣,然後再混合:十二烷基硫酸鈉 SDS不連續系統由上層濃縮膠和下層的分離膠組成:濃縮膠(pH6.7,孔徑大)主要作用是使樣品濃縮,使樣品在未進入分離膠前,被濃縮成很窄的條帶,從而提高分離效果:分離膠(pH8.9,孔徑小)通過分子篩效應和電荷效應,把樣品中的各組分按分子量和電荷的大小而分開: 如果要利用凝膠電泳測定某一蛋白質的分子量就必頇將電荷效應去掉或減少到可以忽略不計的程度,使蛋白質泳動率的大小完全取決於分子量:如何去除電荷效應呢?現常用的是十二烷基硫酸鈉(SDS):SDS是一種陰離子去污劑:在電泳體系中加入一定濃度的SDS,SDS以一定的比例和蛋使蛋白質分子帶負電荷,這種負電荷遠遠超過了蛋白質白質分子結合成複合物, 分子原有的電荷,從而減低或消除了各種蛋白質分子天然電荷的差異:SDS是陰離子型表面活性劑,它能按一定比例與蛋白質分子結合成帶負電荷的複合物,再與PAGE技術結合,則譜帶差異更加明顯,清晰,並可測定蛋白質分子量: SDS-PAGE只是按照分子大小分離的,而不是根據分子所帶的電荷和大小分離的: SDS帶有大量負電荷,當其與蛋白質結合時,所帶的負電荷大大超過了蛋白質原有的負電荷,因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異,使蛋白質均帶有相同密度的負電荷,因而可利用Mr差異將各種蛋白質分開:甘氨酸最廣泛使用的不連續緩衝系統最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 設計的, 樣品和濃縮膠中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽緩衝液含Tris-甘氨酸(pH8.3), 分離膠中含Tris-HCl(pH 8.8):系統中所有組分都含有0.1% 的SDS(Laemmli, 1970):樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動介面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界,在移動介面的兩邊界之間是一電導較低而電位滴度較陡的區域, 它推動樣品中的蛋白質前移並在分離膠前沿積聚:此處pH值較高, 有利於甘氨酸的離子化,所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質並緊隨氯離子之後,沿分離膠泳動:從移動介面中解脫後,SDS-蛋白質複合物成一電位和pH值均勻的區帶泳動穿過分離膠,並被篩分而依各自的大小得到分離:濃縮效應:凝膠由兩種不同的凝膠層組成:上層為濃縮膠,下層為分離膠:濃縮膠為大孔膠,緩衝液pH6.7,分離膠為小孔膠,緩衝液pH8.9:在上下電泳槽內充以Tris—甘氨酸緩衝液(pH8.3),這樣便形成了凝膠孔徑和緩衝液pH值的不連續性:在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl-,但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-:蛋白質的等電點一般在pH5左右,在此條件下其解離度在HCl和甘氨酸之間:當電泳系統通電後,這3種離子同向陽極移動:其有效泳動率依次為Cl->蛋白質>H2NCH2COO-,故C1-稱為快離子,而Gly- 稱為慢離子:電泳開始後,快離子在前,在它後面形成離子濃度低的區域即低電導區:電導與電壓梯度成反比,所以低電導區有較高的電壓梯度:這種高電壓梯度使蛋白質和慢離子在快離子後面加速移動:在快離子和慢離子之間形成—個穩定而不斷向陽極移動的介面:由於蛋白質的有效移動率恰好介於快慢離子之間,因此蛋白質離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成—條狹窄帶:這種濃縮效應可使蛋白質濃縮數百倍: 不連續聚丙烯醯胺凝膠電泳基本原理:不連續聚丙烯醯胺凝膠電泳包含了兩種以上的緩衝液成分,pH值和凝膠孔徑,而且在電泳過程中形成的電位梯度亦不均勻:由此產生的濃縮效應,電荷效應和分子篩效應:1.濃縮效應樣品在電泳開始時,通過濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層(一般能濃縮幾百倍),然後再被分離:當通電後,在樣品膠和濃縮膠中,解離度最大的Cl—有效遷移率最大,被稱為快離子,解離度次之的蛋白質則尾隨其後,解離度最小的甘氨酸離子(PI=6.0)泳動速度最慢,被稱為慢離子:由於快離子的迅速移動,在其後邊形成了低離子濃度區域,即低電導區:電導與電勢梯度成反比,因而可產生較高的電勢梯度:這種高電勢梯度使蛋白質和慢離子在快離子後面加速移動:因而在高電勢梯度和低電勢梯度之間形成一個迅速移動的介面,由於樣品中蛋白質的有效遷移率恰好介於快,慢離子之間,所以,也就聚集在這個移動的介面附近,逐漸被濃縮,在到達小孔徑的分離膠時,已形成一薄層:2.電荷效應當各種離子進入pH8.9的小孔徑分離膠後,甘氨酸離子的電泳遷移率很快超過蛋白質,高電勢梯度也隨之消失,在均一電勢梯度和pH的分離膠中,由於各種蛋白質的等電點不同,所帶電荷量不同,在電場中所受引力亦不同,經過一定時間電泳,各種蛋白質就以一定順序排列成一條條蛋白質區帶:3.分子篩效應由於分離膠的孔徑較小,分子量大小或分子形狀不同的蛋白質通過分離膠時,所受阻滯的程度不同,因而;遷移率不同而被分離:此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時,受阻滯的程度不同,小分子走在前面,大分子走在後面,各種蛋白質按分子大小順序排列成相應的區帶:[毒性]丙烯醯胺屬中等毒類,對眼睛和皮膚有一定的刺激作用,可經皮膚,呼吸道和消化道吸收,在體內有蓄積作用,主要影響神經系統,急性中毒十分罕見:密切大量接觸可出現亞急性中毒,中毒者表現為嗜睡,小腦功能障礙以及感覺運動型多發性周圍神經病:長期低濃度接觸可引起慢性中毒,中毒者出現頭痛,頭手掌,足心暈,疲勞,嗜睡,手指刺痛,麻木感,還可伴有兩手掌發紅,脫屑,多汗,進一步發展可出現四肢無力,肌肉疼痛以及小腦功能障礙等: 丙烯醯胺慢性毒性作用最引人關注的是它的致癌性:丙烯醯胺具有致突變作用,可引起哺乳動物體細胞和生殖細胞的基因突變和染色體異常:動物試驗研究發現,丙烯醯胺可致大鼠多種器官腫瘤,如乳腺,甲狀腺,睾丸,腎上腺,中樞神經,口腔,子宮,腦下垂體腫瘤等:但目前還沒有充足的人群流行病學證據表明,食物攝入丙烯醯胺與人類某種腫瘤的發生有明顯相關性:國際癌症研究機構(IARC)對其致癌性進行了評價,將丙烯醯胺列為2類致癌物(2A),即人類可能致癌物:其主要依據為,丙烯醯胺在動物和人體均可代謝轉化為致癌活性代謝產物環氧丙醯胺:緩衝液在電泳過程中的一個作用是維持合適的pH:電泳時正極與負極都會發生電解反應,正極發生的是氧化反應(4OH--4e->2H2O+O2),負極發生的是還原反應(4H++4e->2H2),長時間的電泳將使正極變酸,負極變堿:一個好的緩衝系統應有較強的緩衝能力,是溶液兩極的pH保持基本不變:電泳緩衝液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性,以利於DNA分子的遷移,例如,一般電泳緩衝液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子,Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢;太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化:。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE实验原理和操作步骤
S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳S D S P A G E实验原理和操作步骤The pony was revised in January 2021SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理及步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。
原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。
用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。
在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。
因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。
SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。
但在具有自由基团体系时，它们聚合。
引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。
在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。
TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。
这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
1.清洗电泳仪和电泳板。
2.准备实验用液，将需要的磷酸缓冲液和聚丙烯酰胺溶液以及添加的阳离子
表面活性剂混合均匀。
3.调节电泳仪的温度、电压、时间等参数。
4.垂直安装电泳板，将电泳板安装在电泳支架中，保证其处于垂直位置。
5.将溶液添加到电泳板，并将电泳板放入电泳仪中进行实验，注意实验过程
中溶液的变化，以便及时调节电泳仪参数。
6.实验完毕后取出电泳板，用纸巾擦拭干净，重复上述实验步骤，直至所有
实验完毕。
7.染色及脱色，电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染
色1小时以上。
染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。
置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。
此时改用7%醋酸充装在液槽中。
通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。
在我们的试验中省略的染料泳向正极。
脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。
3-4小时脱色完毕。
有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
上海交通大学医学院
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
上海交通大学医学院
分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔 径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
上海交通大学医学院
2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极
移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解 离度（）很小，有效迁移率（M ）很低， 移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大， 移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介 于两者之间。
T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小 的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大 的物质。
上海交通大学医学院
交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
上海交通大学医学院
讲课内容
（一）化学聚合：AP-TEMED系统
过硫酸胺 [(NH4)2S2O8] （Ammonium persulfate，AP）作为 催化剂，四甲基乙二胺 （-N,N,N',N'tetramethylethylene diamine , TEMED）为 加速剂。
上海交通大学医学院
AP在水溶液中能产生游离基SO42-.，使丙烯 酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙 烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合 形成凝胶
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓 度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合 适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性
＜10 很脆，易碎，不透明 ＞100 糊状不成形，易破碎
上海交通大学医学院
凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。
Acr + Bis----- porous matrix
上海交通大学医学院
❖ （1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式
上海交通大学医学院
（2）亚甲双丙烯酰胺
（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
讲课内容
上海交通大学医学院
小
结
1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合
上海交通大学医学院
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
上海交通大学医学院
分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚 合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔 径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
上海交通大学医学院
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
上海交通大学医学院
三、PAG的浓度与孔径的关系
the initial concentrations of acrylamide and BIS control the hardness and degree of crosslinking of the gel.
上海交通大学医学院
pH8.3 Tris-Glycine buffer
样品
样品胶 低
甘氨酸
电 导
浓缩胶
蛋白质
区
HCl
分离胶
上海交通大学医学院
3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其有
效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值 有所区别。
上海交通大学医学院
3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据
各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分 离
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
Load a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
上海交通大学医学院
五、PAGE 的 特 点
1.具有分子筛效应，分辨率高 2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲 水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明 6.网孔可调节
Schematic of discontinous electrophoresis technique
上海交通大学医学院
Disc-PAGE
电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
成分
作用
样品 胶
T=3% C=20%单体 欲分离的样品溶液
pH6.7 Tris-HCl缓冲液
混在一起，用光聚合方法聚 合而成的大孔凝胶
TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条
件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝
氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
上海交通大学医学院
（二）光聚合：核黄素-TEMED系统
有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照 下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成 无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游 离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意：
一、PAG 的 组成
PAG 是 由 丙 烯 酰 胺 （ acrylamide，Acr） 单 体 和 N，N’- 亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 （ N，N，N’，N’methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自 由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网 状结构。
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
上海交通大学医学院
二、PAG的聚合 polymerization of PAG
需要催化剂(catalyzer)——氧化还原系 统作用，使Acr单体带有游离基(Free radicals )，从而与Bis进行聚合
上海交通大学医学院
有防对流作用
上海交通大学医学院
Disc-PAGE
成分
作用
浓 缩 除不加样品外，其余组成成 样品在此胶中
胶 分同样品胶相同
被浓缩
上海交通大学医学院
Disc-PAGE
成分
作用
分离 胶
T=7%C=2.5%单体溶液 pH8.9 Tris-HCl缓冲液 化学聚合法聚合成小孔胶
主要的电泳分离 部分
上海交通大学医学院
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE5PAGE来自特点上海交通大学医学院
四、不 连 续 PAGE (Discontinuous PAGE)
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 continuous PAGE discontinuous PAGE
上海交通大学医学院
聚丙烯酰胺凝胶电泳
Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，
P李A莉GE
/
小
结
1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合
上海交通大学医学院